周　皓　張紹仁　劉紅燕

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院消化內(nèi)科(201508)

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MicroRNA-21通過PTEN/Akt通路介導(dǎo)前列腺素E2促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖*

周皓張紹仁劉紅燕#

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院消化內(nèi)科(201508)

背景：已有研究證實(shí)前列腺素E2(PGE2)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，microRNA-21(miR-21)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但信號通路尚不明確。目的：探討miR-21介導(dǎo)PGE2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的潛在作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)胃癌AGS細(xì)胞，分為對照組、PGE2組、anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組，以WST-1比色法檢測細(xì)胞生存率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法檢測miR-21 mRNA表達(dá)。以Akt特異性抑制劑哌立福辛干預(yù)AGS細(xì)胞，檢測其對細(xì)胞增殖的影響，蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN/Akt蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，PGE2組AGS細(xì)胞生存率顯著升高(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，miR-21 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與PGE2組相比，anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組細(xì)胞生存率顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，miR-21 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。以哌立福辛干預(yù)后，AGS細(xì)胞生存率顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，PTEN蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論：miR-21通過PTEN/Akt通路介導(dǎo)了PGE2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用，可能成為防治胃癌的新靶點(diǎn)。

微RNAs；胃腫瘤；前列腺素E類；PTEN/Akt通路

Background: Prostaglandin E2(PGE2) could promote the proliferation of tumor cells, microRNA-21 (miR-21) could inhibit the proliferation of tumor cells, but its signal pathway is still unclear. Aims: To investigate the mechanism of PGE2on promoting proliferation of gastric cancer cells potentially mediated by miR-21. Methods: Gastric cancer AGS cells were cultured and divided into control group, PGE2group, anti-miR-21 group and PGE2+anti-miR-21 group. Cell proliferation was determined by WST-1 chromatometry. Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry. The expression of miR-21 mRNA was detected by RT-PCR. After AGS cells were intervened by Akt specific inhibitor perifosine, cell proliferation was assessed, and expression of PTEN/Akt protein was detected by Western blotting. Results: Compared with control group, survival rate of AGS cells was significantly increased (P<0.05), apoptosis rate was significantly decreased (P<0.05), and expression of miR-21 mRNA was significantly increased in PGE2group (P<0.05). Compared with PGE2group, survival rate of AGS cells was significantly decreased (P<0.05), apoptosis rate was significantly increased (P<0.05), and expression of miR-21 mRNA was significantly decreased in anti-miR-21 group and PGE2+anti-miR-21 group (P<0.05). After intervention with perifosine, survival rate of AGS cells was significantly decreased (P<0.05), apoptosis rate was significantly increased (P<0.05), expression of PTEN protein was significantly increased, and expression of p-Akt protein was significantly decreased. Conclusions: MiR-21 mediates the promoting of proliferation of gastric cancer cells by PGE2through PTEN/Akt pathway, which might become a new target for the prevention and treatment of gastric cancer.

胃癌是目前嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其特點(diǎn)是病情進(jìn)展快、預(yù)后差、五年生存率較低[1-2]。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡[3]、促進(jìn)腫瘤侵襲和血管形成以及逃避免疫監(jiān)視等途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用。MicroRNA(miR)是一類長度為17～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在生物體的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[4]。目前發(fā)現(xiàn)miR-21幾乎在所有腫瘤中均高表達(dá)，通過抑制多種與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲相關(guān)的抑癌基因而發(fā)揮作用[5-6]。有研究證實(shí)miR-21是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵癌基因[7]。本研究通過探討miR-21在胃癌細(xì)胞生長增殖中的作用及其可能機(jī)制，旨在為miR-21的基礎(chǔ)研究和胃癌的分子生物學(xué)治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、研究資料

人胃腺癌細(xì)胞株AGS購自美國ATCC細(xì)胞庫(ATCC?CRL-1739TM)。人細(xì)胞因子PGE2、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購自上海寧盛生物科技有限公司。Anti-miR-21寡核苷酸序列由美國ABI公司設(shè)計(jì)并合成。PTEN/Akt單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。p-Akt單克隆抗體、Akt特異性抑制劑哌立福辛均購自Cell Signaling Technology公司。PCR引物miR-21、U6特異性探針引物由ABI公司合成，其余引物由Invitrogen公司合成。TaqMan MicroRNA檢測試劑盒購自ABI公司。蛋白marker購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。WST-1購自碧云天生物技術(shù)公司。

二、研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：AGS細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。以0.25%胰酶消化，按1∶3的細(xì)胞比例傳代，每三天傳代一次。

2. 接種細(xì)胞：取對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔2×105個(gè)的密度接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

3. 實(shí)驗(yàn)分組：①將AGS細(xì)胞分為對照組(不作任何處理)、PGE2(5 μmol/L)組、anti-miR-21組、PGE2(5 μmol/L)+anti-miR-21組，用于研究PGE2和anti-miR-21干預(yù)對AGS細(xì)胞增殖的影響；②將AGS細(xì)胞分為對照組(不作任何處理)、PGE2組、PGE2+哌立福辛(10 μmol/L)組、PGE2+anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛(10 μmol/L)組，用于研究哌立福辛對AGS細(xì)胞增殖的作用。

4. WST-1比色法檢測細(xì)胞生存率：將1 mL電子耦合試劑加入WST-1粉末中，完全溶解，配制成WST-1溶液，4 ℃避光保存。每孔96孔板中加入10 μL WST-1溶液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。96孔板置于搖床搖動(dòng)1 min。以空白孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm波長處的每孔吸光度(A)值，細(xì)胞生存率(%)=處理孔A值/對照孔A值×100%。同一處理組設(shè)置6個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

5. 流式細(xì)胞儀檢測AGS細(xì)胞凋亡：收集各組AGS細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

6. RT-PCR法檢測miR-21表達(dá)：Trizol抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR反應(yīng)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；4 ℃ 10 min。Pri-miR-21引物：正向：5’-TTT TGT TTT GCT TGG GAG GA-3’，反向：5’-AGC AGA CAG TCA GGC AGG AT-3’。以RNU6B作為內(nèi)參，正向：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TG-3’。以miR-21表達(dá)量與內(nèi)參的比值作為miR-21相對表達(dá)量。

7. 蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN/Akt蛋白表達(dá)：哌立福辛干預(yù)48 h后，抽提各組細(xì)胞總蛋白，BCA法行蛋白定量。以β-actin作為內(nèi)參照，每孔加入樣品蛋白30 μg，行SDS-PAGE電泳，經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移，封閉2 h。一抗分別加入β-actin多克隆抗體(工作濃度1∶1 000)、PTEN(工作濃度1∶2 000)、Akt(工作濃度1∶1 000)、p-Akt抗體(工作濃度1∶1 000)，4 ℃冰箱孵育或搖床過夜。二抗加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體(工作濃度1∶10 000)，孵育2 h。X線曝光、顯影、定影，掃描后進(jìn)行圖像處理與分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、細(xì)胞生存率

PGE2和anti-miR-21干預(yù)48 h后，與對照組相比，PGE2組AGS細(xì)胞生存率顯著升高(P<0.05)，anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組顯著降低(P<0.05)。與PGE2組相比，anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組AGS細(xì)胞生存率顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1　PGE2和anti-miR-21干預(yù)對胃癌細(xì)胞增殖的影響

△與對照組比較，P<0.05；#與PGE2組比較，P<0.05

二、細(xì)胞凋亡率

與對照組相比，PGE2組AGS細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組顯著升高(P<0.05)。與PGE2組相比，anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組AGS細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖1)。

三、miR-21 mRNA表達(dá)

與對照組相比，PGE2組miR-21 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組顯著下降(P<0.05)。與PGE2組相比，anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組miR-21 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)(圖2)。

*與對照組比較，P<0.05；#與PGE2組比較，P<0.05

四、PTEN/Akt通路與AGS細(xì)胞生長的關(guān)系

與對照組相比，PGE2組PTEN蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，p-Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；與PGE2組相比，PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組PTEN蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，PGE2+anti-miR-21組p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組未能檢測出p-Akt蛋白表達(dá)(圖3)。

與對照組相比，PGE2組AGS細(xì)胞生存率顯著升高(P<0.05)，PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組顯著降低(P<0.05)。與PGE2組相比，PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組AGS細(xì)胞生存率均顯著下降(P<0.05)。PGE2+anti-miR-21組AGS細(xì)胞生存率與PGE2+哌立福辛組相比無明顯差異(P>0.05)(表2)。

圖3　各組AGS細(xì)胞PTEN/Akt蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

組別A值(x±s)生存率(%)對照組1.102±0.034100PGE2組1.423±0.018*129.13PGE2+anti-miR-21組0.748±0.037*#77.49PGE2+哌立福辛組0.876±0.018*#82.56PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組0.685±0.041*#57.06

*與對照組比較，P<0.05；#與PGE2組比較，P<0.05

五、哌立福辛干預(yù)后細(xì)胞凋亡情況

與對照組相比，PGE2組AGS細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組顯著升高(P<0.05)。與PGE2組相比，PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組和PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組AGS細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖4)。

圖1　各組AGS細(xì)胞凋亡結(jié)果(流式細(xì)胞術(shù))

圖4　哌立福辛干預(yù)48 h后各組AGS細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞術(shù))

討　　論

胃癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜， 其病理生理過程涉及多種細(xì)胞與細(xì)胞因子之間的相互作用。來源于花生四烯酸的脂質(zhì)介質(zhì)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的信號分子，可通過環(huán)氧合酶(cyclooxygenase, COX)轉(zhuǎn)化為各種PG而發(fā)揮相關(guān)的生物學(xué)功能，其同工酶主要為COX-1和COX-2[8]。已有研究證實(shí)COX-2為早期瞬時(shí)表達(dá)基因，在生理情況下不表達(dá)，而在炎癥和腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)[9]。研究[10-11]表明COX-2在各種癌前病變和腫瘤中的表達(dá)顯著增高，并與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。COX-2的作用主要是通過其代謝產(chǎn)物PGE2來實(shí)現(xiàn)的，后者通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡、增加腫瘤侵襲和血管形成以及減少免疫監(jiān)視功能而與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段密切相關(guān)。

計(jì)春燕等[12]的研究證實(shí)COX-2/PGE2通路在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGE2作用于AGS細(xì)胞48 h后，生存率為151.9%，細(xì)胞凋亡率僅為0.5%；anti-miR-21干預(yù)后細(xì)胞生存率為51.9%，細(xì)胞凋亡率高達(dá)47.2%；PGE2+anti-miR-21聯(lián)合干預(yù)后細(xì)胞生存率為75.2%，細(xì)胞凋亡率為8.2%；PGE2組、anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且PGE2+anti-miR-21組與PGE2組相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證實(shí)PGE2能促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖，而anti-miR-21可減弱PGE2對AGS細(xì)胞增殖的刺激作用，miR-21可能介導(dǎo)了PGE2對AGS細(xì)胞增殖的刺激作用。

miR由70～90個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾狀單鏈RNA前體經(jīng)Dicer酶加工而成，可調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)或翻譯，在生物體的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要生理作用[13]。Song等[14]的研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清miR-21水平與腫瘤大小相關(guān)。Ishiguro等[15]指出，胃癌和非胃癌患者的胃組織中存在miR-21高表達(dá)。Zhang等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-21表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與腫瘤分化、局部侵襲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示PGE2組miR-21 mRNA表達(dá)較對照組顯著升高(P<0.05)，PGE2+anti-miR-21組miR-21 mRNA表達(dá)較PGE2組顯著下降(P<0.05)，提示miR-21可能參與了PGE2介導(dǎo)的促AGS細(xì)胞增殖作用。

為進(jìn)一步了解miR-21介導(dǎo)的PGE2刺激AGS細(xì)胞增殖作用與PTEN/Akt信號通路是否相關(guān)，本研究對Akt特異性抑制劑哌立福辛干預(yù)AGS細(xì)胞后PTEN/Akt蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示PGE2組PTEN蛋白表達(dá)較對照組下調(diào)，p-Akt蛋白表達(dá)較對照組上調(diào)。PGE2+anti-miR-21組PTEN蛋白表達(dá)較PGE2組上調(diào)，p-Akt蛋白表達(dá)較PGE2組下調(diào)，提示PTEN/Akt參與了miR-21對PGE2促AGS細(xì)胞增殖作用的調(diào)節(jié)。哌立福辛干預(yù)后，PGE2對AGS細(xì)胞的促增殖作用減弱，間接提示miR-21通過PTEN/Akt介導(dǎo)了PGE2對AGS細(xì)胞的促增殖作用。Yang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-21表達(dá)后，PTEN表達(dá)上調(diào)，提示PTEN可作為控制胃癌發(fā)生、發(fā)展的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究證實(shí)PGE2可促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖，miR-21可能參與了PGE2促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖作用的調(diào)節(jié)，而這一調(diào)節(jié)作用可能與PTEN/Akt通路有關(guān)。需開展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討miR-21對胃癌的作用及其機(jī)制，為胃癌的防治提供新的生物學(xué)靶點(diǎn)。

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(2016-03-02收稿；2016-03-15修回)

MicroRNA-21 Mediates the Promoting of Proliferation of Gastric Cancer Cells by Prostaglandin E2through PTEN/Akt Pathway

ZHOU Hao, ZHANG Shaoren, LIU Hongyan.

Department of Gastroenterology, Jinshan Hospital of Fudan University, Shanghai (201508)Correspondence to: LIU Hongyan, Email: Liuhy1320@163.com

MicroRNAs;Stomach Neoplasms;Prostaglandins E;PTEN/Akt Pathway

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.007

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院院級課題(2013-院743)

#本文通信作者，Email: Liuhy1320@163.com