李諾敏，邱云潔，慶宏

（北京理工大學生命學院，北京，100081）

早衰因子及其突變對BACE1活性調(diào)控的研究

李諾敏，邱云潔，慶宏*

（北京理工大學生命學院，北京，100081）

阿爾茲海默癥（Alzheimer's Disease，AD）是一種以記憶力減退、認知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型病理特征為神經(jīng)元胞外沉積的大量β淀粉樣蛋白（Amyloid β peptide，Aβ）而形成的老年斑。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）通過β-分泌酶（beta-site amyloid β precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）和γ-分泌酶有序切割產(chǎn)生的。而γ-分泌酶的活性中心早衰因子（Presenilin1，PS1）對BACE1的調(diào)控作用，可能對Aβ的產(chǎn)生發(fā)揮重要的作用。通過Western Blot和Real Time PCR的方法探討了PS1缺失情況下，BACE1的表達水平以及活性，結果顯示在MEF PS1敲除細胞中，BACE1的表達水平會顯著下降，對APP的水解切割能力也會顯著下調(diào)，當瞬時轉染PS1后，這種現(xiàn)象會被翻轉，BACE1的表達水平和mRNA水平均會顯著上調(diào)。同時還發(fā)現(xiàn)在加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458后，也可以很好的翻轉MEF PS1-/-PS2-/-細胞中瞬時過表達PS1后所產(chǎn)生的影響。PS1突變L166P和Q223R可以顯著性的增加APP的水解切割過程以及BACE1的表達水平以及活性，當加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458后，能顯著性的抑制PS1突變對BACE1的表達水平，活性以及mRNA水平。以上結果表明，PS1能夠調(diào)控BACE1的表達水平，進而影響Aβ的產(chǎn)生。

阿爾茲海默癥； β-分泌酶； 活性中心早衰因子

阿爾茲海默癥（Alzheimer's Disease，AD）是一種以記憶力減退、認知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型病理特征為神經(jīng)元胞外沉積的大量β淀粉樣蛋白（Amyloid β peptide，Aβ）而形成的老年斑［1］。老年斑的主要組成為淀粉樣蛋白Aβ40和Aβ42，其中Aβ42為毒性成分［2］。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）通過β-分泌酶（beta-site amyloid β precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）和γ-分泌酶有序切割產(chǎn)生的［3］。首先BACE1切割APP，生成分泌型的sAPPβ及跨膜的羧基末端C99，切割形成的羧基端片段C99繼續(xù)在γ-分泌酶作用下，產(chǎn)生Aβ［4］。而在非Aβ生成途徑中，APP首先在Aβ部分被α-分泌酶切割產(chǎn)生分泌型sAPPα和C83。C83繼續(xù)被γ-分泌酶切割但不產(chǎn)生Aβ。在正常狀態(tài)下體內(nèi)以非Aβ生成途徑為主

BACE1作為APP水解切割產(chǎn)生Aβ的關鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)在AD病人腦內(nèi)BACE1基因表達上調(diào)且活性增加［5，6］，這表示BACE1的表達調(diào)控在AD病理過程中具有重要作用。

γ-分泌酶是一種由多個亞基構成的復合體，目前已知它包括早衰因子（Presenilin，PS1/2），Nicastrin，Aph1及Pen-2。PS1作為γ-分泌酶的重要組成參與APP的代謝，由PS1基因突變而導致的AD約占家族性AD（Family Alzheimer's Disease，F(xiàn)AD）的90%，家族性AD中的PS突變可能是通過影響PS依賴的γ-分泌酶活性而改變APP水解切割和Aβ產(chǎn)生的，繼而引發(fā)一系列神經(jīng)退行性病變［7］。有研究表明目前已有許多關于PS1突變的報道，與家族性AD有關的大多數(shù)PS1突變位于早衰因子的跨膜區(qū)［8，9］，PS1突變可以調(diào)控BACE1的表達和活性，增加Aβ42的生成。因此我們選取有關PS1的兩種家族性突變L166P及Q223R，就其對BACE1的調(diào)控及其在APP水解切割過程的影響進行探究。結果顯示瞬時轉染PS1-L166P或Q223R 到PS1-/-PS2-/-細胞后，BACE1的表達和活性顯著上調(diào)。當加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458后，可以有效反轉PS1-/-PS2-/-細胞中瞬時過表達PS1后所產(chǎn)生的影響。因此我們的結果表明PS1能夠調(diào)控BACE1的表達和活性，并且與家族性AD相關的突變體PS1-L166P、PS1-Q223R可以通過增加BACE1表達或促進BACE1蛋白的活性，影響APP的水解切割過程。

1　材料與方法

1.1試劑與耗材

DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）培養(yǎng)基（高糖型，含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉）、Opti-MEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；100×雙抗（10kU/ml青霉素+ 10mg/ml硫酸鏈霉素）、0.25%胰酶-EDTA購自北京索來寶公司，γ-分泌酶抑制劑L-685，458購自美國Sigma公司；轉染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司；RNA抽提試劑Trizol Reagent購自invitrogen公司；反轉錄使用RNasin Plus RNase Inhibitor、RNase-free water、Oligo（dT）15 Primer、dNTP、M-MLV Reverse Transcriptase購自美國Promega公司；2×TransStart Top Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；抗BACE1小鼠單抗購自美國R&D公司；兔源抗體C20（抗APP C端）為加拿大哥倫比亞大學宋偉宏教授惠贈；抗β-actin小鼠單抗購自美國Sigma公司；HRP標記山羊抗小鼠二抗、HRP標記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；IMMOBILON WESTERN CHEMILUM HRP化學發(fā)光底物購自美國Millipore公司；Human Aβ42試劑盒，HumanAβ40試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2細胞培養(yǎng)，轉染與抑制劑處理

MEF（PS1-/-PS2-/-，PS1+/+PS2+/+，PS1-/-）細胞來源于小鼠胚胎成纖維細胞，細胞在含有10%胎牛血清、1%NEAA（非必需氨基酸）和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞于37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿，待細胞密度達到70～80%時，按照質粒與lipofectamine2000 1:2的比例稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，靜置20min，將混合液加入細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，4～6h后更換為完全培養(yǎng)基，轉染48h后收集細胞。γ-分泌酶抑制劑為細胞轉染48h后加入，10μM處理90min。

1.3Western blot檢測

細胞轉染48h后，胰酶消化，離心收集細胞，加入適量含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解30min，超聲破碎，4℃ 12000rpm離心10min，取上清，Bradford法進行蛋白定量。取50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后將蛋白轉移至PVDF膜，PVDF膜置于質量分數(shù)為5%脫脂牛奶中室溫封閉1h，一抗（C20 1：10000，BACE1 1:1000，β-acting 1:8000）4℃孵育過夜；TBST洗6次，每次10min，加入對應的辣根過氧化物酶標記的二抗（山羊抗小鼠，山羊抗兔1:5000）室溫孵育2h，TBST洗6次每次10min，ECL顯影，灰度分析使用Image Lab軟件。APP-CTF使用16.5% Tris-tricine膠檢測。

1.4RNA提取與Real-time PCR檢測

細胞轉染48h后，使用Trizol Reagent（invitrogen）抽提總RNA，根據(jù)測定的RNA濃度，計算5μg RNA體積進行反轉錄；Real-time PCR檢測BACE1基因（Forward：TGGAGGGCTT TGGAGGGCTTCTACGTTGTCTT，Reverse:CATCATGGAAGGTTT CTATGTCGTCTTC），內(nèi)參GAPDH（Forward:GACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC，Reverse:TGG GTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT）。

1.5ELISA檢測

Aβ檢測根據(jù)Aβ ELISA試劑盒說明書操作。細胞轉染48h后，收集細胞上清液為待測樣品；試劑盒室溫平衡20min，在樣品孔中加入10μL樣品和40μL稀釋液的混合液，在標準孔中加入50μL不同濃度梯度的標準品，對照孔加入50μL的未培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，Blank孔中不加入任何液體，隨后在各孔中加入檢測抗體50μL，室溫孵育3h；孵育完成后，棄去孔內(nèi)的液體，用wash buffer洗四次，每次1min；在孔內(nèi)加入100μL Anti-Rabbit IgG HRP溶液，室溫孵育30min；孵育完成后，棄去孔內(nèi)的液體，用wash buffer洗四次，每次1min；在孔內(nèi)加入100μL的Stabilized Chromogen，這時孔中液體逐漸變藍，在室溫下避光孵育30min；孔中加入100μL的終止液，待孔中液體變黃，30min內(nèi)在450nm處進行檢測；根據(jù)標準品的吸光值繪制出標準曲線，計算每孔樣品內(nèi)Aβ42和Aβ40的含量。

1.6統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)及其標準差均采用Microsoft Office Excel 2010和GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計與計算，Western Blot用Image Lab Version 4.0進行相對定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±標準差呈現(xiàn)。對數(shù)據(jù)進行兩兩比較時采用t-test進行顯著性分析，組間采用one-way ANOVA（ Dunnett's post hoc test ），p＜0.05即認為結果顯著。

2.　實驗結果

2.1PS1調(diào)控BACE1蛋白轉錄及翻譯

研究發(fā)現(xiàn)AD病人腦內(nèi)BACE1基因表達上調(diào)，其表達調(diào)控在AD病理過程中具有重要作用，因此我們首先研究了PS1是否會影響B(tài)ACE1蛋白的表達水平。與對照組MEF PS1-/-PS2-/-細胞相比，過表達PS1后細胞內(nèi)BACE1蛋白的表達水平顯著上調(diào)。

由于BACE1的基因表達可在轉錄水平調(diào)控，我們就PS1對BACE1 mRNA水平的影響進行探討。結果顯示當MEF PS1-/-PS2-/-細胞中瞬時過表達PS1后，BACE1的mRNA水平顯著上調(diào)。這一結果與BACE1蛋白水平的變化一致。也有研究者在HEK293細胞中發(fā)現(xiàn)了類似的結果，HEK293細胞中瞬時轉染PS1-WT后，BACE1的mRNA水平以及BACE1的活性都出現(xiàn)了上調(diào)趨勢［10］。

圖1　MEF PS1-/-PS2-/-及過表達PS1細胞中BACE1蛋白表達水平的改變Fig.1 The effect of PS1/PS2 knock out on BACE1 protein level in MEF cell line

圖2　MEF PS1-/-PS2-/-細胞中BACE1 mRNA水平的改變Fig.2 The effect of PS1/PS2 knock out on BACE1 mRNA level in MEF cell line

2.2FAD相關PS1突變影響APP水解切割

與家族性AD有關的多數(shù)PS1突變可以通過降低Aβ40或增加Aβ42上調(diào)Aβ42與Aβ40的比例［11，12］。PS1突變L166P及Q223R分別位于PS1的第2及第5個跨膜區(qū)，為了探究這兩種家族性突變對Aβ生成的影響，我們首先對過表達突變體L166P 及Q223R后分泌型Aβ水平進行檢測。結果顯示，與野生型PS1相比，過表達L166P或Q223R時分泌到細胞外的Aβ水平發(fā)生改變，Aβ42與Aβ40的比例顯著性上調(diào)。

圖3　.28 PS1突變對Aβ42/Aβ40的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）The Aβ42/ Aβ40 ratio.

圖3　PS1突變對APP水解切割過程的影響Fig.3 The effect of Presenilin1 mutations on APP cleavage pathway

由于APP、BACE1及γ-分泌酶對Aβ產(chǎn)生過程中的重要性，結果提示我們PS1突變在影響PS1功能的同時也會影響B(tài)ACE1的表達和活性，因此我們對BACE1的蛋白水平及其切割APP產(chǎn)生的CTF水平進行檢測，在20E2細胞中過表達PS1-L166P或Q223R后，與野生型PS1相比，PS1突變L166P與Q223R會顯著性增加CTF99的水平，相對應的APP水平顯著下降，表明這兩種PS1突變可以顯著性促進APP的水解過程，促進BACE1的水解切割活性。同時，突變體L166P過表達后BACE1蛋白水平?jīng)]有顯著變化，而轉入Q223R時BACE1的表達水平顯著提高，繼而促進APP的水解切割，引起CTF99表達水平的增加。

圖4　APP蛋白水平灰度分析圖（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.4 Relative level of APP（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5　C99表達水平灰度分析圖（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.5 Relative level of C99（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3γ-分泌酶抑制劑調(diào)控BACE1的表達和活性

為了進一步驗證PS1及其突變對BACE1活性及表達水平的影響，加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458研究其能否抑制BACE1的表達水平或活性。在MEF PS1-/-PS2-/-轉入PS1-WT、PS1-L166P或PS1-Q223R時，BACE1的表達水平和活性均上調(diào)；當加入γ-分泌酶抑制劑后，其BACE1蛋白的表達水平顯著下降，而且對APP的切割水平具有顯著的抑制作用。Luca研究小組也發(fā)現(xiàn)，在HEK293細胞中一些PS1突變可以增加BACE1的mRNA水平和表達水平，包括M146V，S170F，L392V和A246E，當加入γ-分泌酶抑制劑XIX后，BACE1的表達水平和mRNA水平下調(diào)，這個結果與本實驗得到結果具有一致性。

同時我們也對瞬時轉染PS1突變后加入γ-分泌酶抑制劑時BACE1 mRNA水平進行檢測。結果與BACE1蛋白水平具有一致性，在瞬時轉入PS1突變：L166P和Q223R后加入γ-分泌酶抑制劑L-685，458，能夠顯著性的降低BACE1蛋白mRNA的水平。以上結果表明在加入γ-分泌酶抑制劑后，γ-分泌酶抑制劑L-685，458能夠抑制了PS1的活性，而PS1活性的喪失會導致BACE1蛋白水平和活性的下降。

圖3　.31: γ-分泌酶抑制劑L-685，458對BACE1蛋白表達水平及APP水解切割的影響Figure 3.31 The effect of γ-secretase inhibitor L-685.458 on BACE1 level and APP pathway

圖3　.33 γ-分泌酶抑制劑L-685，458對BACE1 mRNA水平的影響（*P＜0.05，**＜0.01）Figure 3.33 The effect of γ-secretase inhibitor L-685，458 on BACE1 mRNA level（*P＜0.05，**＜0.01）

3.　討論

BACE1作為APP水解過程的關鍵酶，對于Aβ生成和AD的病理發(fā)生具有至關重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)PS1作為γ-分泌酶的重要組成，可以調(diào)控BACE1的成熟與活性［13］。我們首先在MEF PS1-/-PS2-/-細胞中驗證PS1對BACE1的調(diào)控作用，結果顯示當轉入PS1后，BACE1的蛋白水平和mRNA水平顯著上調(diào)，說明PS1可在轉錄和翻譯水平均可調(diào)控BACE1。

與家族性AD有關的PS1突變可以改變PS1的功能，是否也會影響B(tài)ACE1的表達和活性，為了研究與FAD有關的PS1突變對BACE1的調(diào)控作用，我們選取了分別位于PS1蛋白第2及第5個跨膜區(qū)上的突變位點L166P及Q223R，對其APP水解切割過程相關產(chǎn)物進行檢測。結果表明，這兩種PS1突變均可促進BACE1對APP的水解作用，并提高Aβ42與Aβ40的比例。而且轉入Q223R突變后的BACE1蛋白水平也顯著上調(diào)，而當轉入L166P突變后BACE1水平并沒有顯著改變，表明不同突變體可能通過不同方式，包括促進BACE1的轉錄和翻譯以及增加BACE1的活性調(diào)控BACE1的功能［14］。利用γ-分泌酶抑制劑L-685，458抑制PS1蛋白的功能活性，此時無論野生型或兩種PS1突變，BACE1的表達水平和活性均相應下調(diào)，進一步驗證了PS1及其突變對BACE1的調(diào)控作用。

不同的PS1突變可以通過增加BACE1的表達或促進其活性繼而影響β-分泌酶的功能，而對于PS1與BACE1的具體作用機制仍然未知，PS1對BACE1表達水平的調(diào)控是否由于啟動子或轉錄水平的調(diào)控實現(xiàn)的，仍需要利用熒光素酶及染色質免疫共沉淀的方法進一步研究，而PS1對BACE1蛋白功能的促進作用具體發(fā)生機制也需要深入探討。綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)PS1及其突變L166P、Q223R能夠調(diào)節(jié)BACE1的表達和活性，影響APP水解切割和Aβ的產(chǎn)生，這為研究AD的發(fā)病機制及尋找新的AD治療靶點提供了理論基礎。

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The Investigation of Regulatory Role of Presenilin1 in BACE1 Activity and Expression

Li Nuomin，Qiu Yunjie，Qing Hong*
（Beijing Institute of Technology School of Life Sciences，Beijing，100081）

As a kind of neurodegenerative disease，Alzheimer's disease（AD）is characterized by memory loss and cognitive disorder. The typical pathological feature of AD is the senile plaques accumulated in the extracellular matrix of central nervous system. Amyloid β peptide（Aβ），the main component of senile plaques，is sequentially generated by Beta-site amyloid β precursor protein cleaving enzyme 1（BACE1）and γ-secretase through the hydrolysis of Amyloid precursor protein（APP）. Presenilin1（PS1）is the active site of γ-secretase and may be of great importance in the synthesis of Aβ due to its regulatory role towards BACE1. In the present study，the expression and activity of BACE1 was investigated in the absence of PS1. The results showed that both of the two parameters were significantly decreased in MEF PS1-/-cell line，which was reversed when transiently transfected with PS1. Meanwhile，the effects caused by transient overexpression of PS1 could be potently suppressed by γ-secretase inhibitor L-685，458 in MEF PS1-/-PS2-/-cells. PS1 mutations，L166P and Q223R，dramatically enhanced BACE1 expression and activity，and thus increased the amount of Aβ. L-685，458 also notably inhibited the function of PS1 mutations. All the data above supports the conclusion that PS1 regulates BACE1 and thereby affects the synthesis of Aβ.

Alzheimer's Disease； BACE1； PS1

Q74 ［Document Code］ A

10. 11967/ 2016140407

Q74

ADOI：10. 11967/ 2016140407

國家自然基金（項目編號：81171206）。

李諾敏，博士，研究方向：神經(jīng)生物學。

慶宏 教授。Email：hqing@bit.edu.cn。