朱永瑞 曾柏全 曾磊 劉輝

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004）

黑曲霉C112纖維二糖酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析

朱永瑞 曾柏全 曾磊 劉輝

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004）

以紫外誘變獲得的高產(chǎn)纖維素酶黑曲霉C112菌株為模板，采用RT-PCR技術(shù)克隆黑曲霉C112的纖維二糖酶基因bgl（GenBank登錄號(hào)：KP307454）；該基因全長(zhǎng)2 934 bp，含有非編碼序列，編碼860個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.70，核酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的Aspergillus niger（GenBank登錄號(hào)JX982101.1）同源性達(dá)到了99%；生物信息學(xué)分析表明，纖維二糖酶為具有一定親水性的穩(wěn)定酸性分泌蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲為結(jié)構(gòu)元件；該基因經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果表明，重組表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子量約為93.3 kD，與預(yù)期相符；纖維二糖酶在大腸桿菌BL21中胞內(nèi)融合表達(dá)，重組蛋白pNPG酶活為5.847 U/mL，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值為5.0。

黑曲霉C112；纖維二糖酶；克??；生物信息學(xué)

纖維二糖酶又稱為β-葡萄糖苷酶［1］，能夠水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖［2］，并能極大地促進(jìn)內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的水解作用，加快纖維素酶系的整體水解速度，促使纖維素的水解更完全［3］?，F(xiàn)在對(duì)真菌中纖維二糖酶產(chǎn)生菌研究較多的是絲狀真菌，主要為曲霉屬和木霉屬［4］，而細(xì)菌中研究較多的是芽孢桿菌屬［5，6］。

黑曲霉（Aspergillus niger）是纖維二糖酶的高產(chǎn)菌株［7，8］，但是關(guān)于黑曲霉纖維二糖酶基因的研究報(bào)道仍然較少［9，10］。2000年，美國(guó)Dan等［11］研究者在GenBank上登錄了第一個(gè)黑曲霉纖維二糖酶的全基因序列。2007年，荷蘭工業(yè)化學(xué)公司首次完成了對(duì)一株黑曲霉的全基因組測(cè)序，該黑曲霉基因組有3 390萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，并且構(gòu)成超過(guò)14 000個(gè)獨(dú)特的基因，其中編碼纖維二糖酶的基因已被完全確定［12］。國(guó)內(nèi)2006年首次出現(xiàn)關(guān)于黑曲霉纖維二糖酶基因克隆研究的報(bào)道。

本研究通過(guò)參照GenBank上已發(fā)表的黑曲霉纖維二糖酶基因序列（登錄號(hào)：AJ132386）設(shè)計(jì)引物，實(shí)驗(yàn)菌株是經(jīng)過(guò)紫外誘變篩選獲得的高產(chǎn)纖維素酶黑曲霉菌，以此菌株總RNA為模板克隆了纖維二糖酶的基因，進(jìn)行基因序列測(cè)序。國(guó)內(nèi)外對(duì)該基因生物學(xué)信息還未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究對(duì)該基因進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，以更好地了解纖維二糖酶的功能性質(zhì)，并且實(shí)現(xiàn)該基因在大腸桿菌BL21中胞內(nèi)融合表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 黑曲霉（Aspergillus niger）C112［13］，保存于中南林業(yè)科技大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。大腸桿菌DH5α、BL21（DE3），pEASY-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 酶與試劑 總RNA提取試劑（Trigol）、焦碳酸二乙酯（DEPC），北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，北京天根公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑、EasyTaq PCR SuperMix，北京全式金生物公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L（將馬鈴薯切成方塊，置于1 000 mL水中煮沸，過(guò)濾收集液體，即得），葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L。纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，麥芽糖4 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，加入去離子水950 mL，用10 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，加去離子水定容1 L。LB固體培養(yǎng)基：配方和液體培養(yǎng)基一樣，并加入15 g瓊脂粉。所配的培養(yǎng)基均在1×105Pa滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank上已發(fā)表的黑曲霉纖維二糖酶（bgl1）基因序列（GenBank登錄號(hào)為AJ132386），利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列為上游引物P1：5'-CGGAATTCATGAGGTTCACT TTGATCGAGGCGG-3'，下游引物P2：5'-ATGCGGCCGC TTAGTGAACAGTAGGCAGAGACG-3'，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。為了便于與載體連接，在引物中加入酶識(shí)別位點(diǎn)，bgl1的引物中加入了EcoR I和Not I位點(diǎn)（引物中的劃線部分）。

1.2.2 黑曲霉C112的復(fù)蘇和保藏 從真空凍干菌管中用接種環(huán)刮下少量細(xì)胞接于PD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)從培養(yǎng)液中蘸取少量菌液畫(huà)線于PDA斜面，30℃靜置培養(yǎng)到長(zhǎng)出孢子，于 4℃保存。

1.2.3 黑曲霉C112總RNA提取及cDNA的合成總RNA的提取方法參照北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司的Trigol試劑盒的說(shuō)明。cDNA的合成按照北京全式金生物公司的RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4 纖維二糖酶基因的測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)生分析 將PCR產(chǎn)物回收純化后，克隆到pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選重組子，挑取經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行序列測(cè)定。利用Blast工具進(jìn)行序列相似性分析，選取部分同源序列，利用Clustal X 軟件包進(jìn)行序列同源進(jìn)化比對(duì)，形成一個(gè)多重序列匹配排列矩陣，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 測(cè)序及序列的生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果采用在線軟件對(duì)纖維二糖酶基因氨基酸序列進(jìn)行物理性質(zhì)（http：//web.expasy.org/protparam/）、二級(jí)結(jié)構(gòu)（http：//npsa-pbil.Ibcp.fr/cgi-bin/npsa-auomat. pl/page=/NPSA/npsa-hnn.html）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（http：// swissmodel.expasy.org/SWISS -MODEL.html）及信號(hào)肽（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0）等信息的預(yù)測(cè)分析，氨基酸序列同源比對(duì)用Blast在線工具和DNAMAN8.0軟件完成。

1.2.6 纖維二糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證 將陽(yáng)性重組子接種到新鮮含有相應(yīng)抗體的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，以1%的比例接種到30 mL抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后（OD600=0.4-0.5），加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，30℃誘導(dǎo)3 h，取1 mL菌液，4℃、12 000 r/min離心2 min，收集菌體，用PBS緩沖液（pH7.0）洗滌沉淀，并溶于500 μL相同緩沖液中。超聲破碎細(xì)胞：功率200 W，超聲2 s間隔4 s，共60次。4℃、12 000 r/min離心30 min，得到上清液即粗酶液。取適量菌液做誘導(dǎo)表達(dá)效果的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)以未加IPTG誘導(dǎo)為對(duì)照，并運(yùn)用Western blotting技術(shù)對(duì)重組蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.7 纖維二糖酶的酶活檢測(cè) 采用國(guó)際通用的方法測(cè)定纖維二糖酶的活力［14］：取0.1 mL稀釋了適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液（對(duì)照管不加），加入1 mL pH4.8的0.05 mol/L檸檬酸緩沖溶液，于50℃水浴預(yù)熱10 min；加入已預(yù)熱10 min的0.9 mL 5 mmol/L pNPG 溶液，計(jì)時(shí)，10 min后立即加入1 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)；加入蒸餾水定容到25 mL；室溫放置5 min，于410 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)。在上述條件下，1 mL酶液1 min水解產(chǎn)生1 μmol 的對(duì)硝基苯酚的酶活力，定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.8 重組酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

1.2.8.1 溫度對(duì)酶活力的影響 粗酶液在不同溫度下（30、40、50、60、70、80℃）保溫30 min后，按照1.2.7中的方法測(cè)定酶活。

1.2.8.2 pH對(duì)酶活力的影響 粗酶液分別在不同pH值的醋酸緩沖液條件下（pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）室溫處理30 min后，按照1.2.7中的方法測(cè)定酶活。

2 結(jié)果

2.1 纖維二糖酶基因的克隆

利用所設(shè)計(jì)的引物，以黑曲霉菌株的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果（圖1）顯示擴(kuò)增片段約為2 900 bp左右，與預(yù)期相符。

圖1 纖維二糖酶基因的PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 纖維二糖酶的生物信息學(xué)分析

2.2.1 纖維二糖酶基因的序列分析 纖維二糖酶基因片段大小為2 934 bp，將該基因命名為bgl，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為KP307454。其中A：644個(gè)、T：666個(gè)、G：834個(gè)、C：790個(gè)，G+C含量為55.35%。該基因編碼860個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，以ATG為起始密碼子，含有非編碼序列。BLAST序列分析表明，該片段與數(shù)據(jù)庫(kù)的Aspergillus niger（GenBank登錄號(hào)JX982101.1）核苷酸序列有著99%的相似性（表1），由此可以確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)是bgl基因。

表1 與部分微生物來(lái)源的纖維二糖酶基因相似性比較

2.2.2 纖維二糖酶基因的系統(tǒng)發(fā)生分析 Blastp同源性檢索表明，黑曲霉C112菌株纖維二糖酶基因與黑曲霉（GenBank登錄號(hào)：JX982101.1）的bgl1具有很高的同源性。采用Mega 4.0軟件（Neighbor-Joining法）對(duì)已報(bào)道的黑曲霉纖維二糖酶氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析（圖2），該基因與其他bgl基因聚類(lèi)在一起，進(jìn)一步表明克隆獲得的基因確實(shí)為bgl基因。

2.2.3 纖維二糖酶的氨基酸序列分析 采用在線軟件對(duì)纖維二糖酶的氨基酸序列進(jìn)行分析（http：//web. expasy.org/protparam/），結(jié)果顯示，纖維二糖酶的蛋白質(zhì)理論分子量為93.33 kD；預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.70；分子式為C4153H6311N1117O1300S20；不穩(wěn)定系數(shù)為30.65，是物理性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；疏水性分析的GRAVY值為-0.357，該蛋白為親水蛋白。酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為99，堿性氨基酸（Arg+Lys）為64，表明其為酸性蛋白質(zhì)。20種氨基酸中甘氨酸（Gly）含量最高，為10.7%；丙氨酸（Ala）次之，為9.07%。

利用SignalP-NN軟件分析發(fā)現(xiàn)其1-20位氨基酸為該蛋白信號(hào)肽序列（圖3）。C score：酶切位點(diǎn)：數(shù)值越高說(shuō)明其作為酶切位點(diǎn)的可能性越高；S score：?jiǎn)伟被釘?shù)值：越高說(shuō)明該氨基酸作為信號(hào)肽部分的可能性越高；Y score：C值和S值的派生值，更準(zhǔn)確地確定酶切位點(diǎn)，數(shù)值最高處為酶切位點(diǎn)。

圖2 纖維二糖酶基因的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)

圖3 Bgl蛋白信號(hào)肽分析

2.2.4 纖維二糖酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 通過(guò)國(guó)際蛋白質(zhì)生物學(xué)和化學(xué)研究所（PBIL）在線分析網(wǎng)站對(duì)該基因進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。分析結(jié)果（圖4）表明，該蛋白質(zhì)富含無(wú)規(guī)卷曲（Random coil），含量高達(dá)60.35%；其次為α-螺旋（Alpha helix），含量為22.09%；而β-折疊（Extended strand）含量最低，只有17.56%。

圖4 纖維二糖酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.5 纖維二糖酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 利用自動(dòng)比較蛋白建模服務(wù)器SWISS-MODEL，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，從而預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖5）。該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與Aspergillus aculeatus的纖維二糖酶三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，相似度為83.10%，結(jié)果較可靠。

2.2.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析 經(jīng)過(guò)優(yōu)化條件，最終獲得目的蛋白最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為：30℃下用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h，SDSPAGE電泳（圖6）顯示，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為93.3 kD。通過(guò)Western blotting對(duì)重組蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，獲得目的條帶（圖7），再次說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白是纖維素酶Bgl。

2.2.7 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)重組纖維二糖酶的酶活 挑選酶活最高的重組酵母菌再進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h測(cè)定一次酶活，其產(chǎn)酶曲線見(jiàn)圖8。其纖維二糖酶活在連續(xù)誘導(dǎo)的前72 h一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，72 h以后便不再增長(zhǎng)，呈緩慢下降趨勢(shì)。

圖5 纖維二糖酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖6 重組質(zhì)粒蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

圖7 重組蛋白免疫印跡

圖8 重組纖維二糖酶酶活測(cè)定曲線

2.2.8 溫度和pH值對(duì)重組纖維二糖酶的影響 重組后的菌株誘導(dǎo)72 h后，在不同溫度反應(yīng)條件下測(cè)得酶活力。以溫度值為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)，作出溫度曲線（圖9），可以看出，纖維二糖酶的最適溫度為50℃。在最適溫度條件下（圖10），分別在pH4.0-7.0條件下測(cè)定重組纖維二糖酶的活力，該酶最適pH為5.0。

圖9 溫度對(duì)重組纖維二糖酶的影響

圖10 pH值對(duì)重組纖維二糖酶的影響

3 討論

纖維二糖酶是纖維素徹底降解為單糖的一個(gè)瓶頸［15］，采用基因工程與蛋白質(zhì)工程手段獲得酶活較高的纖維二糖酶已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)［16］。國(guó)外許多研究機(jī)構(gòu)正致力于纖維二糖酶的分子生物學(xué)研究，從基礎(chǔ)領(lǐng)域研究酶的催化機(jī)制及表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以期更好地改善纖維素酶的催化效率［17］。周曉明等［18］克隆了bgl基因，與黑曲霉已知序列同源性達(dá)到了99%；王冰冰等［19］克隆了纖維二糖酶基因，并且實(shí)現(xiàn)了在里氏木霉中的表達(dá)；朱龍寶等［20］在畢赤酵母中成功分泌表達(dá)了纖維二糖酶，蛋白酶活力達(dá)到38 U/mL。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚、操作手段較為成熟，并且大腸桿菌繁殖快、營(yíng)養(yǎng)要求低，表達(dá)的外源蛋白穩(wěn)定、易純化等特點(diǎn)，因此大腸桿菌在基因表達(dá)技術(shù)中應(yīng)用廣泛［21］。本研究為了獲取高產(chǎn)量的重組纖維素酶，并進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)、功能與結(jié)構(gòu)，將克隆到的纖維素酶基因與表達(dá)載體pEASY-T1構(gòu)建重組表達(dá)載體pEASYT-bgl，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到了重組工程菌，實(shí)現(xiàn)了bgl基因的胞內(nèi)融合表達(dá)。

1974年，Bause等［22］提出纖維二糖酶活性位點(diǎn)中的Asp是糖苷水解酶家族3的高度保守氨基酸，作為該酶的催化親和試劑，此位點(diǎn)以及周?chē)膸讉€(gè)氨基酸序列GFVMSDW等在糖苷水解酶家族3中也是高度保守的。大多數(shù)微生物所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶也屬于家族3的成員，糖苷水解酶家族3有A區(qū)和B區(qū)兩個(gè)域構(gòu)成，B區(qū)包括SDW序列，內(nèi)有活性為點(diǎn)Asp（D）殘基。在分子水平上，糖苷水解酶家族3的編碼基因有5個(gè)典型的區(qū)域構(gòu)成：N端區(qū)、N端催化區(qū)、非同源區(qū)、C端未知功能區(qū)和C端殘基［23］。本研究所得到的bgl的氨基酸序列也具有文獻(xiàn)提到這一特征，因此它屬于糖苷水解酶家族3的成員。

本研究構(gòu)建的工程菌酶活低于原菌株，可能因?yàn)闃?gòu)建的重組菌的表達(dá)產(chǎn)物為胞內(nèi)酶，而且本研究?jī)H在搖瓶做了初步實(shí)驗(yàn)，未對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度、金屬離子、溫度、pH值等影響目的基因表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化，也是影響重組蛋白表達(dá)和酶活力的原因之一。今后有必要對(duì)重組菌株的發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，為該基因的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)RT-PCR方法從菌株黑曲霉C112克隆了纖維素酶基因bgl，并測(cè)得了其核酸序列（GenBank登錄號(hào)KP307454）。序列分析表明bgl基因大小為2 934 bp，含有非編碼序列，編碼具有860個(gè)氨基酸分子的成熟纖維素酶，分子量大約為93.3 kD；二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲為結(jié)構(gòu)元件。該基因成功在大腸桿菌中進(jìn)行了胞內(nèi)融合表達(dá)，重組蛋白pNPG酶活最大為5.847 U/mL，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值為5.0；并且初步探索了誘導(dǎo)纖維素酶基因表達(dá)的條件，用1 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)重組菌3 h后能夠檢測(cè)到目的蛋白。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Bioinformatics Analysis of Cellobiase Gene from Aspergillus niger C112

ZHU Yong-rui ZENG Bai-quan ZENG Lei LIU Hui
（College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）

The cellobiase gene（GenBank accession number：KP307454）was cloned by RT-PCR from high-yield cellulase Aspergillus niger strain C112 mutated by UV. The whole length of cellobiase was 2 934 bp containing non-coding sequence， and encoding 860 amino acids with the pI of 4.70. The homology of nucleotide sequence with Aspergillus niger（GenBank accession number：JX982101.1）reached 99%. Bioinformatics analysis showed that cellobiase was a hydrophilic， stable， and secreted protein；its secondary structure consisted of the structural elements of α-helix， β-folding and random coil. As expected， recombinant fusion protein was expressed after IPTG induction， and the relative molecular mass was approximately 93.3 kD by SDS-PAGE. The fused β-Glucosidase was expressed in Escherichia coli BL21. The enzyme activity of recombinant protein pNPG was 5.847 U/mL， the optimal reaction temperature was 50℃， and the optimal reaction pH was 5.0.

Aspergillus niger C112；cellobiase；cloning；bioinformatics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.015

2015-04-30

湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A123），中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CX2014B30）

朱永瑞，男，碩士研究生，研究方向：微生物方面的基因克隆與表達(dá)研究；E-mail：1006398396@qq.com

曾柏全，博士，教授，研究方向：生物資源利用與分子技術(shù)；E-mail：baiquanzhn@163.com