王桂平　葉　云　鐘英英　李智斌　張彥燾

(1廣州醫(yī)科大學衛(wèi)生職業(yè)技術學院系統(tǒng)生物與腫瘤研究中心，廣東 廣州 510180；2廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006)

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·論著·

白藜蘆醇的抗肺腺癌作用機制研究

王桂平1*葉云2鐘英英2李智斌1張彥燾1

(1廣州醫(yī)科大學衛(wèi)生職業(yè)技術學院系統(tǒng)生物與腫瘤研究中心，廣東 廣州 510180；2廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006)

目的:采用生物信息學和系統(tǒng)生物學途徑，研究白藜蘆醇的抗肺腺癌作用機制。方法：從GEO數(shù)據(jù)庫獲取白藜蘆醇處理肺腺癌的表達譜數(shù)據(jù)集(No：GSE9008)，經(jīng)質量分析和標化后，采用dchip軟件篩選差異表達基因；采用GO注釋工具對差異基因進行生物過程注釋；采用Toppgene工具對差異基因進行信號通路富集分析；通過CMAP進行藥物作用機制或藥理作用預測分析。結果：對比白藜蘆醇和乙醇作用于A549細胞的表達譜，獲得116個顯著差異表達基因，其中上調基因92個，下調基因24個；差異表達基因主要涉及細胞凋亡、黏附等生物學過程；白藜蘆醇可能通過調節(jié)p53、DNA損傷修復、細胞外基質(ECM)糖酵解過程等信號通路而發(fā)揮抗肺腺癌作用；CMAP分析顯示，白藜蘆醇的抗肺腺癌作用與類雌激素或激素作用、抗炎作用、抑制微生物生長、Hsp90抑制作用等相關。結論：白藜蘆醇的抗肺腺癌作用機制復雜，可能與其具有的抗炎、抗微生物、雌激素或激素效應等有關。

白藜蘆醇；肺腫瘤；腺癌；系統(tǒng)生物學；基因表達譜

據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，肺癌已成為嚴重危害人類健康的第一位惡性腫瘤，肺腺癌則是最為常見的肺癌類型[1]。目前，肺癌的臨床療效仍不理想，5年生存率始終徘徊在10%～15%左右。因此，采用新的高效低毒的治療藥物或化療增效劑，對改善肺癌的治療具有重要意義。

白藜蘆醇屬于多酚類化合物，廣泛存在于葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物中，特別是紅葡萄酒中含量最多。白藜蘆醇具有豐富而多樣的藥理活性，如退燒與止痛、抗癌作用、心血管保護作用、抗血栓功能、抗氧化及抗菌作用等。同時，白藜蘆醇已成為國際腫瘤治療研究領域的熱點，它對乳腺癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、白血病等多種惡性腫瘤細胞均有明顯的抑制作用[2-3]。相關的研究對白藜蘆醇的作用機制有不同解釋，但不能從根本上給出一個有說服力的假說，那為什么白藜蘆醇能調節(jié)如此多樣的生物學過程呢?為什么有如此廣譜的抗癌作用呢？當前的機理研究仍然停留在簡單的實驗設計或是半隨機模型的研究，因此，作用機制的研究難以深入和缺乏說服力。本項目將采用系統(tǒng)生物學和生物信息學等多種方法，系統(tǒng)的研究白藜蘆醇可能的抗肺癌機制，為白藜蘆醇的臨床應用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1GEO數(shù)據(jù)集的獲取

從Pubmed的GEO數(shù)據(jù)庫(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中獲取白藜蘆醇處理肺腺癌表達譜數(shù)據(jù)集(No：GSE9008)。該數(shù)據(jù)集采用affy公司的HG-133 plus 2芯片平臺，含4個基因表達譜數(shù)據(jù)。納入研究的生物樣本來源于25 mmol/L白藜蘆醇或乙醇處理的A549細胞(48 h)。

1.2顯著差異表達基因的篩選

dchip 軟件分析包(www.dchip.org)是由哈佛大學開發(fā)的、基于Windows平臺的綜合性芯片分析軟件[4]，可進行差異基因、層次聚類等芯片數(shù)據(jù)分析。表達譜數(shù)據(jù)先進行芯片質量分析，合格的數(shù)據(jù)集被選擇進行差異基因分析及后續(xù)生物數(shù)據(jù)分析，具體差異表達基因分析按dchip操作指南進行(http://www.chenglilab.net/software.html)，采用2樣本t檢驗方法篩選差異基因，最終選擇2-fold差異的基因作為差異表達基因。

1.3GO生物功能聚類分析

Gene Ontology是目前使用最為廣泛的蛋白質功能數(shù)據(jù)庫，可對蛋白質的生物學通路和功能進行注釋，該數(shù)據(jù)庫包括分子功能(MF)，細胞組成(CC)和生物過程(BP)3個部分。本研究采用Gene Ontology對獲得的差異表達基因進行生物學功能聚類分析，以期闡明白藜蘆醇抗肺腺癌的生物學過程途徑。

1.4生物信號通路分析

本項目采用Toppgene(http://toppgene.cchmc.org/)在線分析工具，對獲得的差異表達基因進行生物信號通路分析，以探索白藜蘆醇抗肺腺癌作用的生物信號通路途徑。Toppgene是個有效而方便的基于基因功能相似性的蛋白、基因及生物信號通路富集篩選方法。具體分析方法按在線操作指南進行(https://toppgene.cchmc.org/)[5]。

1.5CMAP數(shù)據(jù)分析

Connectivity map (CMAP， build 02)數(shù)據(jù)庫含有7 000個表達譜數(shù)據(jù)，涉及1 309種化合物，可應用于發(fā)現(xiàn)具有相似作用的藥物、提示藥物作用機制等[6]。其原理為比對疾病表達譜與藥物表達譜數(shù)據(jù)，然后以非參數(shù)的Kolmogorov-Smirnov統(tǒng)計學方法進行排列，獲得正分值的藥物表示與輸入的藥物可能存在相似的作用或作用機制。 為進一步探討白藜蘆醇的作用機制，我們將上述獲得的差異上或下調基因分別輸入到CMAP中進行表達譜相似比對篩選分析。

2　結　果

2.1芯片數(shù)據(jù)預處理

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫獲得白藜蘆醇處理肺腺癌表達譜數(shù)據(jù)集(No：GSE9008)，包括對照樣本1個和3個實驗樣本。為對丟失數(shù)據(jù)進行填補、清除不完整的數(shù)據(jù)或合并重復數(shù)據(jù)等，我們采用RMAexpress 軟件進行質量分析和數(shù)據(jù)歸一化處理，本研究納入的樣本均具有較高的質量，實驗重復性較好，見圖1。

876543210876543210AB

注：A：數(shù)據(jù)沒有進行歸一化處理；B：歸一化處理后的數(shù)據(jù)

圖1芯片數(shù)據(jù)M-A散點圖

2.2白藜蘆醇差異顯著基因分析

采用dchip軟件包對GSE9008數(shù)據(jù)集芯片樣本進行差異基因分析，白藜蘆醇處理A549細胞組與乙醇處理組比較共有116個差異表達基因，其中在2～4倍值之間下調表達基因，共18個，4倍以下表達下調的基因，共6個；2～4倍值之間上調表達基因，共86個，4倍以下表達上調的基因，共6個。見圖2。

100806040200基因數(shù)1886669212345

注：1:2～4倍下調;2:2～4倍上調;3:>4倍下調;4:>4倍上調；5:下調合計

圖2差異基因分布圖

2.3白藜蘆醇差異顯著基因功能聚類分析

為獲得白藜蘆醇作用于肺癌A549細胞差異基因的整體生物學功能，本研究采用Gene Ontology 在線分析工具，主要從生物過程方面分析上調或下調差異表達基因，見表1。差異下調的基因沒能獲得有統(tǒng)計學意義的生物學過程，而差異上調的92個基因中，共獲得12條有統(tǒng)計學意義的生物學過程，主要涉及細胞凋亡、生物調節(jié)、生物黏附和代謝過程等生物學過程。

表1　白藜蘆醇作用A549細胞差異上調基因的GO分析

2.4信號傳導通路生物信號通路聚類分析

信號傳導通路紊亂或失調與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后關系密切，為從生物信號傳導途徑探討白藜蘆醇抗肺癌作用機制，本研究采用Toppgene分析工具，對白藜蘆醇作用于A549細胞的差異顯著基因進行信號通路分析，在下調的差異基因中，沒能獲得有統(tǒng)計學意義的信號通路，而在上調的差異表達基因中，獲得20條有統(tǒng)計學意義的信號傳導通路，主要涉及p53、DNA損傷修復、ECM 糖酵解過程、細胞周期調控等信號傳導通路，特別是其中有5條信號通路涉及p53途徑，提示白藜蘆醇可能主要通過調節(jié)p53信號通路，發(fā)揮抗肺癌作用。見圖3。

進一步對涉及p53信號通路的基因進行分析，白藜蘆醇主要上調CDKN1A等11個與p53信號通路相關的基因表達，其中白藜蘆醇通過上調CDKN1A、MDM2、GADD45A、FAS、ATF3和VDR等基因的表達，產(chǎn)生抗腫瘤作用已得到實驗證實，此也說明本研究方法的可靠性。見表2。

圖3白藜蘆醇作用A549細胞差異上調基因的信號通路富集分析

2.5相似作用機制藥物富集分析

為從宏觀基因組學上探索白藜蘆醇抗癌作用可能機制，本研究采用CMAP分析工具，通過尋找有相似功能的藥物或化合物，以此研究白藜蘆醇可能的抗肺癌機制。通過表達譜比對分析，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與美雌醇、倍氯米松、萘美酮等10種藥物表達譜的變化相似，提示白藜蘆醇抗癌作用涉及類雌激素或激素作用、抗炎作用、抗菌作用等。見表3。同時，在CMAP分析結果中，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抗乳腺癌或前列腺癌表達譜具有高的富集分數(shù)，提示白藜蘆醇具有好的抗乳腺腺癌、前列腺癌作用，也說明本項目研究的可靠性，見圖4。

表2　白藜蘆醇上調p53通路相關基因

表3　基于CMAP篩選白藜蘆醇抗肺腺癌作用的相似藥物

注：選擇P<0.05的候選藥物

注：Resveratrol:白藜蘆醇

圖4白藜蘆醇富集分析

3　討　論

白藜蘆醇是一種生物活性很強的天然多酚類物質，是多種腫瘤的化學預防劑，對肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制和殺傷作用，成為抗腫瘤領域新研究熱點[7]。雖然，白藜蘆醇具有多樣而復雜的生物效應，但其作用機制仍不清楚，影響其進一步的臨床應用及衍生物的開發(fā)。難道白藜蘆醇真是一種 “全能神藥”，可以解決諸多臨床問題？因此，需要采用新的手段和方法系統(tǒng)研究該藥的作用機制。本項目采用生物信息學分析方法，對比白藜蘆醇和乙醇作用于A549細胞的表達譜變化，獲得116個顯著差異表達基因，其中上調基因92個，下調基因24個。差異基因的生物過程分析顯示，白藜蘆醇主要通過上調細胞凋亡、生物調節(jié)、生物黏附和代謝過程等生物學過程中相關基因而發(fā)揮抗癌作用。

信號轉導通路的異?；蛭蓙y是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要原因，調節(jié)異常信號轉導通路已成為癌癥治療的重要策略。白藜蘆醇可通過影響凋亡通路、炎癥信號通路[核因子(NF)-κB]和p38 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，以及磷脂酰肌醇-3激酶/蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)等信號通路而發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過調節(jié)p53、DNA損傷修復、ECM糖酵解過程、細胞周期調控等信號傳導通路中相關基因而發(fā)揮抗癌作用。上調p53信號途徑中相關基因的表達可能是白藜蘆醇發(fā)揮抗肺癌作用的主要機制，此與其他學者的研究相似[9]。白藜蘆醇主要上調CDKN1A、MDM2、GADD45A、FAS、ATF3和VDR等11個與p53信號通路相關的基因的表達發(fā)揮抗癌作用，這些已在相關的研究中得到證實[8，10-11]。而p53通路中PMAIP1，TGFA，F(xiàn)DXR和BTG2等基因可能是白藜蘆醇抗癌作用的新靶基因，此需要進一步的實驗研究證實。上述數(shù)據(jù)表明，白藜蘆醇是通過多種途徑發(fā)揮調節(jié)p53信號通路。

基于藥物基因表達譜的相似性，可以發(fā)現(xiàn)和挖掘具有相似功能或相似作用機制的藥物或化合物，從而闡明藥物的作用機制[6]。本項目采用CMAP表達譜數(shù)據(jù)平臺，篩選到美雌醇、倍氯米松、萘美酮等10種候選藥物，這些候選化合物主要歸類為雌激素或激素藥物、非甾體抗炎藥、抗病原微生物藥(細菌、病毒及寄生蟲)、Hsp90抑制劑及抗腫瘤藥等，提示白藜蘆醇的抗肺腺癌作用與類雌激素或激素作用、抗炎作用、抑制微生物生長、Hsp90 抑制作用等相關。同時，在CMAP分析結果中，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抗乳腺癌或前列腺癌表達譜具有高的富集分數(shù)，提示白藜蘆醇具有好的抗乳腺腺癌、前列腺癌作用?，F(xiàn)有的研究已證實，白藜蘆醇是一種天然的植物雌激素，它可結合不同雌激素受體而表現(xiàn)雌激素激動或拮抗活性，對心血管疾病的防治及激素依賴性腫瘤的治療有要意義[12-13]。1963年，科學家就已發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇有抗炎癥、抗氧化的作用，是一種COX-1選擇性抑制劑，具有廣泛而強效的抗炎作用[14-15]。本項目的研究也發(fā)現(xiàn)，在富集到10種候選藥物中，有倍氯米松、納布美通、尼美舒利和氯倍他索等4種抗炎藥物，此不僅說明本研究方法的可靠性，同時也提示白藜蘆醇的抗肺腺癌作用與抗炎作用有重要關系。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)一種Hsp90抑制劑——單孢菌素具有較高的富集分數(shù)，提示白藜蘆醇的抗腫瘤作用可能與抑制Hsp90蛋白功能相關，此前有報道白藜蘆醇通過下調Hsp70蛋白功能而發(fā)揮抗白血病作用[16-17]。白藜蘆醇是否通過熱休克蛋白家族而發(fā)揮抗腫瘤作用？此仍需要進一步的研究證實。

綜上，本項目基于基因表達譜途徑，通過多種生物信息學方法，從藥物特征性基因表達譜的生物學過程、信號轉導通路及相似表達譜富集分析等角度，系統(tǒng)探討白藜蘆醇抗肺癌機制，白藜蘆醇主要通過上調p53等信號通路發(fā)揮抗肺癌作用，同時，其抗肺癌機制與類雌激素或激素作用、抗炎作用、抑制微生物生長、Hsp90 抑制作用等相關。

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(本文編輯：劉新艷)

Effect and mechanism of Resveratrol on lung adenocarcinoma

WangGuiping1*,YeYun2,ZhongYingying2,LiZhibin1,ZhangYantao1

(1SystemsBiologyandCancerResearchCenter,VocationalandTechnicalInstituteofHealthSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510180,China;2SchoolofBiologicalandChemicalEngineering,GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou,Guangxi545006,China)

*Correspondingauthor:Email:docgpwang@163.com

Objective:Using bioinformatics and systems biology,to investigate the effect and mechanism of Resveratrol on lung adenocarcinoma. Methods:The Resveratrol expression profile data on lung adenocarcinoma (NO. GSE9008) was obtained from GEO databank for quality analysis and standardization,and the differentially expressed genes were screened by dchip software. GO annotation tool was used to annotate the biological process of differentially expressed genes. The signal pathway of the differentially expressed genes was determined by Toppgene tool for enrichment analysis. The drug mechanism or pharmacological effect of Resveratrol was determined by CMAP for predictive analysis. Results:The expression profiles of resveratrol and ethanol on A549 cells were compared,and 116 significantly and differentially expressed genes were obtained,including 92 up-regulated genes and 24 down-regulated genes. Differentially expressed genes were mainly involved in the biological process of cell apoptosis and adhesion. Resveratrol may play the role against lung adenocarcinoma through the signaling pathway of regulating p53,DNA damage repair and extracellular matrix (ECM) glycolysis. CMAP analysis showed that the anti-lung adenocarcinoma effect of Resveratrol was correlated with estrogen or glucocorticoid-like actions,anti-inflammatory effects,anti-microbial activity and Hsp90 inhibition. Conclusion:The mechanism underlying the effect of Resveratrol against lung adenocarcinoma is complex,which may be related to its anti-inflammation,anti-microbial,and estrogen or glucocorticoid actions.

Resveratrol; lung neoplasms；adenocarcinoma; systems biology; gene expression profile

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.02.001

Email：docgpwang@163.com

R73-35+4

A

2095-9664(2016)02-0001-05

2016-03-21)