都海渤 張欣 李贊 劉毅 劉波 李金霞 姚粟 程池

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

一株耐高溫菌CICC 10853的分離和鑒定

都海渤 張欣 李贊 劉毅 劉波 李金霞 姚粟 程池

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

從斜面培養(yǎng)基中分離到一株耐高溫菌CICC 10853，對該菌株的分類地位進行了研究。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA和recN基因序列分析的多相鑒定技術(shù)，將其鑒定為噬熱地芽胞桿菌（Geobacillus thermoleovorans），為后續(xù)對該菌的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

高溫菌；CICC 10853；鑒定

在微生物學(xué)研究中，高溫菌也稱嗜熱菌或好熱菌，具有嗜熱和耐熱的特性［1］。由于高溫微生物及其活性物質(zhì)可以在高溫條件下行使功能，具有超常的生物學(xué)穩(wěn)定性，能夠?qū)崿F(xiàn)一般生物技術(shù)難以達到的目的。高溫菌的利用有助于突破當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域中的一些局限，為提高生物技術(shù)能力開辟了重要途徑，因此在生物技術(shù)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力，特別是嗜熱酶作為酶制劑具有制備成本低、動力學(xué)反應(yīng)快、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點［2］，在輕工、食品、化工等眾多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用［3］。

高溫菌在地球上分布廣泛，不僅存在于地?zé)岘h(huán)境中，在人工高溫環(huán)境、地下油層甚至空氣中都曾發(fā)現(xiàn)有高溫菌的存在，但通常分布在陸地溫泉、海底熱泉、地殼內(nèi)部、酸性硫磺區(qū)等自然高溫環(huán)境中及高溫堆肥、煙囪、熱水器、熱污染河流等人工高溫環(huán)境中［4］。本研究從經(jīng)121℃滅菌20 min的斜面培養(yǎng)基中分離到一株高溫菌CICC 10853，通過表型、生理生化、16S rRNA基因和recN基因序列分析的多相鑒定技術(shù)確定該菌株的分類學(xué)地位，旨在為進一步了解其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 CICC 10853分離于CICC實驗室的斜面培養(yǎng)基。

1.1.2 R2A培養(yǎng)基 酵母粉 0.5 g，蛋白胨 0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，丙酮酸鈉 0.3 g，磷酸氫二鉀 0.3 g，硫酸鎂0.1 g，瓊脂 15.0 g。蒸餾水 1.0 L，pH7.2。121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純培養(yǎng) R2A培養(yǎng)基分裝試管，121℃滅菌20 min，冷卻至50-55℃擺斜面，凝固后置于37℃培養(yǎng)箱空置培養(yǎng)2 d，確認(rèn)無菌。在56℃培養(yǎng)48 h，長出菌落后，利用R2A平板劃線培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的R2A斜面培養(yǎng)后于4℃保藏。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 將供試菌株接種于R2A平板上，56℃培養(yǎng)24 h。取新鮮菌體進行革蘭氏染色并鏡檢，染色方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［5］。同時進行掃描電鏡切片并鏡檢、拍照。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen公司）提取菌株CICC 10853基因組DNA，具體步驟參見試劑盒說明書。以基因組DNA為模板，利用通用引物F27/1492R擴增16S rRNA基因［6］。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序結(jié)果用Chromas軟件參照正反序列圖譜人工校對，測序結(jié)果在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進行比對［7］，確定與已知近緣種序列的相似性。采用CLUSTAL W對CICC 10853及其若干近緣種16S rRNA基因序列進行多序列比對［8］，并利用N-J法通過MEGA 5軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析［9］。

1.2.4 recN 基因序列分析 以菌株CICC 10853的基因組DNA為模板，對靶基因recN（DNA修復(fù)和基因重組蛋白N亞基基因）進行擴增，PCR及反應(yīng)條件參照［10］。純化后的PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。測序得到的結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，并通過MEGA 5軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析［9］。

1.2.5 生理生化特征實驗 采用API 50CH及API 20E試劑條對CICC 10853 的碳源利用及其產(chǎn)酸情況、酶活性等生理生化特征進行檢測，具體操作方法按試劑條使用說明書進行。生長溫度實驗和耐鹽性實驗依據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》［11］（第2版）中地芽胞桿菌屬相關(guān)內(nèi)容，溫度選擇35℃、40℃、45℃、70℃和75℃，NaCl終濃度選擇1%、2%、3%、4%和5%。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株CICC 10853在R2A培養(yǎng)基上，菌落黃色、不透明、圓形、表面光滑（圖1-A）。利用光學(xué)顯微鏡觀察顯示菌體細(xì)胞長桿狀，單個或成鏈狀排列。革蘭氏染色陽性，有芽胞，芽胞橢圓或柱狀、端生或次端生，膨大明顯（圖1-B）。菌體電子顯微鏡觀察，菌體長度2.0-3.0 μm，寬度0.4-0.6 μm，掃描電鏡成像效果見圖1-C。

圖1 菌株CICC 10853形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2 16S rRNA基因序列分析

測序得到的菌株CICC 10853的16S rRNA基因序列信息提交至GenBank，獲得登錄號KP729021。以Bacillus subtilis NCIB 3610T（ABQL01000001）為外群，構(gòu)建CICC 10853與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

圖2 CICC 10853 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

由系統(tǒng)發(fā)育分析可判斷，CICC 10853應(yīng)歸屬為地芽胞桿菌屬（Geobacillus sp.），與好熱地芽胞桿菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞桿菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞桿菌（G.lituanicus）、噬熱地芽胞桿菌（G.thermoleovorans）、加爾加泉地芽胞桿菌（G.gargensis）和熱小鏈地芽胞桿菌（G.thermocatenulatus）等聚為一個系統(tǒng)發(fā)育分支，16S rRNA基因序列相似性均高于原核微生物種的界限98.65%［12］。Dinsdale等［13］根據(jù)API、脂肪酸成分、DDH等分析認(rèn)為好熱地芽胞桿菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞桿菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞桿菌（G.lituanicus）、噬熱地芽胞桿菌（G.thermoleovorans）應(yīng)歸為同一個種噬熱地芽胞桿菌（G.thermoleovorans），另外加爾加泉地芽胞桿菌（G.gargensis）應(yīng)為熱小鏈地芽胞桿菌（G.thermocatenulatus）的同物異名。

2.3 recN 基因序列分析

recN 基因是地芽胞桿菌屬內(nèi)種間分子生物學(xué)鑒定的重要工具［10］。以菌株CICC 10853的基因組DNA為模版，擴增recN 基因，基因序列信息提交至GenBank，獲得登錄號KP729022。以Bacillus subtilis subsp. subtilis 168T（AL009126）為外群，構(gòu)建CICC 10853與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

recN 基因基因序列分析顯示，菌株CICC 10853與好熱地芽胞桿菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞桿菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞桿菌（G.lituanicus）、噬熱地芽胞桿菌（G.thermoleovorans）的recN基因序列相似度為98.9%，與熱小鏈地芽胞桿菌（G.thermocatenulatus）的序列相似度為97.4%，而與其他近緣種的相似度均低于90%。CICC 10853與好熱地芽胞桿菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞桿菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞桿菌（G.lituanicus）、噬熱地芽胞桿菌（G.thermoleovorans）的recN基因序列種間相似性均大于99%，這也進一步證明了Anna E. Dinsdale等人的結(jié)論。

因此，根據(jù)16S rRNA和recN 基因分析表明，CICC 10853應(yīng)鑒定為噬熱地芽胞桿菌（G.thermoleovorans）或熱小鏈地芽胞桿菌（G.thermocatenulatus）。

2.4 生理生化鑒定

菌株CICC 10853的酶活性、碳源利用及其產(chǎn)酸情況等生理生化特征結(jié)果詳見表1。結(jié)果顯示菌株CICC 10853液化明膠，β-半乳糖苷酶反應(yīng)陽性；能利用葡萄糖、果糖、核糖、D-木糖、半乳糖、甘露糖、淀粉、甘油、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、七葉靈等碳源物質(zhì)，生長溫度為45-70℃，培養(yǎng)基中NaCl終濃度1%時可生長，NaCl終濃度2%時不能生長。生理生化結(jié)果與噬熱地芽胞桿菌（Geobacillus thermoleovorans）一致。

圖3 CICC 10853 recN基因系統(tǒng)發(fā)育分析

表1 CICC 10853生理生化特征檢測結(jié)果

2.5 菌株CICC 10853分類鑒定結(jié)論

依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rRNA 基因及recN基因序列分析，分離自斜面培養(yǎng)基的菌株CICC 10853被鑒定為噬熱地芽胞桿菌（Geobacillus thermoleovorans）。

3 討論

2001年，Nazina等［14］提出將芽胞桿菌屬16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育群GROUP 5的嗜熱菌群獨立出來，形成一個新屬地芽胞桿菌屬。該屬菌種表型相近，革蘭氏染色呈陽性（或可變），菌體桿狀，芽胞端生。生長溫度范圍37-80℃。大部分種在自然環(huán)境中廣泛存在，在溫泉、油田、火山口和堆肥等高溫環(huán)境，甚至土壤常溫環(huán)境和極地低溫環(huán)境中均有報道［15］。地芽胞桿菌屬正式發(fā)表的種共計19個，但近年來隨著新種的發(fā)現(xiàn)和分子生物學(xué)的發(fā)展，原有種的分類學(xué)地位發(fā)生了很大變化，如脆弱地芽胞桿菌G. debilis歸屬到新屬Caldibacillus sp.，命名為C. debilis；蒼白地芽胞桿菌G. pallidus、脆弱地芽胞桿菌G. debilis轉(zhuǎn)移到新屬Caldibacillus sp.；喜溫地芽胞桿菌Geobacillus tepidamans重新歸屬到無氧芽胞桿菌屬Anoxybacillus sp.。好熱地芽胞桿菌（G. kaustophilus）、火神地芽胞桿菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞桿菌（G. lituanicus）、噬熱地芽胞桿菌（G. thermoleovorans）合并為一個種噬熱地芽胞桿菌（G. thermoleovorans），同時加爾加泉地芽胞桿菌（G. gargensis）為熱小鏈地芽胞桿菌（G. thermocatenulatus）的同物異名。截止目前該屬僅存12個有效種，4個亞種［16］。

Zeigler［10］對68株地芽胞桿菌的recN 基因序列進行了分析，與16S rRNA基因相比，recN 基因在地芽胞桿菌種水平的鑒定區(qū)分度更高。本研究通過16S rRNA和recN 基因序列分析將菌株CICC 10853鑒定為噬熱地芽胞桿菌（G. thermoleovorans）或熱小鏈地芽胞桿菌（G. thermocatenulatus），菌株與噬熱地芽胞桿菌（G. thermoleovorans）的recN 基因序列相似性（98.9%）高于熱小鏈地芽胞桿菌（97.4%）。進一步綜合表型、生理生化等分類特征，CICC 10853被鑒定為噬熱地芽胞桿菌（G. thermoleovorans）這也進一步證明了Dinsdale等［13］的結(jié)論。

噬熱地芽胞桿菌CICC 10853是從經(jīng)121℃滅菌20 min的斜面培養(yǎng)基中分離獲得，可以推測其耐高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌20 min不能將其徹底殺滅。該菌在40℃及以下溫度不能生長，所以37℃空置培養(yǎng)時未能發(fā)現(xiàn)該菌的存在。此外，本研究針對CICC 10853進行碳源物質(zhì)利用情況及相關(guān)酶的活性進行研究，確定其能液化明膠，同時具有β-半乳糖苷酶活性，能利用葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、甘露糖、淀粉及甘油等近20種碳源物質(zhì)，為進一步開發(fā)該菌的生物學(xué)功能奠定重要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

依據(jù)多相鑒定技術(shù)，分離自斜面培養(yǎng)基的菌株CICC 10853被鑒定為噬熱地芽胞桿菌（Geobacillus thermoleovorans）。

［1］ 崔宗均， 路鵬， 于會泳， 張晉豐. 高溫菌生物學(xué)特性的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)雜志， 2003（4）：28-31.

［2］ 曹軍衛(wèi)， 沈萍， 李朝陽. 嗜極微生物［M］. 武漢：武漢大學(xué)出版社， 2004.

［3］ 潘麗貞， 陸利霞， 熊曉輝. 嗜熱菌產(chǎn)酶現(xiàn)狀的研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2012（3）：422-424.

［4］ 和致中， 彭謙， 陳俊英. 高溫菌生物學(xué)［M］. 北京：科學(xué)出版社，2001.

［5］東秀珠， 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］. 北京：科學(xué)出版社， 2001.

［6］張欣， 劉洋， 姚粟， 等. 1株分離自西沙諾尼果原漿細(xì)菌菌株CICC10881的鑒定及生物學(xué)特性研究［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2014， 40（11）：27-32.

［7］ Kim OS， Cho YJ， Lee K， et al. Introducing EzTaxon：a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species［J］. Int J Syst Evol Microbiol， 2012， 62：716-721.

［8］Thompson JD， Higgins DG， GibsonTJ. CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting， position-specific gap penalties and weight matrix choice［J］. Nucleic Acids Res， 1994， 22：4673-4680.

［9］Tamura K， Dudley J， Nei M， et al. MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4. 0［J］. Molecular Biology and Evolution， 2007， 24：1596-1599.

［10］ Zeigler DR. Application of a recN sequence similarity analysis to the identification of species within the bacterial genus Geobacillus［J］. Int J Syst Evol Microbiol， 2005， 55（3）：1171-1179.

［11］ De Vos P， Garrity GM， Jones D， et al. Bergey's manual of systematic bacteriology， second edition， volume three［M］. East Lansing：Michigan State University， 2009.

［12］Kim M， Oh HS， Park SG， Chun J. Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes［J］. Int J SystEvol Microbiol， 2014， 64：346-351

［13］ Dinsdale AE， Halket G， Coorevits A， et al. Emended descriptions of Geobacillus thermoleovorans and Geobacillus thermocatenulatus［J］. Int J Syst Evol Microbiol， 2011， 61：1802-1810.

［14］ Nazina TN， Tourova TP， Poltaraus AB， et al. Taxonomic study of aerobic thermophilic bacilli：descriptions of Geobacillus subterraneus gen. nov.， sp. nov. and Geobacillus uzenensis sp. nov. from petroleum reservoirs and transfer of Bacillus stearothermophilus， Bacillus thermocatenulatus， Bacillus thermoleovorans， Bacillus kaustophilus， Bacillus thermoglucosidasius and Bacillus thermodenitrificans to Geobacillus as the new combinations G. stearothermophilus，G. ［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2001， 51：433-446.

［15］ Marchant R， Banat IM. The Genus Geobacillus and Hydrocarbon Utilization//Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology［M］. Springer Berlain Heidelberg， 2010：1887-1896.

［16］http：//www. straininfo. net/taxa/3481/browser/euzeby

（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation and Identification of a High-temperature Resistant Bacterium CICC 10853

DU Hai-bo ZHANG Xin LI Zan LIU Yi LIU Bo LI Jin-xia YAO Su CHENG Chi
（China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）

In this study， we identified the high-temperature resistant bacterium CICC 10853 isolated from slant culture. The strain was identified and characterized via morphological features， physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA and recN gene sequence analysis. According to the results， strain CICC 10853 was identified as Geobacillus thermoleovorans， which lays the foundation for the further study of biological function of the bacterium.

thermophilic bacterium；CICC 10853；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.018

2015-04-30

都海渤，女，高級工程師，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：802311820@163.com

程池，男，教授級高工，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：cheng100027@163.com