張鵬鵬，王中亮，蘆　玉，崔亞東，楊京霞，2*

（1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽，236037）

血清中有機(jī)磷農(nóng)藥樂果含量的GC-NPD測(cè)定法的研究

張鵬鵬1，王中亮1，蘆玉1，崔亞東1，楊京霞1，2*

（1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽，236037）

目前文獻(xiàn)記載樂果的檢測(cè)多為蔬菜和水果的殘留量，對(duì)中毒病人血液中樂果的檢測(cè)較少，本研究采用氣相色譜法建立一種快速而又準(zhǔn)確的檢測(cè)病人血樣中農(nóng)藥樂果含量的分析方法。以丙酮為萃提溶劑，氮磷檢測(cè)器（NPD），HP-5毛細(xì)管柱，采用程序升溫的方法，在4.51 min出現(xiàn)樂果色譜峰且峰形較好，在濃度為0.65～10.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r值為0.993 4，樂果檢出下限為0.03 μg/mL，回收范圍是90.12%～95.34%，RSD值均小于5%。該方法分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度高，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

血清；樂果；氮磷檢測(cè)器；氣相色譜法。

有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphorus Pesticides）是近年來我國(guó)使用量最大的一類農(nóng)藥，具有藥效高、易降解、種類多、用途廣等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用最為廣泛［1-2］。樂果是常見的有機(jī)磷農(nóng)藥，用于防治多種作物上的刺吸式害蟲如蚜蟲、葉蟬、粉虱等。但樂果較易揮發(fā)，并通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移到人體。陳建秋等［3］的研究表明樂果具有一定的生殖毒性，具有潛在的致畸、致突變和致癌作用［4］。樂果口服中毒后能夠影響全身臟器，并能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)樣癥狀，不僅對(duì)呼吸中樞產(chǎn)生抑制作用，而且還具有較強(qiáng)的外周呼吸肌麻痹作用［5-6］，故其導(dǎo)致呼吸衰竭的發(fā)生率明顯高于其他種類農(nóng)藥，嚴(yán)重的可引起呼吸衰竭而死［7］。樂果中毒的潛伏期較長(zhǎng)，誤服后0.5～2小時(shí)出現(xiàn)中毒癥狀，死亡多在3～30小時(shí)發(fā)生［8］。我國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，特別在農(nóng)村由于自我保護(hù)意識(shí)較差而出現(xiàn)輕度中毒，還有些因家庭糾紛出現(xiàn)服毒自殺情況。鑒于樂果的毒性強(qiáng)，使用廣，致死率高等特點(diǎn)，臨床急救需一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)中毒病人血液中樂果濃度的方法，以便更好的對(duì)病人進(jìn)行監(jiān)控和治療。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樂果檢測(cè)常用的方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）［9］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）［10］、液相色譜法（HPLC）［11］和氣相色譜法（GC）。氣相色譜法在樂果的測(cè)定中應(yīng)用較多，多數(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)都采用氣相色譜法。樂果屬于中極性農(nóng)藥，一般采用非極性、弱極性等毛細(xì)管柱［12-13］。樂果中含有磷元素，多采用氮磷檢測(cè)器（NPD）和火焰光度檢測(cè)器（FPD）［14-15］。目前關(guān)于樂果的檢測(cè)多集中在水果、蔬菜等農(nóng)副產(chǎn)品的表面殘留上，對(duì)于血液這種復(fù)雜的載體，文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文采用氣相色譜法對(duì)病人血液中樂果的濃度進(jìn)行檢測(cè)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值和創(chuàng)新性。

1　材料與方法

1.1試劑

健康人血液；樂果標(biāo)準(zhǔn)液（100 μg/mL，北京中科儀友化工技術(shù)研究院）；丙酮（分析純，西隴化工股份有限公司）；超純水等。

1.2儀器

氣相色譜儀（安捷倫7890-A，配NPD）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q）；氮?dú)獍l(fā)生器（UNPN2-1500C-E）；離心機(jī)（MiniSpin）等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樂果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精密量取500 μL的樂果標(biāo)準(zhǔn)液至1.5 mL EP管中，再精密量取丙酮500 μL定容至1 mL，混勻即可得50 μg/mL樂果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.3.2中毒樣品的制備

取健康人血液放置4℃冰箱，1小時(shí)后10 000 r/min離心3分鐘，分離血清。取血清0.5 mL于EP管中，準(zhǔn)確移取100 μg/mL樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液0.03 mL、0.09 mL、0.15 mL于上述EP管中，在振蕩混勻器上振蕩混勻，然后加丙酮1 mL，振蕩2 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液，殘?jiān)儆帽吞嵋淮?，離心后取上清，合并兩次離心所得的上清液，用丙酮溶液定容至3.0 mL，即制備成低濃度（1.0 μg/mL）、中濃度（3.0 μg/mL）、高濃度（5.0 μg/mL）樂果中毒樣品。

1.3.3氣相色譜條件

檢測(cè)器：NPD，溫度300℃；色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱（30 m*0.320 mm*0.25 μm）；色譜柱程序升溫條件：120℃保持1 min，然后以20℃/min升至270℃，保持2 min；流速7 mL/min；進(jìn)樣口溫度：220℃；進(jìn)樣量：2 μL；進(jìn)樣方式：無分流進(jìn)樣。色譜圖見圖1-3。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1線性測(cè)定

取50 μg/mL的樂果儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成10 μg/ mL、7.5 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.65 μg/mL的樂果溶液，分別進(jìn)樣分析，每個(gè)樣品測(cè)定三次。由樣品的峰面積和對(duì)應(yīng)濃度所計(jì)算的樣品質(zhì)量的散點(diǎn)圖呈直線趨勢(shì)，作線性回歸分析，得回歸方程為Y=213.6X+368.6，r=0.9934，結(jié)果表明樂果在濃度0.65 μg/mL～10.00 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好。

2.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取病人甲血樣5份，按上述樣品制備方法進(jìn)行處理，測(cè)得病人血樣中樂果的濃度為0.36 μg/ mL，峰面積的RSD值為4.33%，實(shí)驗(yàn)表明該方法的重復(fù)性較好。

2.3最低檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)

將50 μg/mL的樂果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋成1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、0.025 μg/mL，備用，根據(jù)檢測(cè)限計(jì)算方法3C/（S/N），即當(dāng)測(cè)量峰高是噪音峰高的3倍時(shí)，此時(shí)濃度為檢測(cè)限濃度，本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得樂果的最低檢測(cè)限濃度為0.03 μg/mL。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將病人血樣按上述樣品制備方法處理后，于室溫放置2 h、4 h、5 h、7 h、8 h、10 h后分別進(jìn)樣分析，測(cè)得樂果峰面積的RSD值為2.98%，結(jié)果表明樂果在室溫條件下10 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

圖1　丙酮溶液色譜峰（100 μg/mL）

圖2　樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰（5.0 μg/mL）

圖3　病人血液色譜峰（0.12 μg/mL）

2.5回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取已知樂果濃度的病人血樣9份，每份100 μL，分別加入一定量的樂果標(biāo)準(zhǔn)液，制成含

樂果濃度為80%、100%、120%μg/mL的樣品溶液各3份，進(jìn)樣分析，

結(jié)果如表1。

表1 樂果回收率結(jié)果

2.6樣品的測(cè)定

取病人乙血樣按照樣品制備方法處理后進(jìn)樣分析，經(jīng)外標(biāo)法計(jì)算得病人血樣中樂果的濃度為0.12 μg/mL。

3　結(jié)論與討論

3.1色譜條件的研究

在氣相色譜條件探究過程中，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于柱溫進(jìn)行了一系列研究。方法一：色譜柱120℃保持2 min，然后以5℃/min升至240℃，保持2 min，再以25℃/min升溫至270℃，保持2 min；方法二：色譜柱80℃保持2 min，然后以10℃/min升至270℃，保持3 min；方法三：120℃保持1 min，然后以20℃/min升至270℃，保持2 min。方法一雖然有樂果峰出現(xiàn)，但是多次測(cè)量結(jié)果RSD≥5%，而且整個(gè)圖譜中雜峰較多，干擾樂果峰的分離。方法二樂果峰出現(xiàn)較好，基本無拖尾現(xiàn)象，且出峰時(shí)間附近無雜峰干擾，但是樣品分析時(shí)間達(dá)20 min以上，不能達(dá)到快速高效的目的。因此將這兩種方法進(jìn)行優(yōu)化，確定方法三，樂果出峰時(shí)間在4.51 min附近，且峰型良好，該方法分析過程短，精密度高，可為臨床治療提供一定的依據(jù)。

3.2樣品制備方法的研究

在樣品制備過程中，先后采用氯仿、高氯酸和丙酮進(jìn)行處理，高氯酸和氯仿與樂果不能有效分離且樂果峰拖尾嚴(yán)重，以丙酮做為萃提溶劑，丙酮與樂果出峰時(shí)間間隔較長(zhǎng)（如圖1圖2所示），可以完全分離沒有干擾，樂果峰峰形尖銳且較為對(duì)稱，最后確定丙酮為萃提試劑。

現(xiàn)有文獻(xiàn)記載樂果的檢測(cè)多為蔬菜和水果，對(duì)中毒病人血液中的檢測(cè)較少，該方法擴(kuò)大了樂果的檢測(cè)范圍，可以很好的分離血液中的蛋白質(zhì)，并能準(zhǔn)確較快的檢測(cè)出血清中樂果的濃度，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和創(chuàng)新性。

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GC-NPD testing content of Dimethoate in Organophosphorus pesticide in serum

ZHANG Peng-peng1，WANG Zhong-liang1，LU yu1，CUI Ya-dong1，YANG Jing-xia1，2*

（1.School of biological and food engineering，F(xiàn)uyang Normal University；2.Engineering Technology Research Center of Antiaging Chinese Herbal Medicine of Anhui Province，F(xiàn)uyang Anhui 236037，China）

A rapid and accurate detection of content of dimethoate in patients'blood samples was established by the gas chromatography.With acetone as extraction solven，using nitrogen and phosphorus detector（NPD）as well as chromatographic column for HP-5 capillary column，，the experimental results showed that dimethoate peak time is 4.51 min by temperature-programmed method.In the range of 0.65 μg/mL to 10 μg/mL，the linear relationship is good，and the correlation coefficient r value is 0.993 4，and the detection limit of dimethoate is 0.03 μg/mL，and the recovery range is 90.12%～90.12%，while RSD values are less than 5%.The current literatures for the detection of dimethoate residues are mainly for fruits and vegetables，while the detection of dimethoate in the blood of poisoning patients is less.This testing method is fast and accurate，with high clinical application significance and innovation.

serum；organophosphorus pesticide；nitrogen and phosphorus detector；gas chromatography

R979.9

A

1004-4329（2016）02-046-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2016）02-046-04

2015-07-14

阜陽師范學(xué)院省級(jí)平臺(tái)委托專項(xiàng)（2014KSLZX02）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（AH20141037108 9，AH201510371066）資助。

楊京霞（1982－），女，碩士，講師，研究方向：中草藥成分及活性研究。Email：yangjingxia1228@126.com。