辛美麗，宋愛環(huán)，王志剛，胡凡光，逄劭楠，孫福新

(山東省海洋生物研究院，山東青島　266104)

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芽孢桿菌組合對(duì)海水養(yǎng)殖水體COD的降解效果*

辛美麗，宋愛環(huán)，王志剛，胡凡光，逄劭楠，孫福新**

(山東省海洋生物研究院，山東青島266104)

【目的】獲得一種降解性能優(yōu)于單菌株的菌株組合，更好地改善目前工業(yè)化密度養(yǎng)殖的水體水質(zhì)。【方法】從刺參(Stichopus japonicus)養(yǎng)殖池塘分離降解效果良好的單菌株，根據(jù)菌株之間的拮抗效應(yīng)，按照2株菌或3株菌進(jìn)行組合，研究各組合菌株的降解效果。【結(jié)果】2株菌的組合第6天時(shí)COD含量的均值為422.57 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為63.85，3株菌的組合第6天時(shí)COD含量的均值為365.61 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為67.63，說明3株菌的組合整體降解效果比2株菌的組合好，且更容易獲得降解效率高的組合，但并不是所有3株菌的組合降解效果都優(yōu)于2株菌的組合?！窘Y(jié)論】確定最優(yōu)菌株組合為C14(菌株B2，菌株B6，菌株B11)，COD降解率為64.29%。經(jīng)鑒定，菌株B2為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，菌株B6為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，菌株B11為嗜堿性芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus),為今后的實(shí)踐應(yīng)用提供參考。

芽孢桿菌降解性能組合

0　引言

【研究意義】隨著工廠化密度養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，大量殘餌、糞便嚴(yán)重破壞了養(yǎng)殖水體水質(zhì)，從而造成養(yǎng)殖生物病害頻發(fā)。微生態(tài)制劑因其對(duì)水質(zhì)中有機(jī)質(zhì)及氨氮等降解效果良好，能增強(qiáng)養(yǎng)殖生物免疫力，并且無污染、無殘留等優(yōu)勢(shì)，逐漸被人們所接受并在各方面使用[1-4]。芽孢桿菌(Bacillus)的穩(wěn)定性使其廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究人員發(fā)現(xiàn)，用地衣芽孢桿菌(Bacillus lincheniformis)對(duì)草魚(Ctenopharyngodon idellus)進(jìn)行投喂，草魚的腸道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性都比對(duì)照組顯著提高[5-6]；應(yīng)用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，硝化細(xì)菌(Nitrifying bacteria)與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)于養(yǎng)殖水體中，對(duì)水體中的氨氮、有機(jī)質(zhì)、有機(jī)磷、亞硝態(tài)氮等有明顯的降低效果[7-10]。【本研究切入點(diǎn)】單一菌株的降解性能已無法滿足實(shí)際應(yīng)用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將刺參(Stichopus japonicus)養(yǎng)殖池塘中獲得的單菌株分別以2株菌或3株菌進(jìn)行組合，研究不同組合對(duì)COD的降解效果，以期獲得在COD降解方面優(yōu)于單菌株的菌株組合，對(duì)實(shí)踐應(yīng)用進(jìn)行一定程度的指導(dǎo)。

1　材料和方法

1.1材料

菌株來源：從即墨鹽廠刺參養(yǎng)殖池塘中分離得到16株芽孢桿菌(表1)，保種于-80℃冰箱中。使用前用滅菌的接種針接種于液體培養(yǎng)基，在28℃，160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，得到種子液。

固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3.5 g，氯化鈉5 g，溶于1 000 mL的海水中，調(diào)節(jié)pH值為8.2，并加入12 g瓊脂，121℃下滅菌15 min。

刺參餌料液體培養(yǎng)基：取20 g刺參餌料裝于1 L過濾海水中，靜置過夜，過濾，取濾液定容至1 L，在121℃下滅菌15 min。

1.2方法

1.2.1單菌株降解效果研究

將-80℃超低溫保存的16株菌活化劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水將平板菌落洗入滅菌的富集培養(yǎng)基，于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)2 d后，將菌株依次接種于裝有100 mL刺參餌料培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使菌株初始濃度都為1×106cfu/mL。于28℃下，160 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，每天記錄餌料中COD含量的變化。

表116株芽孢桿菌的來源

Table 1The resources of 16 bacterial strains

菌株Bacterialstrains來源ResourcesB1底泥SedimentB2底泥SedimentB3底泥SedimentB4糞便FecesB5糞便FecesB6糞便FecesB7糞便FecesB8腸道FecesB9腸道IntestinalB10腸道IntestinalB11腸道IntestinalB12腸道IntestinalB13腸道IntestinalB14水WaterB15水WaterB16水Water

1.2.2菌株拮抗效果研究

采用平板十字交叉劃線法,將降解效果良好的菌株培養(yǎng)于固體平板培養(yǎng)基中。28℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h后，查看其拮抗效果。

1.2.3組合菌株的降解效果研究

綜合考慮單菌株的降解效果及菌株間的拮抗作用，取2株菌或3菌株進(jìn)行組合，各菌株按照密度比1:1或1:1:1比例接種于刺參餌料培養(yǎng)基內(nèi)，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)使培養(yǎng)基中各組合菌體總濃度為1×106cfu/mL。在28℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，分別于第1天、第2天和第6天測(cè)定培養(yǎng)基中的COD含量。

1.2.4最優(yōu)組合菌株的鑒定

菌株生理生化指標(biāo)的測(cè)定：采用北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)菌株的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，具體操作方法參照說明書。按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

菌株16S rDNA序列分析：采用水煮法[12]提取細(xì)菌基因組DNA后，進(jìn)行擴(kuò)增，選擇正向引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(E.coli 27F)，反向引物:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′(E.coli 1492R)。PCR 產(chǎn)物(1.5 kb 左右)由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI庫(kù)中進(jìn)行Blast，得到與目標(biāo)菌株相似性高的序列，再用CLUSTAL X程序進(jìn)行比對(duì)，最后采用MEGA 4.1工具構(gòu)建Neighbor-Joining樹[13]。

綜合菌株的生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列分析，鑒定菌株。

2　結(jié)果與分析

2.1單菌株降解效果

從圖1可以看出，16株菌對(duì)于培養(yǎng)液中COD的降解均有明顯效果，菌株在第1～2天時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液中COD降解效果比較明顯，大部分菌株在第2天時(shí)，使培養(yǎng)液中COD含量達(dá)到相對(duì)比較低的點(diǎn)，少部分菌株在第3 天時(shí)達(dá)到這個(gè)低點(diǎn)。這應(yīng)該與菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期有關(guān)。到第6天時(shí)，對(duì)COD的降解趨于平穩(wěn)。在后續(xù)的試驗(yàn)時(shí)，選擇第2天與第6天作為取樣時(shí)間點(diǎn)。

圖116株菌株培養(yǎng)液中COD含量變化

Fig.1The change of COD content in culture solution with strain B1,strain B2,…stain B16

表2顯示，部分菌株在第2天時(shí)對(duì)于COD的降解能達(dá)到最終降解率的80%以上(B1，B2，B3，B6，B8)，部分菌株在第2天時(shí)達(dá)到最終降解率的50%以上(B4，B5，B7，B9，B12，B13，B15，B16)，從而看出菌株在液體培養(yǎng)基的擴(kuò)繁速率。對(duì)比菌株第6天和第1天的降解率，部分菌株(B3，B4，B5，B6，B7)降解率達(dá)50%以上，其中B7降解率最高為65.84%。綜合考慮菌株的生長(zhǎng)速率與第6天的降解率，最終確定初篩菌株B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B9，B11，B12進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2單菌株拮抗作用

根據(jù)表3結(jié)果，選取相互之間沒有生長(zhǎng)抑制作用的菌株進(jìn)行后期組合實(shí)驗(yàn)。

2.3組合菌株降解實(shí)驗(yàn)

綜合表2和表3的結(jié)果，對(duì)菌株進(jìn)行組合，具體設(shè)計(jì)見表4。從表5可以看出，并不是所有3株菌組合降解效果優(yōu)于2株菌組合。但2株菌組合第6天時(shí)COD含量的均值為422.57 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為63.85，3株菌組合第6天時(shí)COD含量的均值為365.61 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為67.63。這說明，3株菌組合的整體降解效果比2株菌組合的好，且更容易獲得降解效率高的組合。

表216株菌株的降解率(%)

Table 2The degradation rate of strain B1,strain B2,… strain B16(%)

編號(hào)Number降解率(第2天比第1天)Degradationrate(2dcomparisonof1d)降解率(第6天比第1天)Degradationrate(6dcomparisonof1d)B140.9337.88B242.0345.07B343.1550.66B435.9750.75B532.1354.65B640.6752.20B747.6165.84B830.9023.06B923.7238.49B1014.3844.44B1122.7748.45B1229.8442.00B1315.1931.44B1411.6228.66B1530.5442.25B1623.3134.05

表310株菌間拮抗作用結(jié)果

Table 3The antagonistic effect between 10 stains

編號(hào)NumberB1B2B3B4B5B6B7B9B11B12B1××××OOOOOB2O××O×OO×B3OOOOOO×B4OOOOO×B5××OO×B6OOOOB7OO×B9OOB11OB12

注：×代表有拮抗作用，O代表無拮抗作用

Note：× represents an antagonistic effect,O represents non antagonistic effect

表4菌株組合設(shè)計(jì)

Table 4The design of combinations of strains

組合編號(hào)Combinationnumber菌株組合Straincombination組合編號(hào)Combinationnumber菌株組合StraincombinationC1(B1,B6)C9(B2,B7)C2(B1,B7)C10(B1,B6,B7)C3(B1,B11)C11(B1,B6,B11)C4(B2,B6)C12(B1,B7,B11)C5(B2,B11)C13(B2,B6,B7)C6(B6,B7)C14(B2,B6,B11)C7(B6,B11)C15(B2,B7,B11)C8(B7,B11)

根據(jù)表6結(jié)果，確定最優(yōu)菌株組合為C14(B2，B6，B11)，COD降解率為64.29%。

2.4最優(yōu)組合菌株鑒定

2.4.1菌株的生理生化

結(jié)果顯示：菌株B2，革蘭氏陽性，有芽孢，桿狀，菌落圓形，邊緣不整齊，表面隆起呈白色，VP反應(yīng)陽性，接觸酶陽性，可水解淀粉；菌株B6，革蘭氏陽性，有芽孢，桿狀，菌落白色，邊緣整齊，表面光滑，凸?fàn)盥∑?，VP反應(yīng)陰性，可水解淀粉；菌株B11，革蘭氏陽性，有芽孢，桿狀，圓頭，菌落白色，表面粗糙，邊緣不整齊，接觸酶陽性，水解淀粉，VP反應(yīng)陽性。

表5組合菌株COD變化規(guī)律(mg/L)

Table 5Variation law of COD of combined strains

組合編號(hào)Combinationnumber第1天Thefirstday第2天Thesecondday第6天ThesixthdayC1639.74±8.13454.72±6.52536.26±36.87C2653.86±17.23481.38±8.97396.70±26.11C3666.40±35.76501.76±29.82392.00±78.54C4588.00±7.54650.72±33.45388.86±79.44C5642.88±6.09446.88±56.41512.74±56.90C6658.56±27.89492.00±33.17405.25±32.99C7680.51±28.91572.32±68.03445.31±42.79C8548.80±29.64495.49±77.85384.16±43.56C9611.52±30.76508.03±95.67341.82±44.75C10603.68±28.71434.34±24.54426.50±46.78C11611.52±18.91486.08±13.61373.18±47.10C12666.40±17.34404.54±35.72392.00±35.78C13635.04±24.55481.38±36.51363.78±45.60C14658.56±78.90580.16±15.62235.20±46.74C15620.93±56.83401.41±34.77402.98±5.98

表6菌株組合降解率(%)

Table 6The degradation rate of strain combinations

組合編號(hào)Combinationnumber降解率Degradationrate第2天比第1天2dcomparisonof1d第6天比第2天6dcomparisonof2d第6天比第1天6dcomparisonof1dC128.92-17.9316.18C226.3817.5939.33C324.7121.8841.18C4-10.6740.2433.87C530.49-14.7420.24C640.48-54.408.10C715.9022.1934.56C89.7122.4730.00C916.9232.7244.10C1028.051.8129.35C1120.5123.2338.97C1239.293.1041.18C1324.2024.4342.72C1411.9059.4664.29C1535.35-0.3935.10

2.4.2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖2可以看出，菌株B2與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的親緣關(guān)系最近，菌株B6與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的親緣關(guān)系最近，菌株B11與嗜堿性芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)的親緣關(guān)系最近。綜合考慮菌株的生理生化指標(biāo)結(jié)果，最終確定菌株B2為枯草芽孢桿菌，菌株B6為巨大芽孢桿菌，菌株B11為嗜堿性芽孢桿菌。

圖2菌株B2、B6、B11系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2The phylogenetic tree of strain B2,strain B6,strain B11

3　結(jié)論

單菌株對(duì)COD的降解與菌株的生長(zhǎng)曲線存在相關(guān)性，在第1～2天時(shí)，菌株處于對(duì)數(shù)期間，隨著菌濃度的直線增長(zhǎng)，COD的含量也直線下降，當(dāng)菌株達(dá)到穩(wěn)定期后，COD的含量變化也趨于平穩(wěn)。當(dāng)菌株達(dá)到衰亡期時(shí)，因細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累，死亡細(xì)胞裂解，造成培養(yǎng)基內(nèi)的COD含量升高。

不同菌株間存在拮抗作用，綜合考慮其拮抗作用及其降解特性進(jìn)行菌株組合設(shè)計(jì)，得到的結(jié)果顯示，并不是所有3株菌的組合降解效果優(yōu)于2株菌的組合，但2株菌的組合第6天時(shí)COD含量的均值為422.57 g/mL，標(biāo)準(zhǔn)差為63.85，3株菌的組合第6天時(shí)COD含量的均值為365.61 g/mL，標(biāo)準(zhǔn)差為67.63，這說明，3株菌的組合整體降解效果比2株菌的組合要好，且更容易獲得降解效率高的組合。

最終確定最優(yōu)菌株組合為C14(B2，B6，B11)，對(duì)COD降解率為64.29%。經(jīng)鑒定，菌株B2為枯草芽孢桿菌，菌株B6為巨大芽孢桿菌，菌株B11為嗜堿性芽孢桿菌，為今后在利用菌株組合進(jìn)行工廠化密度養(yǎng)殖水體水質(zhì)改善時(shí)，提供一定的參考和指導(dǎo)。

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(責(zé)任編輯：竺利波)

Study on COD Degradation Capability of Bacillus Combinations

XIN Meili,SONG Aihuan,WANG Zhigang,HU Fanguang,PANG Shaonan,SUN Fuxin

(Marine Biology Institute of Shandong Province,Qingdao,Shandong,266104,China)

【Objective】To improve the water quality in high stocking density of industrial aquaculture,a kind of strain combination,with degradation capability better than single strain,was found.【Methods】Several bacterial strains with good degradation property were separated from Stichopus japonicus culture ponds.Antagonistic effect between strains was studied.According to the results of the antagonistic effect,the degradation capability of COD of the combinations of 2 or 3 strains were studied.【Results】The mean COD of the combinations of two strains at the 6th day was 422.57 mg/mL,and standard deviation was 63.85.The mean COD of the combinations of three strains at the 6th day was 365.61 g/mL and the standard deviation was 67.63.The results showed that combinations of three strains compared to combinations of two strains were easier to get a combination with better degradation efficiency.【Conclusion】Finally,the optimal combination was C14(strain B2,strain B6,strain B11) with COD degradation rate of 64.29%.The strain B2,strain B6 and strain B11 were separately identified as Bacillus subtilis,Bacillus megaterium and Bacillus alcalophilus.The result was a reference for future applications of strains.

Bacillus，degradation capability，combination

2016-04-10

辛美麗(1985-)，女，助理研究員，主要從事海藻生物學(xué)研究。

S968.9

A

1002-7378(2016)03-0215-06

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間:2016-08-26【DOI】10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20160826.008

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20160826.1048.016.html

*海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201305005)和海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目資助。

**通訊作者：孫福新(1960-)，男,研究員，主要從事海水健康養(yǎng)殖技術(shù)，水產(chǎn)優(yōu)良品種引進(jìn)、選育及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)技術(shù)，海洋生態(tài)環(huán)境修復(fù)與保護(hù)技術(shù)研究，E-mail：sunfx817@163.com。