林羅敏，唐鵲輝，彭　亮，韋桂峰，林叔忠，李湘姣，楊浩文

(1:暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心，廣州 510632) (2:廣東省水文局，廣州 510150)

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浮游植物葉綠素a的微波法研究及其與反復(fù)凍融法的比較*

林羅敏1，唐鵲輝1，彭亮1，韋桂峰1**，林叔忠2，李湘姣2，楊浩文2

(1:暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心，廣州 510632) (2:廣東省水文局，廣州 510150)

為縮短樣品處理時(shí)間和提高測(cè)定準(zhǔn)確度，本文設(shè)計(jì)和優(yōu)化了微波處理輔助提取浮游植物葉綠素a的方法，并比較了反復(fù)凍融法和微波法對(duì)浮游植物葉綠素a的提取效率. 結(jié)果表明：(1)微波法提取葉綠素a的最優(yōu)處理?xiàng)l件為：高火(額定輸出功率800W)處理60s左右. 過(guò)濾水量為：貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml以上，中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100～500ml. (2)反復(fù)凍融法在測(cè)定貧營(yíng)養(yǎng)型水體時(shí)更穩(wěn)定，而微波法對(duì)中、富營(yíng)養(yǎng)水樣提取率顯著高于凍融法，可提高7%～12%，對(duì)具膠被及硅質(zhì)外殼的藻類提取效率極顯著高于凍融法，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差更小，且提取時(shí)間較凍融法縮短一半以上，適用于富營(yíng)養(yǎng)化水體的應(yīng)急監(jiān)測(cè).

微波法；反復(fù)凍融法；提取；浮游植物；葉綠素a

葉綠素a是表征藻類現(xiàn)存量的一個(gè)重要指標(biāo)[1]，可在一定程度上反映水體初級(jí)生產(chǎn)力和浮游植物生物量[2]，是水體富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)和水華預(yù)警的重要依據(jù)[3]. 因此，葉綠素a濃度的準(zhǔn)確測(cè)定是水體富營(yíng)養(yǎng)化研究和水質(zhì)評(píng)價(jià)的重要基礎(chǔ)[1]. 在葉綠素a的測(cè)定過(guò)程中，較高的提取率是保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的前提. 目前常用的提取方法是利用反復(fù)凍融細(xì)胞破碎藻類細(xì)胞，再用丙酮或乙醇等有機(jī)溶劑浸提細(xì)胞溶出物中的葉綠素[4-7]，該方法凍融操作簡(jiǎn)單，與有毒溶劑接觸時(shí)間短[7-8]，但耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，且可能對(duì)具膠被或硅質(zhì)殼藻細(xì)胞的破碎能力較弱.

自1986年開(kāi)始利用微波技術(shù)從羽扇豆中提取鷹爪豆生物堿以來(lái)[9]，微波輔助技術(shù)(microwave-assistedextraction,MAE)在色素的提取工藝中被廣泛應(yīng)用[10-12]. 微波法通過(guò)升溫汽化胞內(nèi)液體，使細(xì)胞膨脹破裂，內(nèi)容物自由流出，因此萃取率較高[13]. 但此方法對(duì)浮游植物細(xì)胞尤其是具膠被或硅質(zhì)殼藻細(xì)胞是否具有較強(qiáng)的破碎能力和較高的葉綠素提取效果還有待驗(yàn)證. 為縮短樣品處理時(shí)間和提高測(cè)定的準(zhǔn)確度，本文設(shè)計(jì)并優(yōu)化了微波法提取浮游植物葉綠素a的處理?xiàng)l件，比較了優(yōu)化后的微波法和反復(fù)凍融法(Freezing-thawing,FT)對(duì)葉綠素a的提取率及兩種方法的穩(wěn)定性，提出適合不同營(yíng)養(yǎng)水平水體葉綠素a的測(cè)定方法.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

純?cè)逡簶悠罚簩?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和顆粒直鏈藻(Melosira granulata).

野外樣品：湖泊(暨南大學(xué)南湖S1 、明湖S2)、河流(流溪河石海橋S3、珠江獵德大橋S4)、水庫(kù)(流溪河水庫(kù)S5、南屏水庫(kù)S6)，其中S1、S3、S5葉綠素濃度較低，S2、S4、S6葉綠素濃度較高.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括微波處理?xiàng)l件優(yōu)化及其與反復(fù)凍融法提取葉綠素效果比較兩部分，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1. 1.2.1 微波法操作步驟及實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化用醋酸纖維濾膜(0.45μm)過(guò)濾一定量的水樣，再將濾膜折疊為1/4后，置于對(duì)折的定性濾紙中遮光并吸去濾膜背面水分. 將濾膜連同定性濾紙和裝有小半杯水的燒杯(防止微波爐空燒)放入微波爐(型號(hào)：P80D23N2L-A9(R0)，額定輸出功率800W)中，在高火(額定輸出功率100%輸出，即800W功率輸出[14])條件下進(jìn)行微波破壁處理.

破壁處理后將濾膜取出放入盛有10ml90%丙酮溶液的離心管中，用快速混勻器/手搖震蕩1min后放于4℃冰箱浸提8h以上，再經(jīng)過(guò)7000轉(zhuǎn)/min離心15min后，用HitachiU-3900紫外分光光度計(jì)于630、645、663和750nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值后計(jì)算得出葉綠素a濃度[15].

根據(jù)葉綠素a的測(cè)定結(jié)果，確定微波法中最優(yōu)的微波處理時(shí)長(zhǎng)和過(guò)濾水量. 1.2.2 比較微波法和反復(fù)凍融法提取效果分別用微波法和反復(fù)凍融法(-20℃冷凍20min，取出室溫融解5～10min，反復(fù)凍融5次，90%丙酮4℃浸提20h)[8]提取純?cè)逡?銅綠微囊藻、蛋白核小球藻和顆粒直鏈藻)以及野外水樣(S1、S2、S3、S4、S5和S6)的葉綠素a濃度. 微波法和反復(fù)凍融法樣品統(tǒng)一批次、濃度及過(guò)濾水量等條件，保證結(jié)果的可比性；所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組平行，保證重復(fù)性.

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)*Tab.1 Experimental design

*Mic.：銅綠微囊藻；Chl.：蛋白核小球藻；Mel.：顆粒直鏈藻.

1.3 數(shù)據(jù)分析與繪圖

利用SPSS20.0進(jìn)行單因素方差分析；用Origin8.0軟件完成繪圖.

圖1 不同微波處理時(shí)間對(duì)野外水樣(S1) 葉綠素a濃度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on determination of chlorophyll-a concentration from field water samples

2 結(jié)果與討論

2.1微波法的處理?xiàng)l件篩選

2.1.1 微波處理時(shí)間對(duì)葉綠素提取效果的影響微波法主要通過(guò)微波破壁產(chǎn)生裂縫和空隙[11-12]，有助于有機(jī)溶劑丙酮有效地溶出葉綠素. 微波處理時(shí)長(zhǎng)直接影響提取效果. 對(duì)于野外水體(S1)，微波處理60s后的葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果顯著高于處理30s后的測(cè)定結(jié)果(P<0.05)，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小(圖1). 但隨著處理時(shí)間的增加，葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果并未顯著升高，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)150s時(shí)，微波可能破壞了藻細(xì)胞體內(nèi)的葉綠素a結(jié)構(gòu)[15]，導(dǎo)致測(cè)定的葉綠素a濃度顯著下降(P<0.05). 對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的不同濃度的微囊藻藻液和小球藻藻液，微波處理時(shí)間超過(guò)60s時(shí)，葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2). 因此，最適的微波破壁處理時(shí)長(zhǎng)為60s左右.

圖2 不同微波處理時(shí)間對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)藻液葉綠素a濃度的影響(a：銅綠微囊藻; b：蛋白核小球藻)Fig.2 Effect of microwave irradiation time on determination of chlorophyll-a concentration from cultured samples (a： Microcystis aeruginosa; b： Chlorella pyrenoidosa)

2.1.2 過(guò)濾水量對(duì)微波法提取效果的影響過(guò)濾水量為50ml時(shí)，S2水樣的葉綠素a提取效果較差，可能是由于此時(shí)濾膜上葉綠素過(guò)少，濃度低于檢測(cè)限，導(dǎo)致測(cè)量值偏低(圖3). 當(dāng)過(guò)濾水量增加到100、500ml時(shí)，提取效果顯著提高(P<0.05)，但當(dāng)過(guò)濾水量為1000ml時(shí)，葉綠素a濃度測(cè)定值略降低(圖3)，這可能與過(guò)濾時(shí)間較長(zhǎng)，葉綠素部分分解有關(guān)[16]，也可能與泥沙等雜質(zhì)增多，干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有關(guān). 因此，以葉綠素a濃度為15μg/L左右的富營(yíng)養(yǎng)水樣為例，微波法提取葉綠素a的最適過(guò)濾水量為100～500ml. 隨著葉綠素a濃度的升高或降低，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整過(guò)濾水量：貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml；中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100～500ml.

圖3 微波法對(duì)不同體積野外水樣(S2) 葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The determination of chlorophyll-a concentration in field samples with different volumes by MAE

2.2 微波法和反復(fù)凍融法對(duì)葉綠素a提取效果的比較

對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的微囊藻藻液，微波法和反復(fù)凍融法對(duì)葉綠素a的提取效果無(wú)顯著差異(圖4a)，這可能與微囊藻細(xì)胞體積小、細(xì)胞壁薄[8]有關(guān)；對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的小球藻和直鏈藻藻液，微波法提取效果顯著高于反復(fù)凍融法(P<0.05)，這可能是因?yàn)槲⒉ㄝ椛渚鶆?，選擇性強(qiáng)[13]，對(duì)具細(xì)胞個(gè)體膠被的小球藻和具硅質(zhì)外殼的直鏈藻細(xì)胞壁的破碎效果較好. 而反復(fù)凍融法通過(guò)冷凍使細(xì)胞內(nèi)形成冰粒和細(xì)胞液濃度增高引起溶脹[17]，依賴多次反復(fù)冷凍及室溫解凍，受環(huán)境因素影響較大，破壁效果較差.

用微波法和反復(fù)凍融法分別測(cè)定以藍(lán)、綠藻占優(yōu)勢(shì)的湖泊和水庫(kù)水樣以及以硅藻占優(yōu)勢(shì)的河流水樣中的葉綠素a濃度. 當(dāng)葉綠素a濃度較低時(shí)(S1、S3和S5)，兩種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異；當(dāng)葉綠素濃度較高(S2、S4和S6)時(shí)，微波法的測(cè)定結(jié)果顯著高于反復(fù)凍融法(P<0.05)，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，此時(shí)微波法的提取效果更好(圖4b).

3 結(jié)論

1)微波法提取葉綠素a的最優(yōu)處理?xiàng)l件為：高火(額定輸出功率800W)60s左右. 最佳過(guò)濾水量為：貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml；中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100～500ml.

2)微波法提取對(duì)具有膠被和硅質(zhì)外殼的藻類提取效率優(yōu)于凍融法，且誤差更小.

圖4 微波法和反復(fù)凍融法對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)藻液(a)和野外水樣(b)葉綠素a濃度測(cè)定結(jié)果的比較Fig.4 Comparison of determination of chlorophyll-a concentration in cultured samples(a) and in field samples(b) by MAE and FT

3)兩種方法在操作上均較簡(jiǎn)單易行. 反復(fù)凍融法在測(cè)定貧營(yíng)養(yǎng)水體葉綠素a濃度上具有一定的優(yōu)勢(shì)(采用反復(fù)凍融法建議貧營(yíng)養(yǎng)水體過(guò)濾水量為500～1000ml[8])，但當(dāng)葉綠素a濃度較高時(shí)，微波法提取率顯著高于反復(fù)凍融法，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差較小，且提取時(shí)間較凍融法縮短一半以上，適用于富營(yíng)養(yǎng)化水體的應(yīng)急監(jiān)測(cè).

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Microwave-assisted method for extracting chlorophyll-a in phytoplankton and its comparison with freezing-thawing extraction method

LIN Luomin1, TANG Quehui1, PENG Liang1, WEI Guifeng1**, LIN Shuzhong2, LI Xiangjiao2& YANG Haowen2

(1: Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering Ministry of Education, Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, P.R.China) (2: Hydrological Bureau of Guangdong Province, Guangzhou 510150, P.R.China)

Inordertosavetimeofsampleprocessingandtoimprovethedeterminingaccuracy,amicrowave-assistedextractionmethodwasdesignedandoptimizedtoextractchlorophyll-ainphytoplankton,andwascomparedtothefreezing-thawingmethodforextractionefficiencyofchlorophyll-a.Theresultsshowedthatmicrowave-assistedextractionmethodwasoptimalin60streatmentwithoutputpowerof800W,andtheappropriatewatervolumeforfiltrationwasabout100-500mlforsamplescollectedinmeso-eutrophicwaterbodiesand1000mlforthosefromoligotrophicwaterbodies.Thechlorophyllextractionrateofmicrowave-assistedextractionmethodwassignificantlyhigherthanthatoffreezing-thawingmethodinmeso-eutrophicwaterbodies,whichcanincreasedby7%-12%,whilefreezing-thawingmethodwasmorestableinmeasuringchlorophyll-aofoligotrophicwaterbodies.Forthosealgaewithaglueshellorsiliceousshell,microwave-assistedextractionmethodhadahigherefficiencyforchlorophyll-aextractionandalowerrelativestandarddeviationthanthefreeze-thawmethod.Themicrowave-assistedextractionmethodneedsonlyonehalfoperationtimeofthefreezing-thawingextractionmethod,sothatitismoresuitableforemergencymonitoringofeutrophicwaterbodies,whilethefreezing-thawingextractionmethodismoresuitableformonitoringoligotrophicwaterbodies.

Microwave-assistedextractionmethod;freezing-thawingmethod;extraction;phytoplankton;chlorophyll-a

*廣東省水利科技創(chuàng)新項(xiàng)目“廣東省河流水生態(tài)健康評(píng)價(jià)指標(biāo)體系及評(píng)價(jià)方法研究”(2014-01)資助.2015-10-23收稿;2015-12-16收修改稿. 林羅敏(1990～)，女，碩士研究生；E-mail:linluomin@126.com.

**通信作者；E-mail:tweigf@jnu.edu.cn.