鄭春麗王丹張禮陳敏潔馬宏偉姜志艷

（1.內蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，包頭 014010；2.白云鄂博多金屬資源綜合利用省部共建國家重點實驗室，包頭 014010）

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌硫酸鹽同化相關基因的鑒定與分析

鄭春麗1，2王丹1張禮1陳敏潔1馬宏偉1姜志艷1，2

（1.內蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，包頭 014010；2.白云鄂博多金屬資源綜合利用省部共建國家重點實驗室，包頭 014010）

旨在鑒定和分析嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）ATCC 23270硫酸鹽同化相關的基因。首先利用生物信息學的方法分析A. ferrooxidans ATCC 23270基因組中可能參與硫酸鹽同化的基因，通過反轉錄、凝膠電泳等技術手段對可能參與編碼半胱氨酸（Cys）操縱子的幾個候選基因cys JI、cys H、cys D-2、cys N、cys D-1和cys NC進行共轉錄鑒定，并對其關鍵的基因進行體外克隆、表達、純化重組，同時進行功能驗證和酶活測定。結果分析表明，半胱氨酸（Cys）操縱子的候選基因cys D-1和cys NC共轉錄，Cys JI、cys H、cys D-2、cys N共轉錄。初步確定了A. ferrooxidans ATCC 23270硫酸鹽同化可能的基本代謝路徑，探索了半胱氨酸（Cys）操縱子的調控機制。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌；硫酸鹽同化；共轉錄

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）是微生物浸礦過程中最有應用價值的一個種，屬革蘭氏陰性菌，是專性化能自養(yǎng)菌，好氧嗜酸，主要以CO2為碳源，同時吸收磷、氮等無機營養(yǎng)元素來合成自身細胞所需物質［1］。它具有將亞鐵氧化成三價鐵，將低價硫化物氧化成硫酸的能力，因而能使金屬從硫化礦中溶解，因此常用于浸礦菌種研究。而且微生物浸礦具有生產成本低、能耗低、投資少、設備簡單、環(huán)境友好，特別是具有處理低品位的或復雜的多金屬礦物等優(yōu)點。目前微生物浸礦的應用正在引起傳統(tǒng)礦物加工產業(yè)的重大變革，具有廣闊的應用前景［2-4］。而A. ferrooxidans因其自身的特殊性在生物冶金中具有重要作用，其中的硫酸鹽同化途徑是由無機硫到有機硫代謝轉化的關鍵過程。硫酸鹽經過一系列同化反應，以還原型硫的形式被整合進入有機骨架，生成半胱氨酸（Cysteine，Cys）。Cys是眾多具有重要生物學功能的代謝產物的前體，也就是產生的半胱氨酸可進一步參與其他體內代謝物質的合成。但是，目前我們對于Cys的具體作用機制及其操縱子調控機制不是很清楚。因此本研究以嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（A. ferrooxidans）為標準菌株ATCC 23270作為研究對象，采用基因組、總RNA的提取與純化，反轉錄，瓊脂糖凝膠電泳技術，SDS-PAGE，RT-qPCR技術以及生物信息學分析等實驗方法或手段，對其硫酸鹽同化相關基因的鑒定與分析，旨在達到初步確定A. ferrooxidans ATCC 23270的硫酸鹽同化可能的基本代謝路徑和探索Cys操縱子調控機制的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A. ferrooxidans）為標準菌株ATCC 23270（中南大學友情提供，購自美國菌種保藏中心）。能源培養(yǎng)基則采用改進的9K培養(yǎng)基，在改進的9K培養(yǎng)基的基礎上，添加S 5.0 g/L 或硫酸亞鐵44.2 g/L。改進的9K培養(yǎng)基、K2Cr2O7標準液、硫磷酸混合液、75%乙醇（用DEPC處理過的水配制）、QIAGEN RNase-free水、RNase-free DNase I（QIAGEN，Valencia，CA）、引物由上海生工生物工程有限公司合成。北京艾德萊生物科技細菌基因組DNA快速提取試劑盒、BioFlux公司的Simply P 總RNA 提取試劑盒、RNA純化試劑盒為QIGEN，RNeasy Mini Kit。HiTrap從通用電氣醫(yī)療集團有限公司購買，E. coli菌株BL21（DE3）感受態(tài)細胞來自英杰生命技術有限公司，Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶和限制性內切酶來自MBI Fermentas。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 A. ferrooxidans ATCC 23270的全基因組的序列和注釋從NCBI（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/1014）獲得。使用源自UniProt數(shù)據庫的BLAST對核苷酸和蛋白質序列進行序列相似性搜索，得到可能參與硫酸鹽同化的基因。

1.2.2 A. ferrooxidans 菌體培養(yǎng)與收集 菌株在含有硫酸亞鐵的能源培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)（約60-90 h），以Fe2+的氧化率來反應其菌體的生長狀況，即重鉻酸鉀滴定法測定細菌是否達到對數(shù)生長期，達到對數(shù)期的菌液4 000 r/min、4℃離心20 min收集菌體。得到的菌體用pH2.0的硫酸溶液吹打混勻，重復洗滌3次，去掉細胞表面的鐵礬沉積物。

1.2.3 A. ferrooxidans菌體的基因組、總RNA的提取與純化 A. ferrooxidans菌基因的提取按照北京艾德萊生物科技細菌基因組DNA快速提取試劑盒說明書進行?？俁NA提取步驟按BioFlux公司的Simply P總RNA 提取試劑盒說明書進行?？俁NA的純化參照QIAGEN RNeasy Mini Kit 進行。Invitrogen第一鏈合成試劑盒反轉錄合成cDNA。

1.2.4 RT-PCR反應 使用10%的cDNA（取上一步驟2 mL反應產物）用于PCR反應。PCR模板分別為：空白、RNA、DNA和cDNA。

（1）RT-PCR擴增引物：引物根據GenBank中公布的A. ferrooxidans ATCC 23270標準菌株的全基因組序列、通過Primer 5.0軟件分析設計、由上海生工生物工程公司合成。引物序列見表1。

（2）RT- PCR反應體系為：10×PCR緩沖液2.5 mL，50 mmol/L MgCl21.5 mL，10 mmol/L dNTP混合物0.5 mL，上游擴增引物（終濃度10 μmol/L）0.5 mL，下游擴增引物（終濃度10 μmol/L）0.5 mL，Taq DNA聚合酶（5 U/mL）0.25 mL，模板1 mL，滅菌蒸餾水16 mL。

（3）RT-PCR反應程序設置為：94℃下預變性3 min；94℃變性 45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)35次；72℃下延伸10 min；4℃下保存。

1.2.5 硫酸鹽同化相關基因的表達和純化 硫酸鹽同化途徑相關基因包括來自A. ferrooxidans的腺苷酰轉移酶，ATP硫酸化酶（CysD），腺苷酰硫酸還原酶（CysH），亞硫酸還原酶（CysJI），絲氨酸乙酰轉移酶（CysE）和O-乙酰絲氨酸巰解酶（CysM）。按照文獻［5-8］，表達和純化重組基因cys J、cys M、cys H。重組蛋白的儲備液用20 mmol/L的磷酸鉀緩沖液保存，pH為7.4，含有5%的甘油和5 mmol/L的β-硫基乙醇，然后保存在-80℃冰箱中。洗脫液用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，使用Laemmli不連續(xù)緩沖體系。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色。

表1 共轉錄引物

1.2.6 酶活力的測定 將ATPS與熒光素酶耦合測定酶的活力［9］，根據Trüper等［10］的方法測定APS還原酶的活力。根據Warrilow等［11］的方法測定半胱氨酸合成酶的活力。根據改進的Ostrowski等［12］的方法測定R-FP的活力。根據Kredich等［13］的方法分析R-FP的活力。

2 結果

2.1 預測的A.ferrooxidans ATCC23270基因組中硫酸鹽同化相關的基因

在A. ferrooxidans ATCC 23270基因組注釋里，有一些ORF被認為編碼與硫酸鹽同化相關的蛋白。圖1展示了所有這些假定的A. ferrooxidans基因，表2說明其中一些基因可能的作用及功能。根據他們與已知基因的相似性，可以認為3個ORF（cys D-1、cys D-2、cys N）編碼ATP硫酸化酶，兩個ORF（cys NC-2和cys NC）編碼潛在的腺苷酰硫酸激酶［14］。在硫酸鹽同化途徑中，ATP硫酸化酶催化無機硫酸鹽同化途徑中的第一步，由ATP提供能量，通過酶促反應活化硫酸鹽，生成腺苷5'-磷酰硫酸（APS）和焦磷酸鹽［15，16］，然后被腺苷5'-磷酰硫酸（APR）還原酶催化成亞硫酸鹽，產物隨即又被亞硫酸鹽還原酶催化，生成的硫代謝產物很快被整合入O-乙酰絲氨酸（O-acetylserine）的氨基酸骨架中，最后在半胱氨酸合成酶催化下生成Cys［16］。在E. coli和其他細菌中這種活性需要兩個蛋白，由cys D基因編碼的催化亞基和由cys N基因編碼的調節(jié)亞基［17］。相反，在真核細胞，古細菌和一些細菌（如B. subtilis）中這兩個亞基是融合的。由APS激酶（cys C基因編碼）催化的ATP依賴的APS磷酸化反應，進一步生成3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）［18］。在包括Mycobacterium和Pseudomonas的一些有機體中，cys C和cys N的產物是融合的［19］。

其中一個ORF可能編碼APS還原酶或者PAPS還原酶（CysH），然而在這條代謝途徑中有很多變體，并非所有的有機體都還原APS。植物，藻類和光合細菌利用APS，而細菌和真菌利用PAPS［20］。Kelley等［21］利用螢火蟲的敏感的生物熒光系統(tǒng)，在Thiobacillus ferrooxidans中并沒有得到PAPS與硫同化的代謝相關的證據。因此，我們嘗試性地將其確定為APS還原酶。

表2 Acidithiobacillus ferrooxidansATCC 23270硫酸鹽同化基因可能的作用及功能

圖1 A. ferrooxidans ATCC 23270基因組中預測的硫酸鹽同化基因

兩個ORF可能編碼亞硫酸鹽還原酶（SIR，CysJI），在E. coli中，這個復雜的酶由兩種不同的多肽鏈組成，即α（CysJ）和 β（CysI），并含有一個α8β4結構。黃素蛋白α8，包含4個FAD和4個FMN輔因子，并含有NADPH-細胞色素c還原酶的活性。CysI是一個血紅素蛋白，包含一個［4Fe-4S］簇和一個西羅血紅素。黃素蛋白接受來自NADPH的電子，并將其傳遞到CysI，然后將亞硫酸鹽還原為硫化物［22］。

半胱氨酸合成的最后一步與絲氨酸乙酰轉移酶（SAT）和半胱氨酸合成酶相關，有兩個ORF可能編碼絲氨酸乙酰轉移酶，cys E1和cys E2，它們都負責N-乙酰-L-絲氨酸的生成，并可能在Cys操縱子的調節(jié)中扮演重要角色。一個ORF可能編碼OASS cys M基因，OASS利用吡哆醛-5'-磷酸（PLP）作為輔因子，是許多生物中PLP依賴的酶中β家族中的一員。

2.2 基因組DNA的提取

由圖2所示，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因組條帶在10 kb Marker的上方，大小符合理論值，條帶完整、明亮、清晰、無拖尾現(xiàn)象而且無RNA污染，表明A. ferrooxidans的基因組可用于下游實驗。

2.3 RNA提取結果

由圖3所示，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的總RNA為清晰、完整的3個條帶，符合原核生物的為23S RNA、16S RNA與5S RNA，總RNA提取純化過程中無明顯的RNase作用導致的降解，經Nano Drop紫外分光光度計檢測，在波長為260 nm和280 nm處的消光系數(shù)OD260與OD280的比值均在1.80-2.00，說明總RNA的完整性與純度均較好，mRNA降解較少，可用于后續(xù)實驗研究。

圖2 A.ferrooxidans基因組DNA電泳圖

圖3 A. ferrooxidans RNA電泳圖

2.4 RT-PCR共轉錄鑒定

結果如圖4所示。其中，圖4-A顯示，目的片段長度為261 bp，泳道4出現(xiàn)了擴增條帶說明進行了共轉錄。圖4-B顯示目的片段長度為256 bp，說明cys J與cys I進行了共轉錄。圖4-C顯示，目的片段長度為202 bp，說明cys I與cys H進行了共轉錄。圖4-D顯示，目的片段長度為199 bp，說明cys H與cys D-2進行了共轉錄。

圖4-E顯示，目的片段長度為253 bp，說明cys D-2與cys N一起轉錄。圖4-F顯示，目的片段長度為1941 bp，說明cys J、cys I、cys H一起轉錄。圖4-G顯示，目的片段長度為962 bp，說明cys I、cys H、cys D-2一起轉錄。

圖4-H顯示，目的片段長度為1 134 bp，說明cys H、cys D-2、cys N一起轉錄。圖4-I顯示，目的片段長度為2 701 bp，說明cys J、cys I、cys H、cys D-2一起轉錄。圖4-J顯示，目的片段長度為1897 bp，說明cys I、cys H、cys D-2、cys N一起轉錄。

2.5 A. ferrooxidans ATCC 23270的硫酸鹽同化基因的重組

用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的關鍵基因編碼的相應蛋白質分的子量分別是，CysD-1為33.228 kD，CysH為28.203 kD，CysJ為66 kD，CysI為60 kD，CysE為28 kD，CysM為31.682 kD，大小與理論預測值相符，電泳分析結果（圖5）顯示，其無明顯雜帶，表明其蛋白純度較好，因此所純化基因可用于后續(xù)的檢測。

2.6 酶活分析

根據我們前文的預測和分析［24］，ATP硫酸化酶由許多亞基組成，其中結構基因可能是cys D-1。我們純化并測定了這個基因的活性，結果低于（3.0×102±10.91）U/mg。ATP硫酸化酶的活性可能是由亞基共同構成的。APS還原酶的活力是（5.0×103±25.68）U/mg。亞硫酸鹽的比活力（α亞基CysJ）為（24.03±0.76）U/mL，將α亞基與β亞基（CysI）融合后，比活力提高到了（39.52±1.17）U/mL。絲氨酸乙酰轉移酶（CysE-1）的比活力為（18.08±0.55）U/mL。O-乙酰絲氨酸巰解酶（CysM）的活力為（5.0×104±52.68）U/mg。根據酶的特性，純化的關鍵基因具有相關酶的活性，但是活力很低，尤其是由許多亞基構成的酶。然而，這些數(shù)據能夠有效地說明這些關鍵基因編碼的酶表現(xiàn)出了半胱氨酸合成的催化功能。

2.7 A. ferrooxidans ATCC 23270可能的硫酸鹽同化途徑

根據對A. ferrooxidans硫酸鹽同化基因的分析和描述繪制出的可能的硫酸鹽同化途徑（圖8）。硫被轉運進細胞后，首先以磷酸腺苷硫酸（APS）的形式被ATP硫酸化酶（由cys D和cys N編碼）同化。然后APS被APS還原酶（由cys H編碼）還原為亞硫酸鹽，亞硫酸鹽被NADPH-亞硫酸鹽還原酶（由cys JI編碼）還原為硫化物。最后，硫化物與O-乙酰絲氨酸反應，被O-乙酰絲氨酸巰解酶（由cys M編碼）還原為H2S，O-乙酰絲氨酸是絲氨酸乙酰轉移酶（由cys E編碼）利用乙酰輔酶A將絲氨酸乙?；?。

圖4 RT-PCR電泳圖

3 討論

通過生物信息學的分析，發(fā)現(xiàn)了6個可能的硫酸鹽同化途徑相關的關鍵基因cys JI、cys H、cys D-2、cys N、cys D-1和cys NC。在微生物的基因組中，功能相關的基因往往處于同一個轉錄元件中。原核生物中，功能相同的基因往往位于基因組的相鄰位置成簇出現(xiàn)，甚至一同轉錄，如色氨酸操縱子和乳糖操縱子都是研究的比較清楚的操縱子。因此，我們用Reverse transcriptase PCR技術對Cys操縱子進行了研究。Cys操縱子是A. ferrooxidans中與重金屬抗性密切相關的基因簇，它們可能編碼了一個多功能酶或者他們的表達是相連的，本研究通過Reverse transcriptase PCR技術從轉錄水平上驗證了Cys操縱子上相關基因的共轉錄情況。實驗中以反轉錄形成的cDNA為模板，對Cys操縱子上的相關基因進行PCR擴增。由以上電泳結果表明，（1） 所有以基因組為模板的陽性對照均有與目的片段長度相同的擴增條帶出現(xiàn)，說明A. ferrooxidans菌中存在這些基因。（2） 空白對照全部沒有擴增條帶出現(xiàn)說明PCR體系沒有被污染。（3） 陰性對照全部沒有出現(xiàn)擴增條帶，說明提取到的總RNA中沒有基因組的DNA污染，結果準確可信。即：cys D-1和cys NC共轉錄。Cys JI、cys H、cys D-2、cys N共轉錄。CysD是ATP硫酸化酶蛋白家族一員，有研究發(fā)現(xiàn)，在硫酸鹽的代謝過程中，ATP硫酸化酶會與其他與硫代謝相關的酶一起組成一個多酶復合體［25-27］。生物信息學研究也證實了A. ferrooxidans中CysN和CysD位于同一個操縱子上，他們的復合體CysDN 共同參與了ATP硫酸化酶的催化反應［24］。

圖5 A. ferrooxidans ATCC 23270中假定的硫酸鹽同化基因的SDS-PAGE結果

表3 A. ferrooxidans ATCC 23270中硫酸鹽同化基因的酶活測定

實驗對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌硫酸鹽同化相關基因進行分析，對其關鍵基因進行體外表達性質研究，結果表明，硫酸鹽同化的基本代謝路徑可能為：被運輸?shù)襟w內的硫酸鹽首先被cys DN編碼的ATP硫酸化酶激活為APS（adenosine-5'-phosphosulfate），隨后被cys H基因編碼的APS還原酶還原為亞硫酸鹽，亞硫酸鹽又被cys JI編碼的亞硫酸鹽還原酶還原為硫化物，最后硫化物與O-乙酰絲氨酸由cys M編碼的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。在硫酸鹽的同化途徑中發(fā)揮關鍵作用的是4個關鍵酶：ATP硫酸化酶（ATPS）、APS還原酶、亞硫酸鹽還原酶（SIR）、半胱氨酸合成酶，并且硫的代謝也是嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（A. ferrooxidans）非常重要的能量代謝，其包括硫的氧化與還原。因而對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌進行硫酸鹽同化的研究，對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌硫的代謝會提供重要的支撐，同時對其各方面研究提供了一定的基礎。

圖8 A. ferrooxidans ATCC 23270可能的硫酸鹽同化途徑

4 結論

生物信息學分析結果表明，基因cys JI、cys H、cys D-2、cys N、cys D-1和cys NC均與A. ferrooxidans ATCC 23270菌株硫酸鹽同化途徑有一定的相關性。Cys操縱子上相關基因的共轉錄結果表明，cys D-1和cys NC共轉錄。Cys JI、cys H、cys D-2、cys N共轉錄。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的關鍵基因編碼的相應蛋白質分子量分別是CysD-1為33.228 kD，CysH為28.203 kD，CysJ為66 kD，CysI為60 kD，CysE為28 kD，CysM為31.682 kD，大小與理論預測值相符；在硫酸鹽的同化途徑中發(fā)揮關鍵作用的是4個關鍵酶：ATP硫酸化酶（ATPS）、APS還原酶、亞硫酸鹽還原酶（SIR）、半胱氨酸合成酶。A. ferrooxidans硫酸鹽同化的基本代謝路徑可能為：被運輸?shù)襟w內的硫酸鹽首先被cys DN編碼的ATP硫酸化酶激活為APS（adenosine-5'-phosphosulfate），隨后被cys H基因編碼的APS還原酶還原為亞硫酸鹽，亞硫酸鹽又被cys JI編碼的亞硫酸鹽還原酶還原為硫化物，最后硫化物與O-乙酰絲氨酸由cys M編碼的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。

［1］鄧恩建， 楊朝暉， 曾光明， 等. 氧化亞鐵硫桿菌的研究概況［J］.黃金科學技術， 2005， 13（5）：8-12.

［2］張琛， 鄭紅艾， 周笑綠， 等. 生物浸出技術的發(fā)展及其電化學研究現(xiàn)狀［J］. 金屬礦山， 2014（12）：122-128.

［3］孫慧， 谷亞冰， 馬麗媛， 等. 浸礦微生物生物膜的形成與調控研究現(xiàn)狀［J］. 濕法冶金， 2015， 34（2）：83-87.

［4］楊顯萬， 沈慶峰， 郭玉霞. 微生物濕法冶金［M］. 北京：冶金工業(yè)出版社， 2003：4-9.

［5］Zheng CL， Zhang YF， Liu YD， et al. Characterization and Reconstitute of a［Fe4S4］Adenosine 5'-phosphosulfate Reductase from Acidithiobacillus ferrooxidans［J］. Current Microbiology，2009， 58（6）：586-592.

［6］Zeng J， Wang M， Zhang X， et al. Expression， purification and characterization of the sulfite reductase hemo-subunit， SiR-HP， from Acidithiobacillus ferrooxidans［J］. Biotechnol Lett， 2008， 30（7）：1239-1244.

［7］Zheng CL， Nie L， Qian L， et al. K30， H150， and H168 are essential residues for coordinating pyridoxal 5'-Phosphate of O-acetylserine sulfhydrylase from Acidithiobacillus ferrooxidans［J］. Curr Microbiol， 2010， 60：461-465.

［8］鄭春麗， 李艷君， 錢林， 等. 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌半胱氨酸合成酶的表達、純化及其性質鑒定［J］. 生物技術通報， 2011（3）：180-184.

［9］Karamohamed S， Nyren P. Real-time detection and quantification of adenosine triphosphate sulfurylase activity by a bioluminometric approach［J］. Anal Biochem， 1999， 271（1）：81-85.

［10］Trüper HG， Lynne AR. Purification and properties of adenylyl sulfate reductase from the phototrophic sulfur bacterium， Thiocapsa roseopersicina［J］. J Bacteriol， 1971， 108（3）：1112-1121.

［11］Warrilow AGS， Hawkesford MJ. Separation， subcellular location and influence of sulphur nutrition on isoforms of cysteine dynthase in spinach［J］. J Exp Bot， 1998， 49（327）：1625-1636.

［12］Ostrowski J， Barber MJ， Rueqer DC， et al. Characterization of the flavoprotein moieties of NADPH-sulfite reductase from Salmonella typhimurium and Escherichia coli：Physicochemical and catalytic properties， amino acid sequence deduced from the DNA sequence of CysJ and comparison with NADPH-cytochrome P-450 reductase［J］. J Biol Chem， 1989， 264：15726-15737.

［13］Kredich， KM， Tomkins， GM. The enzymic synthesis of L-Cysteine in Escherichia coli and Salmonella typhimurium［J］. J Biol Chem， 1966， 241（21）：4955-4965.

［14］Valdes J， Veloso F， Jedlicki E， et al. Metabolic reconstruction of sulfur assimilation in the extremophile Acidithiobacillus ferrooxidans based on genome analysis［J］. BMC Genomics，2003， 4（51）：1-16.

［15］Jaramillo ML， Abanto M， Quispe RL， et al. Cloning， expression and bioinformatics analysis of ATP sulfurylase from Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 in Escherichia coli［J］. Bioinformation，2012， 8（15）：694-704.

［16］Takahashi H， Kopriva S， Giordano M， et al. Sulfur assimilation in photosynthetic organisms：molecular functions and regulations of transporters and assimilatory enzymes［J］. Annu Rev Plant Biol，2011， 62：157-184.

［17］Kredich NM. Biosynthesis of cysteine in Escherichia coli and Salmonella［J］. Cellular and Molecular Biology， 1996：514-527.

［18］Guédon E， Verstraete IM. Cysteine metabolism and its regulation in bacteria［J］. Microbiol Monographs， 2007， 5：195-218.

［19］Pinto R， Tang QX， Britton WJ， et al. The Mycobacterium tuberculosis CysD and CysNC Genes form a stress-induced operon that encodes a tri-functional sulfate-activating complex［J］. Microbiology， 2004， 150（Pt6）：1681-1686.

［20］Kopriva S， Heinz R. Control of sulphate assimilation and glutathione synthesis：Interaction with N and C metabolism［J］. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（404）：1831-1842.

［21］Kelley BC， Tuovinen OH， Donald Nicholasen DJ. Utilization of35S-thiosulphate and an appraisal of the role of ATP sulphurylase in chemolithotrophic Thiobacillus ferrooxidans［J］. Arch Microbiol，1976， 109：205-208.

［22］ Kredich NM. Biosynthesis of cysteine［M］// Neidhardt FC. Escherichia coli and Salmonella， Cellular and Molecular Biology. Washington DC：ASM Press， 1996：514-527.

［23］Zheng CL， Chen MJ， Tao ZL， et al. Differential expression of sulfur assimilation pathway genes in Acidithiobacillus ferrooxidans under Cd2+stress：evidence from transcriptional， enzymatic， and metabolic profiles［J］. Extremophiles， 2015， 19：429-436.

［24］錢林， 鄭春麗， 柳建設. 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATP硫酸化酶的表達、純化及性質鑒定［J］. 生物技術通報， 2012（6）：136-140.

［25］ Rachel P， Quing XT， Warwick JB， et al. The Mycobacterium tuberculosis CysD and CysNC genes form a stress-induced operaon that encodes a tri-functional sulfate-activating complex［J］. Microbiology， 2004， 150：1681-1686.

［26］ Mathew C， Susanna L， John M， et al. Complex formation between recombinant ATP sulfurylase and APS reductase of Allium cepa［J］. FEBS Letters， 2007， 581：4139-4147.

［27］ Carla S， Christel V， Ismael H， et al. Identification of a third sulfate activation system in Sinorhizobium sp. strain BR816：the CysDN sulfate activation complex［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69（4）：2006-2014.

（責任編輯 馬鑫）

The Identification and Analysis of Sulfate-assimilation Related Genes in Acidithiobacillus ferrooxidans

ZHENG Chun-li1，2WANG Dan1ZHANG Li1CHEN Min-jie1MA Hong-wei1JIANG Zhi-yan1，2
（1. School of Mathematics，Physics and Biotechnology，Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou 014010；2. The Jointed State Key Laboratory for Baiyun Obo Polymetallic Resources Comprehensive Utilization by Province and Ministry，Baotou 014010）

This work aims to identify and analyze the related genes of sulfate-assimilation in Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270. Firstly， the genes involved in sulfate-assimilation in the genome of A. ferrooxidans ATCC 23270 were analyzed using bioinformatics. Then we co-transcripted and identified the candidate genes cys JI， cys H， cys D-2， cys N， cys D-1， and cys NC probably involving in encoding cysteine（Cys）operon by reverse transcription and gel electrophoresis. Further we cloned in vitro， expressed， purified and recombined the key genes， and confirmed their functions and measured their enzyme activities. Results showed that among these candidate genes of Cys operon， cys D-1 and cys NC were co-transcripted， and Cys JI， cys H， cys D-2 and cys N were co-transcripted. The possible basic metabolic pathway of sulfate-assimilation in A. ferrooxidans ATCC 23270 was determined preliminarily， and the regulatory mechanism of Cys operon was explored.

Acidithiobacillus ferrooxidans；sulfate-assimilation；co-transcription

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.017

2015-07-28

國家自然科學基金項目（51264029，41561094），內蒙古自治區(qū)青年科技英才計劃項目（NJYT-14-B12），內蒙古自治區(qū)應用技術研究與開發(fā)資金項目，內蒙古科技大學創(chuàng)新基金項目（2014QNGG05）

鄭春麗，女，博士，副教授，研究方向：資源與環(huán)境生物學；E-mail：zhengchunli1979@163.com