王純忠　楊邵宇　肖慧蓮　劉麗娜　王桂平*

(1廣州市第一人民醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 510380；2廣州醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院系統(tǒng)生物與腫瘤研究中心，廣東 廣州 510180)

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·論著·

白藜蘆醇的抗結(jié)腸癌作用及其機(jī)制研究

王純忠1楊邵宇1肖慧蓮1劉麗娜2王桂平2*

(1廣州市第一人民醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 510380；2廣州醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院系統(tǒng)生物與腫瘤研究中心，廣東 廣州 510180)

目的:觀察白藜蘆醇對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長抑制作用，并探討其作用機(jī)制。方法：采用CCK-8試劑盒評價(jià)白藜蘆醇對SW480細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測白藜蘆醇對SW480細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡影響；通過TarFisDock分子對接分析工具，對白藜蘆醇可能作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果：白藜蘆醇可明顯抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的生長，白藜蘆醇作用24 h時(shí)，其IC50值為191.5 μmol/L；而48 h時(shí)的IC50值為117.6 μmol/L。流式分析顯示，白藜蘆醇可使SW480細(xì)胞阻滯于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。靶點(diǎn)預(yù)測分析篩選到10個(gè)白藜蘆醇作用候選靶點(diǎn)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶8(MMP8)、人組蛋白脫乙酰化酶2(HDAC2)、乙酰膽堿酯酶等3個(gè)靶點(diǎn)可能是白藜蘆醇抗結(jié)腸癌的新靶點(diǎn)。結(jié)論：白藜蘆醇具有良好的抗結(jié)腸癌效應(yīng)，可能成為結(jié)腸癌治療的新的候選藥物或增敏劑。

白藜蘆醇；結(jié)腸腫瘤；SW480細(xì)胞；生長抑制

結(jié)腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤之一。在西方發(fā)達(dá)國家,結(jié)直腸癌是僅次于肺癌的第二位惡性腫瘤；而在發(fā)展中國家，結(jié)腸癌發(fā)病也居前5。近20年來，由于人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率有明顯上升趨勢，嚴(yán)重危害人類健康。因此，尋找新的、高效低毒的新型治療藥物或化療增效劑，對改善結(jié)腸癌的治療具有重要意義[1]。白藜蘆醇屬于多酚類化合物，廣泛存在于葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物中，特別是紅葡萄酒中含量最多。目前研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有豐富的藥理活性，涉及退燒與止痛、抗癌作用、心血管保護(hù)作用、抗血栓功能、抗氧化及抗菌作用等。近些年，白藜蘆醇已成為國際腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，它對乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、白血病等多種惡性腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用[2-3]。本項(xiàng)目主要觀察白藜蘆醇對結(jié)腸癌細(xì)胞株 (SW480)生長的影響，及探討白藜蘆醇的抗癌機(jī)制，為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480由本實(shí)驗(yàn)室保存，采用含10%胎牛血清(FBS，杭州四季青)、雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)的RPMI1640培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，以0.25%的胰蛋白酶消化傳代，約3 d傳代 1次。Sunrise酶標(biāo)儀(美國Tecan)、96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板(美國Corning)、XDS-1B倒置相差顯微鏡(中國重慶)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Forma)。白藜蘆醇(美國Sigma)，采用二甲基亞砜(美國DMSO)進(jìn)行溶解，配制成320 μmol/L的母液備用，DMSO的濃度小于0.1%。CCK8購自廣州安邦生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，按5×105/L密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL(邊緣孔用無菌PBS填充)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。隨機(jī)分7組，即DMSO組和不同濃度稀釋的白藜蘆醇組(10、20、40、80、160和320 μmol/L)，每組3個(gè)復(fù)孔。藥物處理24或48 h后,每孔加入CCK8試劑20 μL，37 ℃孵育1 h，采用酶標(biāo)儀(450 nm波長)測定各孔A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞抑制率[抑制率=(1-處理組A值/對照組A值)×100%]，并繪制抑制曲線。

1.2.2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測取指數(shù)生長期的癌細(xì)胞，按1×106/mL濃度接種于6孔培養(yǎng)板，置37 ℃，5%班CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。對照組加入含有DMSO的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加80和160 μmol/L 白藜蘆醇，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，加入70%冰乙醇5 mL混勻固定，4 ℃放置24 h以上。最后加入50 mg/L溴化乙啶(PI)，100 mg/L RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光染色30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡檢測方法同上，在加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL PI，混勻；室溫、避光、反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.2.3藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測分析TarFisDock(http://www.dddc.ac.cn/tarfisdock/)是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)平臺的在線藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測分析平臺[4]。該數(shù)據(jù)平臺采用的是分子對接原理，是將已知三維結(jié)構(gòu)的分子入到靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫中，通過不斷優(yōu)化受體化合物的位置、構(gòu)象、分子內(nèi)部可旋轉(zhuǎn)鍵的二面角和受體的氨基酸殘基側(cè)鏈和骨架， 尋找檢測分子與靶標(biāo)大分子作用的最佳構(gòu)象，篩選出最佳的配體。本研究按TarFisDock操作指南，對白藜蘆醇的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。首先，在drugbank(http://www.drugbank.ca) 獲得白藜蘆醇的二維或三維結(jié)構(gòu)，并加入電子，將其轉(zhuǎn)變?yōu)閙ol2分子，然后輸入到TarFisDock進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測分析，按結(jié)合能量分?jǐn)?shù)排列，篩選排序前2%的靶點(diǎn)，并刪除相關(guān)疾病的明確的及重復(fù)的靶點(diǎn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1白藜蘆醇對SW480細(xì)胞的生長抑制作用

在低劑量時(shí)(10、20 μmol/L)，白藜蘆醇對SW480細(xì)胞的抑制作用不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。但在其他劑量點(diǎn)，白藜蘆醇對SW480細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，并且在不同時(shí)間點(diǎn)(24和48 h)，白藜蘆醇對SW480的抑制作用也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)。白藜蘆醇作用24 h時(shí)，其IC50值為191.5 μmol/L；而48 h時(shí)的IC50值為117.6 μmol/L。見圖1。

100806040200抑制率(%)1020408016032024h48h24h:IC50=191.5μmol/L48h:IC50=117.6μmol/L濃度(μmol/L)

注：與24 h比較，*P<0.05

圖1CCK-8法檢測白藜蘆醇對SW480細(xì)胞生長的抑制作用

2.2白藜蘆醇對SW480細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡影響

與對照相比，白藜蘆醇可使 G1期細(xì)胞比例升高，特別是高劑量組(200 μmol/L)尤為明顯，200 μmol/L 白藜蘆醇劑量組的G1期細(xì)胞由(68.46±0.44)%提高(87.84±1.67)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本項(xiàng)目結(jié)果提示白藜蘆醇可阻滯SW480細(xì)胞G1期進(jìn)展，見圖2。細(xì)胞凋亡研究表明，不同劑量白藜蘆醇均不同程度誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡。對照組細(xì)胞總凋亡率為(1.85±0.35)%，白藜蘆醇處理24 h后，100 μmol/L和200 μmol/L 白藜蘆醇劑量組總凋亡率升高至(3.25±0.23)%和(3.92±0.43)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖3。

150012005004000150012005004000150012005004000100806040200G1G2S*細(xì)胞數(shù)30609012015003060901201500DNA3060901201500200μmol/L抑制率(%)細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)100μmol/L白藜蘆醇對照組DNA200μmol/L白藜蘆醇DNA對照組100μmol/L白藜蘆醇

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇對SW480細(xì)胞周期的影響

2.3白藜蘆醇 作用靶位預(yù)測分析

TarFisDock由中國科學(xué)院上海藥物研究所開發(fā)，是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的藥物靶位尋找的平臺，具有較高的準(zhǔn)確性。本項(xiàng)目采用TarFisDock在線分析工具，對白藜蘆醇的作用靶點(diǎn)進(jìn)行初步預(yù)測分析，見表1。按結(jié)合的能量排序，輸入排列前2%的結(jié)果，計(jì)22個(gè)候選靶點(diǎn)，刪除相關(guān)疾病不明確的及重復(fù)的靶點(diǎn)后，最終獲得10個(gè)靶點(diǎn)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶8(MMP8)、人組蛋白脫乙酰化酶2 (HDAC2)、乙酰膽堿酯酶等3個(gè)靶點(diǎn)與腫瘤相關(guān)。從預(yù)測分析表明， HDAC2可能是白藜蘆醇抗結(jié)腸癌的重要靶點(diǎn)。

100μmol/L白藜蘆醇543210細(xì)胞凋亡率(%)200μmol/L白藜蘆醇對照組對照組200μmol/L100μmol/L**白藜蘆醇

注：與對照比較，*P<0.05

圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡效應(yīng)

注： 藥物候選靶按能量升序排列，僅選取排列位于前2%的靶，刪除相關(guān)疾病不明確的靶。

3　討　論

結(jié)腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的主要惡性腫瘤之一。近年來，結(jié)腸癌治療方法已有較大的發(fā)展，但治療效果仍不理想，術(shù)后總體的五年生存率仍為50%～60%。因此，尋求低毒、高效的新型候選藥物成為結(jié)腸癌治療的重要熱點(diǎn)。近年研究表明，白藜蘆醇對肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，它成為抗腫瘤領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長有良好的抑制作用，白藜蘆醇作用24 h時(shí)，其IC50值為191.5 μmol/L；而48 h時(shí)的IC50值為117.6 μmol/L。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可阻滯結(jié)腸癌SW480細(xì)胞G1期進(jìn)展，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示白藜蘆醇對結(jié)腸癌也有良好的治療價(jià)值。

白藜蘆醇的抗癌機(jī)制仍不清楚，細(xì)胞周期阻滯是許多抗癌藥物的主要抗癌機(jī)制。目前，白藜蘆醇抗腫瘤細(xì)胞增殖作用機(jī)制的研究也主要集中在其對細(xì)胞周期的影響。有研究表明，白藜蘆醇通過抑制CDK7激酶和周期素依賴性激酶 p34(CDC2)而使結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29 靜止在G2期；白藜蘆醇也可抑制CDK2和CDK4的活性，從而阻滯結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞S期進(jìn)展[6-7]。近期，學(xué)者發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可使結(jié)腸癌HCT116和Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生G1-S期阻滯，其機(jī)制與下調(diào)CDK2、CDK4、cyclin D1、PCNA和P21的活性有關(guān)[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可阻滯結(jié)腸癌SW480細(xì)胞G1期進(jìn)展，此與國內(nèi)劉敏等[9]的研究存在一些差異，其可能原因與白藜蘆醇劑量、作用的時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件等因素有關(guān)。白藜蘆醇所致的G1期阻滯是否也與抑制CDK2、CDK4等分子活性有關(guān)，還是其他機(jī)制？此需要進(jìn)一步研究。

目前，白藜蘆醇被發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗氧化作用和抗血管形成等多種途徑和機(jī)制，產(chǎn)生抗結(jié)腸癌作用，因此，白藜蘆醇肯定通過作用于多種靶點(diǎn)產(chǎn)生抗癌作用。本研究中，我們通過生物信息學(xué)方法，篩選到10個(gè)白藜蘆醇作用候選靶點(diǎn)，其中MMP8、HDAC2、乙酰膽堿酯酶等3個(gè)靶點(diǎn)與腫瘤相關(guān)。從預(yù)測分析表明，HDAC2可能是白藜蘆醇抗結(jié)腸癌的新型靶點(diǎn)。HDAC是一類蛋白酶，對染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)可通過提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙?；?，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡及分化相關(guān)蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化，成為一類新的抗腫瘤藥物[10-11]。白藜蘆醇所致的G1期阻滯或細(xì)胞凋亡是否與HDAC2相關(guān)？白藜蘆醇是否也屬于新的HDACi?這些問題需要進(jìn)一步深入研究。

目前，白藜蘆醇對結(jié)腸癌的研究相對較少，本研究僅初步探討白藜蘆醇抗結(jié)腸癌作用及可能機(jī)制，特別是首次發(fā)現(xiàn)HDAC2有可能是白藜蘆醇抗結(jié)腸癌作用的新靶點(diǎn)，但此需要進(jìn)一步深入探討，此假說一旦被證實(shí)，將極大豐富白藜蘆醇的抗癌機(jī)制。

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(本文編輯：劉新艷)

Effect and mechanism of Resveratrol on colon cancer

WangChunzhong1,YangShaoyu1,XiaoHuilian1,LiuLina2,WangGuiping2*

(1DepartmentofGeneralSurgery,GuangzhouMunicipalFirstPeople’sHospital,Guangzhou,Guangdong510380,China;2SystemsBiologyandCancerResearchCenter,VocationalandTechnicalInstituteofHealthSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510180,China)

*Correspondingauthor:Email：docgpwang@163.com

Objective:To determine the inhibition of Resveratrol on the cell growth of colon cancer SW480 cells,and to investigate its mechanism. Methods:CCK-8 kit was used to evaluate Resveratrol on the proliferation and inhibition of SW480 cells. Using flow cytometry to determine Resveratrol on the cell cycle and apoptosis of SW480 cells. TarFisDock molecular docking analysis tool was used to predict and analyze the potential targets of Resveratrol. Results:Resveratrol can significantly inhibit the growth of colon cancer SW480 cells. The IC50value of SW480 cells was 191.5 μmol/L and 117.6 μmol/L at 24 h and 48 h under the Resveratrol inhibition,respectively. The flow cytometry showed that Resveratrol could block SW480 cells at G1phase,and induce cell apoptosis. Targets prediction screened out 10 candidate targets of Resveratrol effect,wherein the matrix metalloproteinase 8 (MMP8),human histone deacetylase 2 (HDAC2) and acetylcholinesterase may be the new targets of Resveratrol on colon cancer. Conclusion:Resveratrol shows good effect on colon cancer,which may become a new candidate drug or sensitizer for the treatment of colon cancer.

Resveratrol; colon cancer; SW480 cells; growth inhibition

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.02.003

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省項(xiàng)目(20121001)

Email：docgpwang@163.com

R73-35+4

A

2095-9664(2016)02-0009-04

2016-03-09)