焦周光,付緒磊,溫占波*,李勁松*,李 娜,張 柯,王 潔,胡凌飛

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北京大氣PM2.5對(duì)A549細(xì)胞炎性因子及DNA損傷的毒性

焦周光1,付緒磊2,溫占波1*,李勁松1*,李 娜1,張 柯1,王 潔1,胡凌飛1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 錦州 121013)

為探討大氣PM2.5及其不同組分對(duì)人肺上皮細(xì)胞A549的毒性作用及其劑量-反應(yīng)關(guān)系,將前期采集的PM2.5顆粒物用不同方法進(jìn)一步制備PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分和PM2.5單純顆粒物,將制備的PM2.5顆粒物及其組分以不同濃度對(duì)A549細(xì)胞染毒,用MTS法分別在染毒6, 10, 24, 48, 72h后測(cè)定細(xì)胞活力,染毒24h后用ELISA及RT-QPCR法測(cè)定IL-6和TNF-α表達(dá)量,AP位點(diǎn)計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞DNA損傷情況.結(jié)果表明: 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本高濃度染毒時(shí)始終對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用,其中低濃度染毒時(shí)可在較短時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用,染毒時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)抑制作用減弱或消失,PM2.5水溶性組分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用并不顯著;除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)量和IL-6蛋白的分泌,除PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量;除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都顯著提高了DNA堿基缺失程度.總的來(lái)說(shuō),PM2.5水溶性組分在抑制細(xì)胞活力、造成炎性損傷及DNA損傷方面作用相對(duì)較小,而PM2.5所產(chǎn)生的毒性作用并不僅限于其所吸附的復(fù)雜成分,其中作為載體的固體核心顆粒對(duì)機(jī)體可能造成的毒性作用也不容忽視.

PM2.5；組分；A549；細(xì)胞活力；炎性因子；DNA損傷

PM2.5粒徑小,比表面積大,能夠吸附大量的毒害物質(zhì),可以深入支氣管及肺泡,因而對(duì)人體健康影響巨大[1-3].流行病學(xué)調(diào)查表明,以PM2.5為主的空氣顆粒物污染可以導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病及人群過(guò)早死亡的發(fā)生[4-7].由于有害的空氣污染物主要在肺表面釋放并吸附于肺上皮細(xì)胞,因而肺臟,尤其是肺上皮細(xì)胞被認(rèn)為是吸入顆粒物的主要生物靶目標(biāo)[8-9].PM2.5來(lái)源廣泛,其吸附的各種化學(xué)組分成分復(fù)雜[10],有研究表明PM2.5吸附的有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)組分與其生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)[11-13],此前已有研究人員對(duì)PM2.5的水溶性組分和脂溶性組分的生物毒性作用進(jìn)行了有益的探索[10,14-18],但對(duì)其以碳質(zhì)為主的固體組分的生物毒性研究多以碳黑來(lái)代替[19-20],并不能完全代表其單純固體組分的生物毒性作用,因而對(duì)于由PM2.5造成的疾病損傷其吸附成分和固體組分哪個(gè)損傷作用更大尚值得探討.本研究采集了北京城區(qū)大氣PM2.5顆粒物樣本,并在PM2.5顆粒物樣本(文中將洗脫下來(lái)的PM2.5稱為PM2.5完全顆粒物)的基礎(chǔ)上另外制備了PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分及PM2.5單純顆粒物(主要成分為PM2.5中的不溶性固體組分),以人肺上皮A549細(xì)胞為研究對(duì)象,使用PM2.5顆粒物及其不同組分樣品對(duì)A549細(xì)胞染毒,并從細(xì)胞活力、炎性損傷及DNA損傷三方面來(lái)評(píng)估及比較各染毒樣本對(duì)A549細(xì)胞染毒后對(duì)研究對(duì)象所產(chǎn)生的毒性作用.

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

PM10/PM2.5大流量采樣器(Thermo),石英濾膜(PALL),B2200S超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司),3-18K低溫離心機(jī)(Sigma),冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE),CK40倒置顯微鏡(OLYMPUS),MK-3酶標(biāo)儀(Thermo),0.2μm濾器(PALL),熒光定量PCR儀(Roche),DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO),胎牛血清(PAN),MTS試劑(Promega),胰蛋白酶(Amresco),炎性損傷指標(biāo)測(cè)定試劑盒(IL-6、TNF-α,武漢博士德生物有限公司),DNA提取試劑盒(TAKARA),RNA提取試劑盒(TAKARA), STBR GreenⅠ熒光染料(TAKARA),損傷定量試劑盒-AP位點(diǎn)計(jì)數(shù)(日本同仁化學(xué)研究所).

1.2 顆粒物的采集

采樣地點(diǎn)位于北京城區(qū)西南三環(huán)到四環(huán)之間,靠近東大街和豐管路,周邊交通流量較大且分布有文體機(jī)構(gòu)、大型商場(chǎng)及各類機(jī)關(guān)單位,無(wú)工業(yè)污染源,采樣器距離地面約18m,采集的PM2.5顆粒物可較好代表北京城區(qū)情況.采用PM10/ PM2.5大流量采樣器連續(xù)采樣30d(2014年5月28日~2014年6月26日),采用PM2.5切割頭采集PM2.5樣本,采樣流量為1.13m3/min,每23.5h換一次采樣濾膜.采樣濾膜為(8×10)英寸的石英濾膜,采樣前被置于馬弗爐中600℃灼燒2h以除去可能存在的有機(jī)物質(zhì),采樣后將濾膜置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 PM2.5完全顆粒物及不同組分的制備

采樣結(jié)束后,將吸附有顆粒物的濾膜剪成1cm2左右小塊并置于超純水中超聲震蕩2.5h(超聲4.5min,停5min,依次循環(huán),使水溫保持在20℃以下),超聲結(jié)束后將濾膜吸附的水?dāng)D出后經(jīng)六層紗布過(guò)濾至100mL玻璃瓶,-20℃冷凍后經(jīng)冷凍干燥即可得PM2.5完全顆粒物[21].

依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[22],另外制備PM2.5水溶性組分及PM2.5脂溶性組分.PM2.5水溶性組分制備方法:將適量PM2.5完全顆粒物置于超純水中,充分震蕩后以5000r/min低溫離心5min,用0.2μm濾器過(guò)濾上清液可得PM2.5水溶性成分的水溶液,將其冷凍干燥后可得PM2.5水溶性組分;PM2.5脂溶性組分制備方法:將適量采樣后濾膜剪成小塊后用濾紙包好并置于索氏提取器用二氯甲烷萃取即得PM2.5脂溶性組分的有機(jī)溶液,于通風(fēng)櫥中揮發(fā)掉二氯甲烷后可得PM2.5脂溶性組分.將PM2.5完全顆粒物高壓滅菌并分別去除水溶性組分、脂溶性組分后將剩余顆粒物經(jīng)180℃高溫烘烤3h即可得到PM2.5單純顆粒物.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺上皮細(xì)胞A549(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)用含10%胎牛血清和雙抗(青鏈霉素各100U/mL)的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化、傳代及用于試驗(yàn).

1.5 各染毒樣本染毒母液制備

分別稱取適量PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物用不含血清(含雙抗)的DMEM培養(yǎng)基制備16mg/mL的染毒母液備用(4℃存儲(chǔ),72h內(nèi)使用),根據(jù)制備的PM2.5水溶性組分質(zhì)量用無(wú)菌生理鹽水配制成100mg/mL的染毒母液備用(4℃存儲(chǔ)),PM2.5脂溶性組分用二甲基亞砜(DMSO)配制成100mg/mL的染毒母液備用,方法與水溶性組分制備方法類似.

將PM2.5完全顆粒物、PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分及PM2.5單純顆粒物染毒母液在使用前用細(xì)胞破碎儀超聲裂解5min,依次取適量各染毒母液加入10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基使各染毒樣本染毒液濃度為400μg/mL,在400μg/ mL的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步稀釋為200, 100, 50, 10μg/ mL,PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物以無(wú)血清培養(yǎng)基為溶劑對(duì)照,PM2.5水溶性組分以生理鹽水為溶劑對(duì)照,PM2.5脂溶性組分以DMSO為溶劑對(duì)照.

1.6 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化后稀釋為5×104/mL的細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液以100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后棄上清,溶劑對(duì)照, 10, 50, 100, 200, 400μg/mL)染毒液以100μL/孔分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,另外設(shè)定無(wú)細(xì)胞無(wú)染毒液的空白對(duì)照孔,每個(gè)濃度設(shè)定5個(gè)平行孔,分別培養(yǎng)6, 10, 24, 48, 72h后,棄上清,用PBS洗3遍,每孔加入100μL新鮮培養(yǎng)基和20μL MTS試劑,繼續(xù)培養(yǎng)3.5h后,用酶標(biāo)儀于492nm處測(cè)定其OD值,各處理組的OD值能代表測(cè)定時(shí)細(xì)胞的活力.另外,計(jì)算染毒后相比于溶劑對(duì)照組的細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)′100%.

1.7 炎性損傷指標(biāo)的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化后以3×105/孔接種于6孔板培養(yǎng),每孔3mL培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后棄上清,將各染毒樣本的不同濃度組(溶劑對(duì)照, 10, 50, 100, 200, 400μg/mL)染毒液以3mL/孔分別加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h.

1.7.1 炎性因子IL-6、TNF-α的分泌量檢測(cè) 將染毒結(jié)束后的細(xì)胞培養(yǎng)上清以3000r/min離心15min后留上清,用ELISA法按照相應(yīng)試劑盒操作說(shuō)明書通過(guò)酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定各孔的吸光度值,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)而計(jì)算各處理組培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度,試驗(yàn)時(shí)每種處理設(shè)定3個(gè)平行孔;

1.7.2 炎性因子IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量檢測(cè) 對(duì)染毒后細(xì)胞采用RT-QPCR技術(shù)(SYBR GreenⅠ法)檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá),按照相關(guān)試劑盒使用說(shuō)明書,首先提取RNA后,經(jīng)過(guò)RT反轉(zhuǎn)錄,熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá),每種處理設(shè)定三個(gè)平行孔.選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,內(nèi)參所用引物參照文獻(xiàn)[23]設(shè)計(jì),根據(jù)IL-6和TNF-α的mRNA序列(GenBank序列號(hào)依次為: NM_000600.4、NM_000594.3)利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,引物由北京博邁德公司合成.GAPDH引物序列為正義鏈:CCATGGAGAAGGCTGGGG,反義鏈:CAAAGTTGTCATGGATGACC;IL-6引物序列為正義鏈:GAGTAACATGTGTGAAAGCAGC,反義鏈:CCAGGCAAGTCTCCTCATTGAATCC; TNF-α序列為正義鏈:ACCACGCTCTTCTG- CCTGCTG,反義鏈:GAGGGTTTGCTACAACA- TGG;擴(kuò)增產(chǎn)物GAPDH、IL-6、TNF-α片段長(zhǎng)度分別為194, 116, 157bp.PCR反應(yīng)程序在熒光定量PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增條件為:預(yù)擴(kuò)增95℃ 30s;然后95℃ 5s,60℃ 40s,40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)檢測(cè)一次熒光變化;做熔解曲線95℃ 0s, 20℃/s,65℃ 15s, 20℃/s,95℃ 0s, 0.1℃/s,整個(gè)過(guò)程連續(xù)檢測(cè)熒光變化,熔解曲線可用于驗(yàn)證擴(kuò)增是否具特異性.根絕內(nèi)參C值,利用2-DDCt法計(jì)算各處理組目的基因的表達(dá)量相當(dāng)于溶劑對(duì)照組的倍數(shù).

1.8 染毒后細(xì)胞DNA損傷測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)及染毒方式同炎性因子指標(biāo)測(cè)定時(shí)的培養(yǎng)方法.染毒24h后,棄上清,根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書對(duì)染毒后的細(xì)胞提取DNA,然后用微量分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA濃度進(jìn)行檢測(cè),并用TE buffer調(diào)節(jié)DNA濃度為100μg/mL,然后根據(jù)DNA損傷定量試劑盒操作說(shuō)明對(duì)提取的DNA堿基缺失情況進(jìn)行測(cè)定,用酶標(biāo)儀在630nm處測(cè)定各孔吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出每種處理造成的DNA堿基缺失個(gè)數(shù)(個(gè)/105堿基),每種處理設(shè)定3個(gè)平行孔.

1.9 統(tǒng)計(jì)與分析

先采用Excel 2010繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及整理數(shù)據(jù),然后用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示并作柱狀圖,采用析因設(shè)計(jì)的分析方法對(duì)各因素的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PM2.5各樣本對(duì)A549細(xì)胞染毒后活力及存活率變化

2.1.1 不同濃度PM各樣本對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 如圖1所示,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各染毒組細(xì)胞活力總體都呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì),但除水溶性組分外,其余樣本高濃度染毒時(shí)都表現(xiàn)出了比低濃度組更強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用.PM2.5完全顆粒物染毒6h時(shí)低濃度染毒組(10, 50μg/mL)即表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,染毒組細(xì)胞活力顯著低于溶劑對(duì)照組,染毒48h及以后低濃度染毒組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不表現(xiàn)出抑制作用,而較高染毒濃度組(100μg/mL及以上)始終表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用;PM2.5單純顆粒物在染毒6h時(shí)即對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用,10h時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用有所緩解,而后又都表現(xiàn)出毒性作用,至染毒72h時(shí),低濃度染毒組(10, 50μg/mL)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用消失,高濃度染毒組始終對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用;PM2.5水溶性組分各染毒濃度組始終沒有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用,僅個(gè)別染毒濃度組在48h時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出促進(jìn)作用;PM2.5脂溶性組分最低染毒濃度組(10μg/mL)始終沒有表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,較低濃度染毒組(100μg/mL)在6h時(shí)即表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),至染毒時(shí)間為72h時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用消失,高濃度染毒組(200, 400μg/mL)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)始終表現(xiàn)出抑制作用,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),高濃度染毒組細(xì)胞活力跟溶劑對(duì)照組相比差距越來(lái)越大.

2.1.2 不同濃度PM2.5各樣本對(duì)A549細(xì)胞死亡率的影響 如表1所示,對(duì)于PM2.5單純顆粒物,除染毒10h外,其他時(shí)間點(diǎn)其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率都顯著低于相同條件下的PM2.5完全顆粒物;對(duì)于PM2.5水溶性組分,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率都顯著高于相同條件下的PM2.5完全顆粒物;對(duì)于PM2.5脂溶性組分,其高濃度染毒組(200, 400μg/mL)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率始終顯著低于相同條件下的PM2.5完全顆粒物,而其他染毒濃度組對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率則表現(xiàn)為不小于相同條件下的PM2.5完全顆粒物.

表1 PM2.5完全顆粒物、單純顆粒物、水溶性組分、脂溶性組分對(duì)A549細(xì)胞染毒后細(xì)胞存活率Table 1 The effects of original PM2.5, pure particles, water-soluble, fat-soluble on cell survival

注:細(xì)胞染毒后與同一染毒時(shí)間的PM2.5完全顆粒物染毒組相比,*為<0.05,**<0.01.

2.2 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對(duì)A549細(xì)胞炎性因子IL-6和TNF-α分泌量和表達(dá)的影響

2.2.1 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對(duì)A549細(xì)胞IL-6分泌量的影響 不同濃度PM2.5各染毒樣本對(duì)A549細(xì)胞染毒后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量如圖2所示,在染毒濃度為100μg/mL及以上時(shí),PM2.5完全顆粒物染毒后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量顯著高于溶劑對(duì)照組,染毒濃度在50μg/mL及以上時(shí),PM2.5單純顆粒物和PM2.5脂溶性組分染毒組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量顯著高于溶劑對(duì)照組,但PM2.5水溶性組分各染毒濃度對(duì)應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量相比于溶劑對(duì)照組差異始終不顯著.

如圖2所示,PM2.5單純顆粒物染毒后上清IL-6含量與同濃度的PM2.5完全顆粒物相比差異不顯著;PM2.5水溶性組分染毒后上清中IL-6含量與同濃度PM2.5完全顆粒物相比差異顯著,在100μg/mL及以上濃度染毒時(shí)上清中IL-6含量顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物;PM2.5脂溶性組分在100μg/mL染毒濃度時(shí)上清中IL-6含量顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物,其余濃度染毒時(shí)上清中IL-6含量與同濃度PM2.5完全顆粒物相比差異不顯著.

2.2.2 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對(duì)A549細(xì)胞TNF-α分泌量的影響 用PM2.5各染毒樣本對(duì)A549細(xì)胞染毒后,各溶劑對(duì)照組及各不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中能檢測(cè)到TNF-α的含量幾乎為零.

2.2.3 PM2.5各樣本染毒24h后對(duì)A549細(xì)胞IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 以GAPDH為內(nèi)參,用相對(duì)熒光定量PCR法測(cè)定的各染毒樣本染毒后細(xì)胞IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量如圖3所示,除PM2.5水溶性組分和PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本在50μg/mL及以上染毒濃度時(shí)都顯著增加了A549細(xì)胞IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)量,其中PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物高濃度染毒時(shí)IL-6mRNA的表達(dá)量可達(dá)溶劑對(duì)照組的50倍以上.

圖3顯示,PM2.5單純顆粒物在50μg/mL及以上染毒濃度時(shí)其對(duì)應(yīng)細(xì)胞IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于同濃度的PM2.5完全顆粒物;而PM2.5水溶性組分和PM2.5脂溶性組分在染毒濃度為50μg/mL及以上時(shí)其IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于同濃度組的PM2.5完全顆粒物.

2.2.4 PM2.5各樣本染毒24h后對(duì)A549細(xì)胞TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 以GAPDH為內(nèi)參,用相對(duì)熒光定量PCR法測(cè)定的各處理組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量如圖4所示,除PM2.5脂溶性組分外,其余樣本染毒組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量都顯著高于溶劑對(duì)照組,而PM2.5脂溶性組分各染毒濃度TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于溶劑對(duì)照組.

圖4顯示,PM2.5單純顆粒物染毒后在10μg/mL及以上染毒濃度時(shí)TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于同濃度的PM2.5完全顆粒物; PM2.5水溶性組分在染毒濃度為10μg/mL時(shí)其TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于同濃度PM2.5完全顆粒物,在染毒濃度為100μg/mL及以上時(shí)TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于同濃度的PM2.5完全顆粒物;PM2.5脂溶性組分在染毒濃度為10μg/mL及以上時(shí)TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物.

2.3 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對(duì)A549細(xì)胞DNA損傷的影響

不同濃度PM2.5各樣本對(duì)A549細(xì)胞基因組DNA造成的氧化損傷情況如圖5所示,相比于溶劑對(duì)照組,除PM2.5水溶性組分外,其余樣本在染毒濃度為100μg/mL及以上時(shí)細(xì)胞基因組DNA堿基缺失增加顯著.

此外,圖5顯示,PM2.5水溶性組分在染毒濃度為100μg/mL及以上時(shí)其造成的DNA損傷程度顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物,PM2.5脂溶性組分在染毒濃度為100μg/mL時(shí)其造成的DNA損傷程度顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物,PM2.5單純顆粒物與PM2.5完全顆粒物相比造成的DNA損傷程度差異不顯著.

3 討論

PM2.5成分復(fù)雜,其主要由可溶性鹽、金屬元素、有機(jī)物質(zhì)、碳質(zhì)成分和生物組分等組成[24-25].根據(jù)PM2.5各組分樣品的制備過(guò)程及前期研究結(jié)果易知PM2.5水溶性組分主要為PM2.5完全顆粒物中的可溶性鹽、可溶性金屬離子等成分,PM2.5脂溶性組分主要為其中的有機(jī)物質(zhì),PM2.5單純顆粒物主要為其中的碳質(zhì)組分.本研究制備了PM2.5完全顆粒物、PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分和PM2.5單純顆粒物,并從細(xì)胞活力、炎性損傷和DNA損傷3個(gè)方面對(duì)比研究了各不同組分樣本對(duì)肺上皮細(xì)胞的影響,以探究PM2.5顆粒物不同成分可能對(duì)細(xì)胞造成的毒性作用.為便于與其他科研工作者的研究結(jié)果比較及結(jié)合MTS測(cè)定結(jié)果(從圖1可以看出,染毒48h及以后細(xì)胞增長(zhǎng)速度已經(jīng)較慢,24h時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)速度較快,生長(zhǎng)狀況較好),本研究中除MTS外,其余實(shí)驗(yàn)皆染毒24h.本研究中,除PM2.5水溶性組分外,其余組分高濃度(200, 400μg/mL)染毒時(shí)都在較短時(shí)間(6h)內(nèi)即對(duì)肺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出毒性作用,而低濃度(10, 50μg/mL)染毒組在較短時(shí)間時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可表現(xiàn)出毒性作用,隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),其毒性作用逐漸減弱或消失;但隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),高濃度染毒組對(duì)應(yīng)的細(xì)胞活力跟溶劑對(duì)照組相比差距越來(lái)越大.另外,從存活率的結(jié)果來(lái)看,PM2.5脂溶性組分和PM2.5單純顆粒物在高濃度染毒時(shí)其對(duì)應(yīng)細(xì)胞的存活率顯著低于PM2.5完全顆粒物,而PM2.5水溶性組分對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活始終顯著高于PM2.5完全顆粒物.目前關(guān)于PM2.5不同組分樣本在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞活力影響的研究還比較少,本研究結(jié)果顯示,除PM2.5水溶性組分外,其余PM2.5各樣本低劑量時(shí)對(duì)細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生毒性作用,高劑量時(shí)則具有時(shí)間反應(yīng)關(guān)系,這可能由于低劑量染毒時(shí)顆粒物對(duì)細(xì)胞影響不是很大,雖然剛開始時(shí)可以表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,但隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞逐漸分解掉部分影響細(xì)胞活力的物質(zhì)或逐漸適應(yīng)不太惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境,而高劑量染毒組始終給細(xì)胞造成了一種極為惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境,因而細(xì)胞活力相比于溶劑對(duì)照組越來(lái)越弱.

IL-6和TNF-α是兩種重要的炎性相關(guān)細(xì)胞因子,TNF-α作為前炎癥因子,在炎癥起始階段起著重要作用[26],其作用于肺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維母細(xì)胞后可促使后者分泌粘附分子和IL-6、IL8等細(xì)胞因子[27],IL-6一方面可表現(xiàn)趨化作用,趨化免疫細(xì)胞從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng);另一方面也可以作為一種抗炎因子,調(diào)節(jié)顆粒物暴露后引起的肺部炎癥及纖維化過(guò)程[28].有研究認(rèn)為IL-6可以通過(guò)抑制TNF-α、IL-1等促炎因子產(chǎn)生,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)無(wú)限擴(kuò)大[29-30].本研究用ELISA法和RT-QPCR法分別檢測(cè)了染毒后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α的蛋白含量和染毒后胞內(nèi)IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量.ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本較高染毒濃度(100μg/mL及以上)顯著增加了細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的分泌量,從100μg/mL染毒組的對(duì)比結(jié)果來(lái)看,PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物升高細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量的作用可能強(qiáng)于PM2.5脂溶性組分;各染毒樣本對(duì)細(xì)胞染毒后并未在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到TNF-α的存在,可能是上清中TNF-α濃度低于試劑盒檢測(cè)下限所致.在RT-QPCR檢測(cè)結(jié)果中,結(jié)合IL-6分泌情況推測(cè)IL-6mRNA測(cè)定結(jié)果可能是因?yàn)樵谌径?4h時(shí)PM2.5脂溶性組分染毒組對(duì)應(yīng)的細(xì)胞IL-6mRNA表達(dá)量已經(jīng)開始下降;TNF-α mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示,除PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了細(xì)胞內(nèi)TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量.此前已有國(guó)內(nèi)外研究人員[19,23,31]研究證實(shí)PM2.5完全顆粒物可以顯著升高細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6濃度和/或胞內(nèi)IL-6mRNA表達(dá)量,該研究與之基本相一致;此前亦有研究人員[23,31-32]證實(shí)PM2.5完全顆粒物可以顯著升高細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度和/或胞內(nèi)TNF-α mRNA表達(dá)量,本研究中包括PM2.5完全顆粒物在內(nèi)某些樣本染毒后胞內(nèi)TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量確有顯著升高,與前人研究結(jié)果相一致,但各樣本染毒后并未在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到TNF-α的存在,在進(jìn)行RT-QPCR反應(yīng)時(shí),相同模板TNF-α mRNA對(duì)應(yīng)的Ct值均不同程度大于IL-6mRNA對(duì)應(yīng)的Ct值,因而胞內(nèi)TNF-α的mRNA表達(dá)量必然低于IL-6,此前有研究[19]表明粗顆粒物和細(xì)顆粒物對(duì)細(xì)胞染毒24h后上清中TNF-α分泌量都低于染毒后5h上清中分泌量,因此推測(cè)該研究中未在上清中檢測(cè)到-α可能由于24h時(shí)細(xì)胞分泌到胞外的TNF-α量已經(jīng)較少及高濃度染毒時(shí)細(xì)胞死亡較多所致.從炎性因子和上述MTS測(cè)定結(jié)果來(lái)看,PM2.5單純顆粒物可能比PM2.5完全顆粒物有著更強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)炎性因子表達(dá)的作用,本研究中各樣本間的比較皆是在同質(zhì)量濃度下的比較,同質(zhì)量的PM2.5單純顆粒物相比于PM2.5完全顆粒物有著更多數(shù)量的碳核心顆粒,因而推測(cè)在抑制細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)方面跟細(xì)胞接觸到的碳核心顆粒數(shù)量可能起著很大作用.

PM2.5可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的增加[33-34], DNA的氧化損傷與ROS氧化作用密切相關(guān),氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷是城市顆粒物空氣污染的重要作用[35-36],DNA氧化損傷可以作為氧化應(yīng)激及相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物[35],而且自由基相關(guān)的DNA和蛋白損傷被認(rèn)為在癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)紊亂等年齡相關(guān)的疾病發(fā)展中起著重要作用[37].DNA氧化損傷后會(huì)產(chǎn)生鏈斷裂、各種糖修飾及單個(gè)無(wú)堿基位點(diǎn)(AP位點(diǎn))等,其中AP位點(diǎn)是由ROS產(chǎn)生的DNA損傷的主要類型之一[38-39],該研究通過(guò)利用醛反應(yīng)性探針特異性地與AP位點(diǎn)的開環(huán)上醛基反應(yīng),對(duì)各染毒樣本造成A549細(xì)胞DNA氧化損傷后形成的AP位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行了定量檢測(cè),本研究提示PM2.5水溶性組分并沒有造成DNA堿基缺失的顯著增加,其較高染毒濃度(100μg/mL及以上)所造成的DNA堿基缺失程度弱于PM2.5完全顆粒物.

4 結(jié)論

4.1 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都對(duì)A549細(xì)胞活力影響較大,且在高濃度染毒時(shí)始終對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用,而低濃度染毒時(shí)則在較短時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用,在較長(zhǎng)染毒時(shí)間時(shí)抑制作用逐漸消失.

4.2 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本對(duì)應(yīng)的A549細(xì)胞IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)量和/或IL-6蛋白的分泌都顯著升高,其中促進(jìn)IL- 6mRNA相對(duì)表達(dá)量升高的作用依次為:PM2.5單純顆粒物>PM2.5完全顆粒物>PM2.5脂溶性組分;除PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量,其中促進(jìn)TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量升高的作用依次為: PM2.5單純顆粒物>PM2.5完全顆粒物>PM2.5水溶性組分.

4.3 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都顯著增加了A549細(xì)胞DNA堿基缺失,并且在此方面,PM2.5完全顆粒物、PM2.5單純顆粒物和PM2.5脂溶性組分差異很小.

4.4 總體上來(lái)看,PM2.5水溶性組分在抑制細(xì)胞活力、造成細(xì)胞炎性損傷及DNA損傷方面作用相對(duì)較小;PM2.5脂溶性組分與PM2.5完全顆粒物表現(xiàn)出的毒性作用幾乎一致.PM2.5單純顆粒物比PM2.5完全顆粒物可能有更大的毒性作用,可見作為載體的固體核心顆粒(PM2.5單純顆粒物)在對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用時(shí)也起著相當(dāng)大的作用.

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(4)從表4可知，不論是對(duì)甲基藍(lán)溶液還是對(duì)甲基橙溶液，吸附百分率的值由大到小順序?yàn)椋簭?fù)合材料>硅膠>硅酸鈣>硅酸鎂。

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致謝：感謝環(huán)境科學(xué)研究院高健博士在PM2.5顆粒物采集中提供的幫助.

* 責(zé)任作者, 溫占波, 助理研究員, wenzhanbo@yeah.net;李勁松, 研究員, lij-s@163.com

Toxicological study at inflammatory factors and DNA damages effects of Beijing atmospheric PM2.5and its different fractions to pulmonary epithelial cells A549 of human

JIAO Zhou-guang1, FU Xu-lei2, WEN Zhan-bo1*, LI Jin-song1*, LI Na1, ZHANG Ke1, WANG Jie1, HU Ling-fei1

(1.State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China；2.College of Food Science and Technology, Bohai University, Jinzhou 121013, China)., 2016,36(5)：1579~1588

In order to investigate the toxicity effect of atmospheric PM2.5and its different fractions to human pulmonary epithelial cells A549 with respect to the relationship between PM2.5dosage and cell response, the water-soluble, fat-soluble, pure particle fractions of PM2.5(designated WSP2.5, FSP2.5and PPP2.5, respectively) prepared from original PM2.5samples (designated OP2.5) and OP2.5were to treat A549 cells at different PM concentrations (10, 50, 100, 200, 400μg/mL, respectively). The MTS method was used to test the cell viability at 6h, 10h, 24h, 48h and 72h post-treatment, while ELISA and RT-QPCR were employed to detect the production of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α and the AP-sites counting was conducted to determine the level of intracellular DNA damage at 24h post-treatment. WSP2.5had very limited effect to inhibit cell growth and induce inflammatory damages and DNA base deletion. FSP2.5, PPP2.5and OP2.5at high concentrations showed the inhibitory effect to cell growth across treatment; when cells were treated with low concentrations of FSP2.5, PPP2.5or OP2.5, the inhibition of cell growth occurred within a short period and then disappeared over time. FSP2.5, PPP2.5andOP2.5treatment significantly induced the production of IL-6at both mRNA and protein levels, while WSP2.5, PPP2.5andOP2.5treatment significantly induced the mRNA expression of TNF-α. FSP2.5, PPP2.5and OP2.5treatment also induced the considerable DNA base deletion. In a word, not only the complex components adsorbed on the solid core granules of PM2.5, but also the solid core granules themselves contributed to the cytotoxicity effects.

PM2.5；fractions；A549 cells；cell viability；inflammatory cytokines；DNA damage

X503.1

A

1000-6923(2016)05-1579-10

焦周光(1990-),男,河北邯鄲人,碩士研究生,主要從事生物氣溶膠與健康,大氣顆粒物相關(guān)毒理學(xué)研究.

2015-10-18

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(41205102)