潘　偉　趙　娟　楊澤福　羅韶金　黃景文

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院心內(nèi)科，2超聲科，廣東 佛山 528200)

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·臨床研究·

心臟擴(kuò)大患者血漿微RNA-30a表達(dá)的變化

潘偉1*趙娟2楊澤福1羅韶金1黃景文1

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院心內(nèi)科，2超聲科，廣東 佛山 528200)

目的:探討心臟擴(kuò)大患者血漿中微RNA(miR)-30a表達(dá)變化。方法：將2014年1月至2014年12月本院208例患者按心臟超聲檢查結(jié)果分為心臟擴(kuò)大組(n=112)、心臟腔室大小正常組(n=96)。RT -PCR法檢測(cè)miR-30a含量。比較兩組患者血漿miR-30a水平并應(yīng)用相關(guān)分析探討miR-30a水平與左室舒張期末內(nèi)徑(LVDd)和左心房?jī)?nèi)徑(LA)的關(guān)系。結(jié)果:與心臟正常組相比，心臟擴(kuò)大組血漿miR-30a水平明顯升高，miR-30a與LVDd、LA呈正相關(guān)(R=0.657、0.516，均P=0.000)。結(jié)論:血漿miR-30a可作為心臟重構(gòu)的潛在標(biāo)志物。

心臟擴(kuò)大；微RNAs；超聲檢查，多普勒，彩色

微RNA(miR)可以調(diào)控靶基因而在疾病的發(fā)生發(fā)展中起作用，目前報(bào)道的miR有1.8萬(wàn)多個(gè)[1]。近年來(lái)，對(duì)miR-30的研究涉及廣泛。目前報(bào)道的人類(lèi)和褐家鼠miR-30家族有miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d和miR-30e 6個(gè)亞型。我們前期的研究顯示，miR-30a下調(diào)引起的心肌自噬過(guò)度激活介導(dǎo)了心臟重構(gòu)[2]。我們擬觀察心臟擴(kuò)大患者外周血漿 miR-30a水平的變化，以為進(jìn)一步觀察血漿miR-30a的變化是否能預(yù)測(cè)心衰患者的預(yù)后。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

2014年1月至2014年12月208例收住本院心血管內(nèi)科的住院患者，年齡55～82歲。包括高血壓、冠心病、擴(kuò)張型心肌病、風(fēng)心病、心力衰竭和糖尿病。按心臟超聲分為心臟擴(kuò)大組112例、心臟腔室大小正常組96例。心臟擴(kuò)大入選標(biāo)準(zhǔn)：男性左室舒張期末內(nèi)徑(LVDd)>55 mm，女性LVDd>50 mm；左心房?jī)?nèi)徑(LA)>30 mm。心臟腔室大小正常組患者男性LVDd<55 mm，女性LVDd<50 mm； LA<30 mm。心臟擴(kuò)大及心臟腔室大小正常組均剔除：腫瘤、急性期感染、帕金森病、特發(fā)性肺纖維化、休克、肝硬化等近期應(yīng)用過(guò)干擾素、苯巴比妥。

1.2方法

所有入選患者完善一般臨床資料，次日空腹采血，空腹時(shí)EDTA 抗凝管收集全血，獲取血漿，檢測(cè)miR-30a。血清酸、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、血糖等采用檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。由專(zhuān)人質(zhì)控。心臟超聲檢查由富有經(jīng)驗(yàn)的超聲醫(yī)師完成，并測(cè)定LVDd、LA。

1.2.1檢測(cè)miR-30a 血漿標(biāo)本收集用EDTA抗凝管收集3 mL全血，室溫放置1～2 h。1 600 ×g，4 ℃，15 min離心。獲取上層的血漿。12 000 ×g，4 ℃，15 min離心。獲取上清放在-80 ℃保存。

1.2.2血漿miR-30a 檢測(cè) 取300 μL血漿加入1.2 mL TRIzol LS Reagent溶液(美國(guó)Invitrogen)及2 μL人工合成的cel-miR-39(1 nmol/L)(美國(guó)Invitrogen)作為內(nèi)參，迅速震蕩搖勻 30 s，再加入200 μL氯仿，強(qiáng)烈震蕩20 s后靜置3 min。室溫14 000 ×g離心10 min 。獲取上層水層。加入10 μL SiO2吸附液，混勻，14 000 ×g離心5 min。棄上清，加入75%乙醇400 μL，14 000 ×g 離心5 min。棄上清，風(fēng)干5 min，加入25 μl DEPC水溶解。10 mmol/L dNTP 、RNase抑制劑、miR-30a反轉(zhuǎn)錄引物(美國(guó)Invitrogen)、cel-miR-39反轉(zhuǎn)錄引物(美國(guó)Invitrogen)、5×buffer、M-MLV 加入到上溶液中，混勻后42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育10 min。采用SYBR Green PCR Master Mix(日本 TOYOBO)進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-30a正向引物：5’ACACTCCAG-CTGGGTGTAAACATCCTCGACTG 3’；cel-miR-39：5’ACACTCCAGCTGGGTCACCGGGTGTAAATCAGCT 3’;miRNA反向引物：5’ CTCAACTGGTGTCGTGGA 3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定擴(kuò)增的片段大小與目的基因相一致。熔解曲線呈單峰。PCR每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)熒光定量PCR檢測(cè)，曲線一致。結(jié)果取平均值。經(jīng)熒光信號(hào)理論方程推導(dǎo)出基因表達(dá)量計(jì)算公式，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔct。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1兩組臨床基線資料比較

對(duì)照組與心臟擴(kuò)大組兩組臨床基線指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2心臟擴(kuò)大患者血漿miR-30a表達(dá)的變化

對(duì)照組與心臟擴(kuò)大組LA、LVDd、miR-30a經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，兩組資料均為正態(tài)資料。與對(duì)照組比較，心臟擴(kuò)大組患者LA、LVDd、miR-30a升高(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1　一般資料比較

表2　心臟擴(kuò)大患者心臟內(nèi)經(jīng)與miR-30a表達(dá)的變化±s)

2.3血漿miR-30a與心臟大小的相關(guān)性

將血漿miR-30與LA、LVDd行Pearson相關(guān)性分析，miR-30與LA、LVDd均正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R值分別為0.516、0.657(均P<0.05)。

3　討　論

在各種病理刺激下，心臟出現(xiàn)實(shí)質(zhì)和間質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，如心肌細(xì)胞肥厚、心臟間質(zhì)纖維化等，稱(chēng)為心臟重構(gòu)。心臟重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制。臨床表現(xiàn)主要為心臟擴(kuò)大[3]。而血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在心臟重構(gòu)中扮演重要的角色[3]。但關(guān)于AngⅡ通過(guò)哪種途徑導(dǎo)致心臟重構(gòu)的研究很少。

我們的前期研究顯示心臟重構(gòu)大鼠心臟組織miR-30a下調(diào)。AngⅡ可通過(guò)下調(diào)心臟組織miR-30a的表達(dá)導(dǎo)致心臟重構(gòu)[2]。另一項(xiàng)研究同樣證實(shí)miR-30在心臟重構(gòu)中起作用[4-5]。而臨床患者重構(gòu)的心臟組織標(biāo)本難以獲取。我們推測(cè)外周循環(huán)血miR-30a可能能夠反映心臟重構(gòu)的變化。故我們?cè)谠擁?xiàng)進(jìn)一步的臨床研究中觀察心臟擴(kuò)大患者血漿miR-30a的變化。我們的研究結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，心臟擴(kuò)大患者血漿miR-30a升高。而在我們前期的研究中，重構(gòu)后的心臟組織miR-30a下調(diào)[2]。這種重構(gòu)后的心臟組織miR-30a水平與血漿miR-30a水平相背離的現(xiàn)象，我們認(rèn)為可能與心臟擴(kuò)大時(shí)心臟組織miR-30a釋放到外周循環(huán)血所致。關(guān)于這個(gè)假設(shè)的驗(yàn)證和miR-30a的轉(zhuǎn)移途徑值得進(jìn)一步研究。而且，血漿miR-30a升高能否預(yù)測(cè)心臟重構(gòu)，有待進(jìn)一步臨床研究證實(shí)。

心臟重構(gòu)主要表現(xiàn)為左心房和左心室的重構(gòu)[6]。我們?cè)撗芯繑?shù)據(jù)顯示左心房與左心室內(nèi)徑與血漿miR-30a均正相關(guān)。其原因?yàn)樾氖一蛘咝姆咳莘e擴(kuò)大為AngⅡ介導(dǎo)引起，而AngⅡ可刺激心臟組織miR-30a的分泌，并有可能向外周循環(huán)血釋放。而左心房與左心室內(nèi)徑能預(yù)測(cè)患者的預(yù)后[7]。那么，血漿miR-30a有可能預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。評(píng)估心臟重構(gòu)的傳統(tǒng)檢測(cè)手段有超聲心動(dòng)圖、心電圖描記和心臟磁共振成像。這些檢測(cè)手段獲取反映心臟重構(gòu)臨床參數(shù)的靈敏度有待提高，而且超聲心動(dòng)圖和磁共振成像的醫(yī)療較高。血漿miR-30a的變化可能更靈敏地反映患者的心臟重構(gòu)。

本研究檢測(cè)血漿miR-30a 應(yīng)用的是染料法，而國(guó)外文獻(xiàn)大部分是用TaqMan法，后者更加準(zhǔn)確，但費(fèi)用較前者高。

綜上所述，心臟擴(kuò)大組患者血漿miR-30a較心臟正常組明顯升高。 血漿miR-30a與心臟擴(kuò)大相關(guān)。血漿miR-30a水平的改變可能預(yù)測(cè)心臟重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生，有可能預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

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(本文編輯:劉新艷)

Change of plasma micro RNA-30a expression in patients with cardiomegaly

PanWei1*,ZhaoJuan2,YangZefu1,LuoShaojin1,HuangJingwen1

(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofUltrasound,NanhaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Foshan,Guangdong528200,China)

*Correspondingauthor:Email：weipan1977@163.com

Objective:To investigate change of plasma micro RNA-30a (miR-30a) expression in patients with cardiomegaly. Methods:According to the findings of echocardiography,208 patients hospitalized in our hospital between January 2014 and December 2014 were divided into cardiomegaly group (n=112) and normal heart chamber size group (n=96). The content of miR-30a was measured by RT-PCR assay. The levels of plasma miR-30a between the two groups were compared. The correlation between miR-30a level and left ventricular end-diastolic diameter (LVDd)/left atrial (LA) diameter was determined. Results:Compared with normal heart chamber size group,the plasma miR-30a level in the cardiomegaly group was significantly increased,which was positively correlated with LVDd and LA (R=0.657 and 0.516,allP=0.000). Conclusion:Plasma miR-30a can be used as a potential marker for cardiac remodeling.

cardiomegaly; micro RNAs; ultrasonography,doppler,color

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.02.011

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2014712)

Email：weipan1977@163.com

R541.6

A

2095-9664(2016)02-0042-03

2016-02-02)