李洋 高曉蓉 張健

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024）

草酸青霉菌生產(chǎn)纖維素酶的反應(yīng)條件優(yōu)化

李洋 高曉蓉 張健

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024）

纖維素酶在生物能源、紡織、飼料和造紙工業(yè)等具有重要作用，篩選高效微生物生產(chǎn)菌株，優(yōu)化最佳產(chǎn)酶工藝，是獲得該產(chǎn)品的有效途徑。從含有落葉腐木和腐爛秸稈的土壤中篩選出一株高效纖維素降解菌，采用形態(tài)學(xué)觀察及核糖體保守序列分析確定該菌株分類地位，對(duì)菌株最適發(fā)酵初始pH、最適碳源、氮源及不同表面活性劑選擇添加進(jìn)行最佳產(chǎn)酶條件優(yōu)化。形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS（Internal Transcribesd Spacer）基因序列系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析確定分離的菌株其為草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum JG。該菌株以初始pH2.0-3.0，CMC-Na為碳源，豆粉為氮源時(shí)，產(chǎn)纖維素酶能力達(dá)到最大。不同表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)酶影響的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源廣泛、價(jià)格相對(duì)較低廉的卵磷脂對(duì)草酸青霉菌具有明顯的產(chǎn)酶促進(jìn)作用，發(fā)酵液中濾紙酶（FPA）、β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶（BGL）活力分別提高72.9%、20.8%和33.6%。草酸青霉菌JG可在酸性初始條件下發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合纖維素酶，卵磷脂可明顯提高其產(chǎn)酶活性。

草酸青霉菌；纖維素酶；卵磷脂；條件優(yōu)化

每年植物通過光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)約7.2 ×1010t，如此大量的生物質(zhì)可以為人類的可持續(xù)發(fā)展提供豐富的再生能源［1］。但是由于結(jié)構(gòu)的特殊性，木質(zhì)纖維素的利用一直受到限制［2］。微生物生產(chǎn)的纖維素酶能夠把纖維素降解成小分子糖，進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)能源類物質(zhì)［3，4］。目前工業(yè)上用于纖維素酶生產(chǎn)的菌種主要是各種真菌，包括木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）等［5］，但不同菌株的最佳產(chǎn)酶條件和促進(jìn)劑作用多有不同，每種菌株所產(chǎn)纖維素酶若不能發(fā)揮其全部潛能，將嚴(yán)重影響纖維素酶的降解效率［6，7］。本實(shí)驗(yàn)從腐殖土壤樣品中分離一株產(chǎn)纖維素酶降解菌，通過對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化和產(chǎn)酶組成分析，旨為纖維素酶菌株的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 實(shí)驗(yàn)樣品采自大連市不同地區(qū)20個(gè)含有腐木、腐爛秸稈的土樣及牛糞等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 化學(xué)試劑均為分析純。引物合成及DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基組分 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：CMCNa 10 g，（NH4）2SO44 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂16 g，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

纖維素剛果紅鑒別培養(yǎng)基（參照文獻(xiàn)［8］稍有改進(jìn)）：（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，微晶纖維素 2.0 g，剛果紅0.4 g，瓊脂 20 g，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

濾紙液體培養(yǎng)基：濾紙 0.5 g，（NH4）2SO420.0 g，尿素 3.0 g，蛋白胨 3.0 g，CaCl23.0 g，MgSO4·7H2O 5.0 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 50.0 mg，MnSO4·7H2O 16.0 mg，ZnSO4·7H2O 14.0 mg，COCl220.0 mg，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮 30 g，（NH4）2SO43.0 g，KH2PO42.0 g，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 每份土樣10.0 g，加入無菌水，28℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h 后，取上清液。采取梯度稀釋法，按照10-1-10-8濃度分別涂布于羧甲基纖維素篩選培養(yǎng)基上，30℃暗培養(yǎng)3 d。挑取長勢好的菌株轉(zhuǎn)接到剛果紅培養(yǎng)基，挑選顯示有透明圈的菌株接入PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行純化［9］。純化3代后，接入濾紙液體培養(yǎng)基，30℃，180 r/min 震蕩培養(yǎng)7 d，測試濾紙崩解率［10］。

濾紙崩解率（%）=（發(fā)酵前的濾紙條重量-發(fā)酵后的濾紙條的重量）/ 發(fā)酵前的濾紙條重量×100%

1.2.2 菌株的鑒定 形態(tài)、培養(yǎng)和生理生化特征鑒定參照《真菌鑒定手冊》進(jìn)行。

DNA提取采用Sangon真菌提取試劑盒。以提取的基因組DNA為模板，真菌通用引物ITS1：（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4：（5'-TCCTCGCCTTATTGATATGC-3'）［11］為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物測序由Songon 公司完成。測序結(jié)果應(yīng)用MEGA5.0 軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［12］。

1.2.3 纖維素酶酶活力測定和定義 分別以1%（W/V）羧甲基纖維素鈉、50 mg（1 cm×6 cm）新華濾紙、0.5%水楊苷為底物，在50℃下分別反應(yīng)60 min、30 min 和30 min，在540 nm 紫外波長下，用DNS法測定濾紙酶（FPA）、β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）、β-糖苷酶（BGL）［13］酶活。

酶活定義：在50℃條件下，相應(yīng)底物在酶的作用下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol 葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位，用 IU/mL表示［14］。

1.2.4 菌株初始pH、碳源、氮源及金屬離子的確定 將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，測定不同pH條件下菌株產(chǎn)酶活性。分別用麩皮、濾紙、CMC-Na、玉米粉代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源，用豆粉、硫酸銨、尿素、酵母粉、蛋白胨代替氮源，添加不同種類金屬離子，30℃，180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)144 h，測定不同碳、氮源及金屬離子對(duì)菌株酶活的影響［15］。

1.2.5 不同種類表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)酶影響 在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中分別加入EDTA二鈉、SDS、PEG、鼠李糖脂及卵磷脂，30℃，180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)144 h，測定不同表面活性劑對(duì)菌株JG產(chǎn)酶的影響［16，17］。

1.2.6 纖維素酶SDS-PAGE分析 菌株JG在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)144 h，粗酶液經(jīng)40%乙醇沉淀、濃縮后， 上樣于15%的分離膠和5%的濃縮膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以標(biāo)準(zhǔn)纖維素酶（上海Songon公司）及商品化酸性纖維素酶（山東龍?jiān)锕こ逃邢薰臼称诽砑?、紡織用工業(yè)酸性纖維素酶）作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選

選取CMC-Na培養(yǎng)基上長勢良好的10個(gè)菌株，分離純化后分別命名為Y-1、JG-1、TNL-1、TNL-2、XTNL-1、HTNL-2、WHXTNL、LZ、JG-2和VI。從菌落生長形態(tài)判斷Y-1和VI為放線菌；TNL-1和TNL-2為細(xì)菌；JG、XTNL-1、HTNL-2、WHXTNL、LZ和JG為真菌。進(jìn)一步測試各菌株對(duì)濾紙崩解程度發(fā)現(xiàn)，JG濾紙崩解率最高，為19.7%。圖1為JG在剛果紅鑒別培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈及其在PDA培養(yǎng)基上生長5 d的形態(tài)，可以看出菌落呈明顯青綠色，表面為粉粒狀，初步確定JG為真菌。液體培養(yǎng)結(jié)果測得，JG的CMCase酶活性為 0.435 IU/mL，明顯高于其他菌株，故選擇JG進(jìn)一步研究。

圖1 菌株JG形態(tài)特征

2.2 菌株ITS序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增獲得的序列長度為564 bp，GenBank序列登錄號(hào)為KC880081.1，與Penicillium oxalicum strain QHBC11相似性最大，為99%，初步確定該菌株為一株草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum JG（圖2）。

圖2 菌株JG基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶影響

培養(yǎng)基發(fā)酵初始pH值對(duì)菌株JG產(chǎn)酶活性影響結(jié)果（圖3）表明，菌株以麩皮為底物，初始pH在2.0-3.0時(shí)，所產(chǎn)纖維素總的酶活性最高，當(dāng)初始pH＞5.0時(shí)，酶活開始明顯下降。在發(fā)酵過程中還發(fā)現(xiàn)，4.0時(shí)該菌產(chǎn)酶最適pH值。

圖3 不同初始發(fā)酵的pH值對(duì)纖維素酶活影響

2.4 不同碳源對(duì)纖維素酶活的影響

發(fā)酵初始pH2.5條件下，菌株JG在以CMC-Na和麩皮為底物時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的CMCase和BGL均表現(xiàn)出較高的酶活力（表1），外切纖維素酶活也明顯高于其他種類的碳源（表中未列出），但是以CMC-Na為碳源的FPA略低于以麩皮為碳源時(shí)的活力。通常情況下，CMCase作為水解纖維素聚合鏈的第一步反應(yīng)酶，其活力大小起著重要作用，故選取CMCase酶活表現(xiàn)較高的CMC-Na作為JG發(fā)酵培養(yǎng)的最適碳源。

表1 不同碳源對(duì)纖維素酶活的影響

2.5 不同氮源對(duì)菌株纖維素酶活的影響

在發(fā)酵初始pH2.5，碳源為CMC-Na的條件下優(yōu)化氮源的結(jié)果（表2）顯示，豆粉作為有機(jī)氮源更容易被菌株利用，且對(duì)提高菌株酶活力有明顯的促進(jìn)作用。故選擇豆粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源。

表2 不同氮源對(duì)纖維素酶活的影響

2.6 不同金屬離子對(duì)菌株纖維素酶活的影響

金屬離子通常作為酶的活性中心的組成部分，對(duì)調(diào)節(jié)維持微生物細(xì)胞滲透壓以及維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要的作用。在培養(yǎng)基中分別加入Na+、Mg2+、Ca2+、K+和Fe3+，測定不同金屬離子對(duì)菌株發(fā)酵酶活的影響，結(jié)果（表3）顯示，金屬離子對(duì)纖維素酶活的影響相對(duì)較小，但是K+對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用。因此，在菌株發(fā)酵過程中可以添加少量的K+作為促進(jìn)劑。

表3 不同金屬離子對(duì)纖維素酶活的影響

2.7 添加表面活性劑對(duì)纖維素酶活力的影響

絡(luò)合劑EDTA二鈉和陰離子表面活性劑SDS，對(duì)菌株JG產(chǎn)生FPA、CMCase、BGL三種酶活性均有明顯的抑制作用（圖4）。PEG、卵磷脂和鼠李糖脂都是非離子表面活性劑，它們對(duì)JG產(chǎn)生的纖維素酶活性卻有一定的促進(jìn)作用，其中PEG促進(jìn)作用較小，并且對(duì)CMCase、BGL酶活性的產(chǎn)生抑制作用，但能提高FPA酶活性；而鼠李糖脂和卵磷脂卻有明顯的促進(jìn)作用。但是鼠李糖脂價(jià)格較高，將增加工業(yè)應(yīng)用的生產(chǎn)成本，相比之下，卵磷脂價(jià)格低廉、材料易得且無污染，更易成為首選。本實(shí)驗(yàn)中添加卵磷脂后，菌株JG所產(chǎn)的FPA、CMCase、BGL酶活性分別提高了72.9%、20.8%、33.6%，與添加鼠李糖脂的效果相同，故選擇卵磷脂作為JG發(fā)酵產(chǎn)酶的最適表面活性劑。

2.8 菌株JG產(chǎn)酶SDS-PAGE分析

將優(yōu)化后菌株JG所產(chǎn)的纖維素酶組分進(jìn)行了分析，結(jié)果（圖5）顯示，超濾后的3個(gè)目標(biāo)蛋白大小約為55、37 和33 kD。發(fā)酵產(chǎn)物蛋白的譜型與商品酸性纖維素酶譜比較相近，具體成分有待進(jìn)一步分離純化后分析。

圖4 不同種類表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)酶影響

圖5 纖維素酶SDS-PAGE分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從含有腐爛樹葉和秸稈的土壤中篩選到一株纖維素降解菌，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為草酸青霉菌，命名Penicillium oxalicum JG。近幾年，對(duì)于草酸青霉菌產(chǎn)纖維素酶能力的研究比較集中，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)張名愛等［18，19］證明了分離出的鵝源草酸青霉（Penicillium oxalicum Currie&Thom）F67，具有產(chǎn)纖維素酶、果膠酶及溶磷等特性，并已有廣泛的應(yīng)用。楊友坤等［20］從牛糞堆肥樣品中篩選出一株草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum F12，具有較強(qiáng)的纖維素降解能力，在高纖維類物質(zhì)堆肥過程中有著較大的應(yīng)用潛力。王洪媛等［21］從土壤中篩選到一株降解能力較強(qiáng)的草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum 98MJ，其對(duì)半纖維素、纖維素及木質(zhì)素都有較好的降解效果，是一株具有開發(fā)潛力的纖維素酶生產(chǎn)菌株。本研究通過對(duì)篩選獲得的草酸青霉菌JG進(jìn)行產(chǎn)酶單因素優(yōu)化，確定初始pH值為2.0-3.0，CMC-Na和豆粉為最優(yōu)產(chǎn)酶條件。張蔚等［22］所篩選的草酸青霉菌在初始pH值7.0，以 4%麩皮和0.2%牛肉膏為最適產(chǎn)酶底物。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，添加K+對(duì)菌株產(chǎn)酶具有一定的促進(jìn)作用，但是效果并不明顯。

菌株JG的最適初始發(fā)酵pH為2.0左右，發(fā)酵過程中pH值維持在4.0左右。穆春雷等［23］曾經(jīng)篩選出一株草酸青霉菌M11（Penicillium oxalicum M11），該菌株在初始pH為6.5，發(fā)酵過程中pH值為5.0時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到最適。耿麗萍等［24］對(duì)草酸青霉菌HB1的產(chǎn)酶條件優(yōu)化后指出其菌株最適初始pH為4.0-7.0之間，發(fā)酵pH為7.0時(shí)，酶活力最旺盛。由此可知，本研究獲得的草酸青霉菌JG為具備較強(qiáng)耐酸性的產(chǎn)纖維素酶菌株，其原因可能與草酸青霉菌代謝產(chǎn)酸有關(guān)。當(dāng)工業(yè)上對(duì)纖維素類物質(zhì)的處理采用酸時(shí)，該菌可以表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸性，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

表面活性劑由于結(jié)構(gòu)的特殊性，具有改變酶作用微環(huán)境的功能。劉佳等［25］研究了吐溫-80和鼠李糖脂對(duì)綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的影響，發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂促進(jìn)產(chǎn)酶效果明顯高于吐溫-80。卵磷脂作為兩性離子表面活性劑，在酸性環(huán)境中，呈陽離子表面活性劑的性質(zhì)，可以使菌絲在培養(yǎng)基中分散更均勻，增加與底物接觸，從而對(duì)菌株產(chǎn)酶有很大促進(jìn)作用。卵磷脂對(duì)纖維素酶的作用機(jī)理很早之前就有研究?？姛樀龋?6］經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)卵磷脂可作用于內(nèi)切葡聚糖酶，引起酶構(gòu)象的變化，并且與作用pH值和卵磷脂添加濃度有很大的關(guān)系。本研究選用的JG發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加鼠李糖脂和卵磷脂，培養(yǎng)7 d后，內(nèi)切葡聚糖苷酶、β-糖苷酶和濾紙酶活性較其它幾種表面活性劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活性都達(dá)到最大值，結(jié)果非常相近。添加卵磷脂的最終濾紙酶活0.41 IU/mL、內(nèi)切纖維素酶活0.978 IU/mL、β-葡萄糖苷酶活1.192 IU/mL，分別提高了72.9%、20.8%和33.6%?？紤]到鼠李糖脂由于成本較高，不適于大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用；相比之下，卵磷脂更具有工業(yè)應(yīng)用的潛質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究從含有枯枝腐葉及牛糞的土壤樣品中篩選出一株具有纖維素降解能力的草酸青霉菌，命名為草酸青霉菌JG（Penicillium oxalicum JG）。該菌株在最適碳源、氮源底物和最適發(fā)酵初始pH條件下產(chǎn)酶能力有顯著提高。生物表面活性劑卵磷脂菌株JG產(chǎn)酶具有明顯的促進(jìn)作用。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Optimization of Fermentation Condition for Cellulase Production by Penicillium oxalicum

LI Yang GAO Xiao-rong ZHANG Jian
（School of Life Science and Technology，Dalian University of Technology，Dalian 116024）

Cellulase plays an important role in the biological energy， textile， feed， paper industry， et al. Screening efficient strains and optimizing the fermentation condition are the effective way of obtaining cellulase. A cellulose-degrading strain JG was isolated from the soil containing rotten wood and straw. Morphology and molecular phylogenetic studies were used for its identification. Some factors during its fermentation were optimized， including initial pH， carbon source， nitrogen source and surfactants. The strain JG was identified as Penicillium oxalicum by analyzing its morphology and ITS（Internal Transcribesd Spacer）gene sequence phylogenetic systematics. Its optimal cultural conditions for the highest cellulase production were as following：initial pH values 2-3， carbon and nitrogen source were CMC-Na and soybean meal. Studying the effects of adding different kinds of surfactant on the fermentation process demonstrated that the lecithin of wide source and relatively low price had an obviously high effects on the cellulase production in JG， and the enzyme activities of FPA， CMCase， and BGL increased by 72.9%， 20.8% and 33.6% respectively. In conclusion， JG produced cellulase under lower initial pH， and lecithin enhanced its cellulase activity significantly.

Penicillium oxalicum；cellulase；lecithin；optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.020

2015-05-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200084）

李洋，女，碩士研究生，研究方向：微生物；E-mail：443897205@qq.com

高曉蓉，女，副教授，研究方向：微生物；E-mail：biogaoxr@dlut.edu.cn