貴莉莉

(新鄉(xiāng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南　新鄉(xiāng)　453000)

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基于無標(biāo)記的核酸適配體熒光生物傳感器檢測(cè)凝血酶

貴莉莉*

(新鄉(xiāng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000)

設(shè)計(jì)了一個(gè)簡單、通用、基于核酸適配體無標(biāo)記的高敏感、高專一檢測(cè)凝血酶的熒光方法。以無標(biāo)記凝血酶核酸適配體單鏈DNA為識(shí)別元素，PicoGreen染料傳導(dǎo)互補(bǔ)雙鏈的熒光信號(hào)。PicoGreen是一種不對(duì)稱菁，當(dāng)其單獨(dú)存在時(shí)不產(chǎn)生熒光信號(hào)，而當(dāng)其被吸附到互補(bǔ)的雙鏈DNA上時(shí)，可產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào),但被吸附到單鏈DNA上時(shí)，卻無明顯的信號(hào)改變?；谠撔再|(zhì)，將其用于凝血酶的檢測(cè)。該方法對(duì)凝血酶的響應(yīng)線性范圍為1.0×10-14～1.0×10-7mol/L，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.99，檢出限為1.0×10-14mol/L。1.0×10-8mol/L兩種干擾物質(zhì)(牛血清蛋白和細(xì)胞色素C)的存在不影響凝血酶的檢測(cè)，表明該方法對(duì)凝血酶具有非常好的專一性。該方法成功應(yīng)用于對(duì)人血清樣品的檢測(cè)，其平均回收率為97%～102%。方法可簡單、靈敏、特異性地檢測(cè)凝血酶，有望用于醫(yī)學(xué)臨床診斷等領(lǐng)域。

核酸適配體；生物傳感器；熒光；凝血酶

凝血酶是一種普遍存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量為36.7 kDa，等電位點(diǎn)為7.05。凝血酶具有類似激素類的性質(zhì)，它涉及到血栓的形成和血小板的活性。因此，凝血酶在許多心血管疾病診斷中起到非常重要的作用[1]，同時(shí)它被認(rèn)為在炎癥和細(xì)胞壁的修復(fù)進(jìn)程中起調(diào)節(jié)作用。血液中的凝血酶在pmol/L濃度范圍內(nèi)即可與疾病有相關(guān)作用，如血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的診斷[2]，因此在痕量水平高靈敏度檢測(cè)凝血酶具有重要的意義[3]。

適配體[4-6]本質(zhì)上是單鏈寡核苷酸片段，為單鏈DNA或RNA，可與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合。適配體是在體外人工合成隨機(jī)寡核苷酸文庫，由指數(shù)級(jí)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選產(chǎn)生。適配子能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合[7]。而DNA的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾、莖環(huán)、凸環(huán)、G-四面體等)可使核酸分子形成多種三維結(jié)構(gòu)，成為與靶物質(zhì)特定區(qū)域結(jié)合的基礎(chǔ)。目前生物分子檢測(cè)通常采用抗原抗體特異性識(shí)別模式，但由于受到抗體易失活、制備時(shí)間較長等因素的影響，其應(yīng)用受到限制。相比之下，核酸適配體因具有高特異性、高親和力、靶分子廣、體外合成、易于修飾、穩(wěn)定性好、可反復(fù)變性、復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛關(guān)注。

目前關(guān)于凝血酶的檢測(cè)方法有電化學(xué)法[8-9]、電化學(xué)發(fā)光法[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11]、熒光法[12-14]等。這些檢測(cè)方法或儀器昂貴、操作復(fù)雜，或檢測(cè)范圍有限，易受環(huán)境影響，檢測(cè)靈敏度不高。而本文采用無標(biāo)記的適配子熒光法檢測(cè)凝血酶，具有儀器操作簡單、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

核酸適配體(5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3’)購自上海生工生物有限公司。染料PicoGreen購自北京美萊博醫(yī)學(xué)有限公司。凝血酶、牛血清蛋白和細(xì)胞色素C購于Sigma公司。Tris緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.4)，其中含0.001 mol/L MgCl2，0.001 mol/L CaCl2，0.14 mol/L NaCl和0.005 mol/L KCl。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(艾科浦公司生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水)。

F-4500熒光分光光度計(jì)(Hitach公司，日本)。

1.2實(shí)驗(yàn)原理

PicoGreen試劑是一種非對(duì)稱的花青染料，當(dāng)其單獨(dú)存在或者結(jié)合單鏈DNA時(shí)，不產(chǎn)生熒光信號(hào)；而當(dāng)其結(jié)合雙螺旋DNA時(shí)，由于PicoGreen能特異性嵌入互補(bǔ)雙鏈DNA的小溝槽中，可產(chǎn)生比單獨(dú)結(jié)合單鏈DNA時(shí)高1 000倍的熒光信號(hào)[15-17]。本文據(jù)此設(shè)計(jì)了一個(gè)新穎、簡單的熒光適配體生物傳感器以檢測(cè)凝血酶，分子識(shí)別與檢測(cè)原理如圖1所示：凝血酶的存在造成單鏈DNAⅠ發(fā)生構(gòu)象變化，并與目標(biāo)物結(jié)合形成G-四面體結(jié)構(gòu)。當(dāng)與DNAⅠ完全互補(bǔ)的單鏈DNA Ⅱ不存在時(shí)，PicoGreen染料不產(chǎn)生熒光信號(hào)；然而，當(dāng)在該混合溶液中加入DNA Ⅱ時(shí),DNA Ⅱ和未與凝血酶結(jié)合的DNA Ⅰ形成雙螺旋互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，PicoGreen染料嵌入到DNA Ⅱ-DNAⅠ雙螺旋結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，該熒光強(qiáng)度與目標(biāo)物濃度成反比。

2　結(jié)果與討論

2.1凝血酶檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1溶液pH值的優(yōu)化在反應(yīng)體系中，不同pH值的緩沖液對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)具有顯著影響。實(shí)驗(yàn)分別考察了pH 7.4，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6的Tris緩沖溶液對(duì)凝血酶熒光強(qiáng)度檢測(cè)的影響(圖2)。結(jié)果表明pH 8.2的緩沖液稀釋效果最好。

2.1.2PicoGreen與雙螺旋DNA的反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)時(shí)間對(duì)雙螺旋DNA與PicoGreen的結(jié)合能力會(huì)產(chǎn)生一定的影響。將雙螺旋DNA、PicoGreen與1.0×10-13mol/L凝血酶的反應(yīng)體系置于不同時(shí)間下反應(yīng)，檢測(cè)熒光信號(hào)變化值。結(jié)果顯示，反應(yīng)15 min時(shí)熒光信號(hào)達(dá)到飽和。因此，PicoGreen和雙螺旋DNA的最佳孵化時(shí)間為15 min。

2.2靈敏度與線性范圍

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，利用適配體傳感器熒光法檢測(cè)凝血酶，發(fā)現(xiàn)凝血酶濃度越高，與凝血酶結(jié)合的適配體Ⅰ就越多，導(dǎo)致和適配體Ⅱ互補(bǔ)的適配體Ⅰ越少，因此熒光強(qiáng)度越小(圖3)。在1.0×10-14～1.0×10-7mol/L范圍內(nèi)，凝血酶濃度(c，mol/L)的對(duì)數(shù)值與熒光強(qiáng)度變化(ΔF=Fo-F)呈線性關(guān)系(圖3插圖)，其線性方程為ΔF=240.03+17.60lgc，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.99，凝血酶的檢出限為1.0×10-14mol/L。表1比較了不同方法對(duì)凝血酶的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，本文建立的傳感方法呈現(xiàn)了更高的靈敏度。

2.3特異性研究

考察了本方法對(duì)凝血酶檢測(cè)的特異性，將1.0×10-8mol/L牛血清蛋白(BSA)、細(xì)胞色素C(Cyt C)分別與實(shí)驗(yàn)所用的核酸適配體在相同條件下反應(yīng)，并檢測(cè)其相對(duì)于熒光背景的熒光信號(hào)變化(圖4)。結(jié)果顯示，相對(duì)于背景熒光強(qiáng)度，牛血清蛋白和細(xì)胞色素C產(chǎn)生了很小的熒光信號(hào)變化，而凝血酶產(chǎn)生了很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度變化?？紤]到生物分析體系是一個(gè)復(fù)雜的體系，當(dāng)體系中存在與凝血酶適配體部分互補(bǔ)的適配體(5'-CCT TCC TCT GCA TCC-3’)時(shí)，則呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)，但略低于PicoGreen嵌入完全互補(bǔ)的ssDNA Ⅱ-ssDNA Ⅰ所產(chǎn)生的熒光信號(hào)。當(dāng)分別加入1.0×10-8mol/L牛血清蛋白、細(xì)胞色素C和凝血酶時(shí)，相對(duì)于加入部分互補(bǔ)鏈產(chǎn)生的背景熒光信號(hào)，加入凝血酶后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度明顯降低，然而牛血清蛋白和細(xì)胞色素C對(duì)背景信號(hào)幾乎無變化。表明本實(shí)驗(yàn)建立的熒光傳感技術(shù)對(duì)于凝血酶分子檢測(cè)具有較高的特異性。

2.4回收率實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)該方法檢測(cè)實(shí)際樣品的可行性，取不含凝血酶的健康人血清，過濾后將血清樣本稀釋1 000倍，分別添加不同濃度(0.97×10-9，10.2×10-9，49.2×10-9mol/L)的凝血酶進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，凝血酶在人血清樣品中的平均回收率為97%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于4.8%，說明本方法可用于實(shí)際血清樣品中凝血酶的檢測(cè)。

3　結(jié)　論

本文開發(fā)了一種基于適配體的凝血酶熒光檢測(cè)方法，方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.0×10-14mol/L，線性范圍為1.0×10-14～1.0×10-7mol/L。與其他檢測(cè)方法相比，該方法具有操作簡便、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高的特點(diǎn)，可用于其他適配體的目標(biāo)分子檢測(cè)，并為后續(xù)熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Label-free Aptamer-based Fluorescent Detection of Thrombin

GUI Li-li*

(Xinxiang Vocational and Technical College，Xinxiang453000,China)

A simple and universal aptamer-based label-free approach for highly selective and sensitive fluorescence detection of thrombin was designed.The method is based on the specific recognition ability of label-free aptamer towards their targets,and PicoGreen dye was used to transduce the fluorescent signal of the double strand DNA duplex.As an asymmetric cyanine dye,PicoGreen reagent does not produce any fluorescence signal when it extsts alone.However,upon binding to dsDNA,it shows a significant fluorescence signal whereas no significant fluorescence change could be observed when it binds to ssDNA.Based on this property,it was used in the detection of thrombin.The results showed that a dynamic range of 1.0×10-14-1.0×10-7mol/L(r2=0.99) was obtained with a detection limit as low as 1.0×10-14mol/L.In order to determine the specificity of this method,the sensing system against two interfering substances such as bovine serum albumin(BSA) and cytochrome C(Cyt C) was tested.It is found that the interfering substances(each at 1.0×10-8mol/L) could not effect on the detection of thrombin,which indicated the high selectivity of the sensing method toward thrombin.The present method was successfully applied in the determination of thrombin in real human serum with average recoveries of 97%-102%.The experiments results demonstrated that the proposed method was simple,specific and sensitive,and it was hopeful to apply in the field of medical clinical diagnosis.

aptamer;biosensor;fluorescence;thrombin

2016-01-21；

2016-02-22

貴莉莉，碩士，講師，研究方向：分析化學(xué)，Tel:0373-3720000，E-mail:40719606@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.023

O657.1；O629.8

A

1004-4957(2016)08-1054-04