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(廣州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510130)

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·論著·

鞘內(nèi)β-七葉皂甙鈉對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角細(xì)胞因子的影響

王保*堯新華肖珍科魯義周樸卿朝輝譚花

(廣州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510130)

目的:觀察鞘內(nèi)β-七葉皂甙鈉對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角細(xì)胞因子的影響。方法：于健康雄性SD大鼠(體質(zhì)量180～200 g)鞘內(nèi)留置PE-10 導(dǎo)管，置管1周后制作神經(jīng)病理性疼痛模型。將18只神經(jīng)病理性疼痛大鼠隨機(jī)分成3組(每組6只)：生理鹽水組、β-七葉皂甙鈉20 μg組和β-七葉皂甙鈉40 μg組。測(cè)定3組鞘內(nèi)給藥前、給藥后20、40、60 min大鼠機(jī)械性閾值,計(jì)算最大效應(yīng)百分比(MPE)。采用RT-PCR法檢測(cè)脊髓背角內(nèi)TNF-a、IL-1β、IL-6的mRNA水平。結(jié)果：β-七葉皂甙鈉20 μg組、40 μg組MPE均明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，TNF-a、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平則明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。結(jié)論：鞘內(nèi)注射β-七葉皂甙鈉可產(chǎn)生抗神經(jīng)病理性疼痛作用，其作用可能與其抑制脊髓背角內(nèi)TNF-a、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)有關(guān)。

β-七葉皂甙鈉；神經(jīng)病理性疼痛；脊髓背角；細(xì)胞因子

神經(jīng)病理性疼痛是由各種原因(如外傷、手術(shù)、腫瘤、病毒感染、糖尿病和化療藥物)引起的神經(jīng)損傷所致，主要表現(xiàn)為痛超敏(即痛閾顯著下降)、痛敏(即痛反應(yīng)增強(qiáng))和自發(fā)性疼痛[1]。目前，臨床上尚無(wú)特效的治療藥物和治療方法，屬于難治性疼痛[2]。有研究結(jié)果表明，大鼠鞘內(nèi)注射β-七葉皂甙鈉可產(chǎn)生劑量依賴(lài)性抗神經(jīng)病理性疼痛作用[3]，但其機(jī)制較為復(fù)雜。本研究擬建立神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，觀察鞘內(nèi)注射β-七葉皂甙鈉對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角細(xì)胞因子的影響，探討可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模和分組

將體質(zhì)量180～200 g的雄性SD大鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，腹腔內(nèi)注入咪唑安定(2 mg/kg)和氯胺酮(40 mg/kg)麻醉后，將PE-10導(dǎo)管從大鼠枕骨大孔入蛛網(wǎng)膜下腔向尾側(cè)插入7.0～7.5 cm 至脊髓腰骶段，另一端固定在頸外以供注射實(shí)驗(yàn)藥物；1周后，無(wú)運(yùn)動(dòng)功能障礙大鼠者，在同樣的麻醉方法下，結(jié)扎大鼠腰5、6神經(jīng)，制作神經(jīng)病理性疼痛模型。隨機(jī)抽取18只模型大鼠，隨機(jī)分成3組：生理鹽水組、β-七葉皂甙鈉20 μg組和β-七葉皂甙鈉40 μg組，每組6只。將含20 μg β-七葉皂甙鈉的生理鹽水20 μL、40 μg β-七葉皂甙鈉的生理鹽水20 μL和生理鹽水20 μL分別從PE-10導(dǎo)管注入蛛網(wǎng)膜下腔。7 d后，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑

β-七葉皂甙鈉購(gòu)自山東綠葉制藥有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PBS緩沖液：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.56 g、KH2PO40.2 g加超純水至900 mL，調(diào)pH值至7.4，高壓滅菌備用。PCR引物及序列[4,5]見(jiàn)表1，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1　PCR引物及序列

1.3機(jī)械性閾值的測(cè)定

將SD大鼠置于實(shí)驗(yàn)容器中適應(yīng)20 min后，使用vonFrey 纖維絲垂直于大鼠神經(jīng)結(jié)扎側(cè)肢足底中間部位，然后給予一定刺激，持續(xù)刺激時(shí)間≤6 s，當(dāng)大鼠出現(xiàn)舔足、抬腳反應(yīng)時(shí)，則認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)。從2 g刺激開(kāi)始進(jìn)行測(cè)試，若該力度的刺激不能誘導(dǎo)陽(yáng)性反應(yīng)，則用相鄰大一級(jí)的力度進(jìn)行刺激，若陽(yáng)性反應(yīng)被誘導(dǎo)出，需要換成級(jí)別小一級(jí)的力度進(jìn)行刺激。在經(jīng)過(guò)數(shù)次連續(xù)的傷害刺激以后，當(dāng)出現(xiàn)第一次陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測(cè)定4 次，記錄該值，最大力度限制為15 g，刺激力度>15 g時(shí)記為15 g，每次刺激的間隔時(shí)間為30 s[6]。對(duì)抗傷害效果的評(píng)定：抗傷害最大效應(yīng)百分比(MPE%)=(給藥后壓力閾值-基礎(chǔ)壓力閾值)/(15-基礎(chǔ)壓力閾值)×100%。

1.4脊髓背角細(xì)胞因子的測(cè)定

將完成機(jī)械性閾值測(cè)定的大鼠處死，取腰段脊髓，采用RT-PCR法檢測(cè)TNF-a、IL-1β、IL-6 mRNA水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1鞘內(nèi)β-七葉皂甙鈉對(duì)大鼠機(jī)械性閾值的影響

鞘內(nèi)分別注射20、40 μg β-七葉皂甙鈉可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗神經(jīng)病理性疼痛作用，在注藥后20 min抗神經(jīng)病理性疼痛作用達(dá)到最大，其作用可持續(xù)至給藥后1 h，且與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

100806040200最大效應(yīng)百分比(MPE%)**********************************生理鹽水β-七葉皂甙鈉20μgβ-七葉皂甙鈉40μg2040600時(shí)間(min)

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖1鞘內(nèi)注入β-七葉皂甙鈉各時(shí)間點(diǎn)的最大效應(yīng)百分比

2.2β-七葉皂甙鈉對(duì)脊髓背角TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響

鞘內(nèi)分別注入β-七葉皂甙鈉20 μg和40 μg后，脊髓背角細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均明顯下降，與生理鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

TNF-αmRNA的相對(duì)比較2.52.01.51.00.50.03210TNF-αmRNA的相對(duì)比較TNF-αmRNA的相對(duì)比較2.01.51.00.50.0假手術(shù)組生理鹽水組20μg40μg假手術(shù)組生理鹽水組20μg40μg假手術(shù)組生理鹽水組20μg40μgABC##*##*##*

注：A TNF-α；B IL-1β；C IL-6；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與生理鹽水組比較，*P<0.05

圖2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平

3　討　論

神經(jīng)病理性疼痛是一種常見(jiàn)的由神經(jīng)系統(tǒng)損傷引發(fā)的難以根治的慢性病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)有痛閾降低、痛反應(yīng)增強(qiáng)和自發(fā)性疼痛等，國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)將其稱(chēng)之為“源于或由神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂所引起”[7]。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與組織損傷所引起的急性疼痛不一樣，治療比較困難。

β-七葉皂甙鈉可通過(guò)下列途徑發(fā)揮抗神經(jīng)病理性疼痛作用：刺激腎上腺皮質(zhì)及刺激細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)調(diào)節(jié)素，對(duì)抗炎性介質(zhì)，抗?jié)B出、消腫；抑制TXA2的表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)分泌前列腺素PGF2a，提高血液中的皮質(zhì)酮濃度，阻滯腺苷三磷酸酯酶的作用而促進(jìn)鉀離子外排，并使鈉離子交換變慢，從而消腫抗炎；其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)包含酚羥基，可通過(guò)捕捉清除游離的氧自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，從而穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞，擴(kuò)張動(dòng)脈，增強(qiáng)耐缺氧能力[8]。

本研究結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射20、40 μg β-七葉皂甙鈉可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗神經(jīng)病理性疼痛作用，且在注藥后20 min作用達(dá)到最大，其作用可持續(xù)1 h，這與堯新華等[3]的研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果表明，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6可使傷害性感受神經(jīng)元活化或致敏，具有增強(qiáng)疼痛的作用[9]，本研究結(jié)果證實(shí)，鞘內(nèi)β-七葉皂甙鈉具有抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)的作用，可使脊髓背角細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯下降。我們據(jù)此推測(cè)，鞘內(nèi)注射β-七葉皂甙鈉抗神經(jīng)病理性疼痛作用可能與其抑制脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放有關(guān)。

綜上所述，大鼠鞘內(nèi)β-七葉皂甙鈉可產(chǎn)生抗神經(jīng)病理性疼痛作用，其機(jī)制可能與其降低脊髓背角內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。

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[6] 賈子普,羅芳. 脈沖射頻治療外周神經(jīng)病理性疼痛模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2015,21(4):293-296.

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(本文編輯:張輝)

Effects of intrathecal β-Aescin sodium on cytokines in spinal dorsal horn of rats with neuropathic pain

WangBao*,YaoXinhua,XiaoZhenke,LuYi,ZhouPu,QingChaohui,TanHua

(DepartmentofAnesthesiology,GuangzhouMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510130,China)

*Correspondingauthor:Email：78wb@163.com

Objective:To investigate the effects of intrathecal β-Aescin sodium on cytokines in spinal dorsal horn of rats with neuropathic pain. Methods:Healthy male SD rats (body weight 180～200 g) received intrathecal indwelling of PE-10 catheters. One week later,model of neuropathic pain was established in these rats by spinal nerve ligation (SNL). Eighteen SNL rats were randomly selected and divided into 3 groups (n=6 each):normal saline group,20 μg β-Aescin sodium group and 40 μg β-Aescin sodium group. Before intrathecal administration and at 20,40 and 60 min after administration,we determined the mechanical threshold of rats,and thereby calculated the maximum percent effect (MPE). RT-PCR was used to detected the mRNA levels of TNF-a,IL-1β and IL-6 in the dorsal horn of spinal cord. Results:Compared with normal saline group,20 μg and 40 μg β-Aescin groups showed significantly higher MPE values (P<0.05),and significantly lower mRNA expression levels of TNF-a,IL-1β and IL-6(P<0.05).Conclusion:Intrathecal injection of β-Aescin may result in anti-neuropathic pain effect,which may be related to inhibition of TNF-a,IL-1β,and IL-6 mRNA expression in the dorsal horn of spinal cord.

β-Aescin; neuropathic pain; spinal dorsal horn; cytokine

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.02.002

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20131A 011034)

Email：78wb@163.com

R575.2

A

2095-9664(2016)02-0006-03

2016-03-17)