朱黎琴，俞明華，江宇峰，朱春蓮

利用納米金顆粒作為指示劑的胰島素水解模擬過程監(jiān)測(cè)分析

朱黎琴1，俞明華2，江宇峰3，朱春蓮3

（1.義烏市水處理有限責(zé)任公司，浙江義烏 322000；
2.嘉善綠野環(huán)保材料廠，浙江嘉興 314000；
3.浙江水知音檢測(cè)有限公司，浙江嘉善 314100）

利用7～10nm的納米金顆粒作為指示劑，利用胰蛋白酶作為水解酶，建立了體外胰島素水解模擬過程，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)胰島素體外水解模擬的檢測(cè)。利用透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察了納米金顆粒與胰島素分子的作用和胰蛋白酶水解胰島素后的形態(tài)變化，證實(shí)了體外水解的發(fā)生過程，最后使用紫外吸收法測(cè)定了胰島素體外水解的程度。

胰島素；胰蛋白酶；納米金；水解；檢測(cè)

胰島素是由胰臟內(nèi)的胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素［1-3］。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。因此，檢測(cè)和監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)胰島素的水解過程是生化分析檢測(cè)研究中的一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容［4-6］。本文提出一種新型的利用納米金顆粒作為指示劑的胰島素水解模擬過程監(jiān)測(cè)分析方法，能夠快速簡(jiǎn)便地開展胰島素體外水解模擬分析。

1　實(shí)驗(yàn)過程

1.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器

氯金酸，檸檬酸鉀，硼氫化鈉，十六烷基三甲基溴化銨，抗壞血酸溶液，PBS緩沖溶液均購于國藥試劑有限公司（上海）；胰島素（Insulin），胰蛋白酶（trypsin）購于上海生工生物。

透射電子顯微鏡（TEM）Hitachimodel H-800（工作電壓100 kV）和掃描電子顯微鏡（SEM）Quanta 400F用來表征胰島素-納米金體系形態(tài)；紫外-可見分光光度計(jì)UV-1700 PharmaSpec UV-Vis spectrophotometer（日本島津公司）用來測(cè)定溶液的紫外吸；pH510精密酸度計(jì)（美國優(yōu)特公司）用于調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值。

1.2納米金顆粒的合成

配制0.01mol/L氯金酸，0.01mol/L檸檬酸鉀，0.1mol/L硼氫化鈉，0.1mol/L十六烷基三甲基溴化銨和0.1mol/L抗壞血酸溶液。在錐形瓶中加入18.5mL去離子水，0.5mL氯金酸溶液和0.5mL檸檬酸鉀溶液，攪拌分散5min。攪拌下緩慢加入0.5mL硼氫化鈉溶液，隨著硼氫化鈉的加入溶液的顏色逐漸發(fā)生變化。反應(yīng)結(jié)束可得到平均粒徑為7～10nm的金溶膠種子溶液。

1.3胰島素水解分析監(jiān)測(cè)

胰島素溶解，選擇 0.2M NaOH和HCl分別溶解，得到1mg/ mL 的溶液。所得的胰島素溶液在4℃下可保存10h。

納米金顆粒修飾：將所制備的胰島素溶液與等體積的納米金顆粒溶液混合，充分振蕩，超聲，并靜置5h。得到待分析的insulin@Au溶液。

體外水解模擬實(shí)驗(yàn)：用0.05M 的PBS緩沖溶液配制0.1mg/ mL的胰蛋白酶溶液，分別取10μL，50μL和100μL加入到配制好的insulin@Au溶液中，室溫下進(jìn)行水解反應(yīng)24h。

電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)：將上述各種溶液離心（10 000轉(zhuǎn)，10min），分離上層清夜，并且將離心得到的沉淀再次溶解于初始體積的純水中。得到的樣品分別進(jìn)行UV，SEM 和 TEM的實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與討論

2.1胰島素-納米金及胰島素-胰蛋白酶水解體系的建立

如圖1所示，藍(lán)色線條為納米金溶液的紫外吸收?qǐng)D，從圖中可以看出實(shí)驗(yàn)合成的納米金顆粒在520nm處有明顯的吸收峰，而紅色線條為實(shí)驗(yàn)配制的胰島素溶液的紫外吸收?qǐng)D。從圖中夠可以看出胰島素溶液在300～800nm范圍內(nèi)并沒有明顯的紫外吸收，納米金的特征吸收峰和胰島素溶液的無干擾為本實(shí)驗(yàn)的順利開展奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)胰島素分子與納米金顆粒相互作用后，特征吸收峰明顯紅移，如圖1 中的綠色線條所示，但是峰強(qiáng)度保持不變。當(dāng)向溶液中加入胰蛋白酶后，峰強(qiáng)度發(fā)生明顯下降，如圖1 納米金顆粒（藍(lán)線），胰島素溶液（紅線），胰島素-納米金顆粒（綠線）和經(jīng)胰蛋白酶水解后的胰島素-納米金溶液（黑線）的紫外吸收譜圖中黑線所示，并且特征峰的最大吸收波長(zhǎng)由553nm 移至542nm處，證明了水解的發(fā)生。

圖1　納米金顆粒（藍(lán)線），胰島素溶液（紅線），胰島素-納米金顆粒（綠線）和經(jīng)胰蛋白酶水解后的胰島素-納米金溶液（黑線）的紫外吸收譜圖

3.2TEM和SEM對(duì)于胰島素-納米金及胰島素-胰蛋白酶水解體系的表征

我們采用TEM和SEM對(duì)所建立的胰島素-納米金及胰島素-胰蛋白酶水解體系進(jìn)行了表征。如圖2中的A圖所示，我

們利用化學(xué)還原法制備的納米金顆粒形態(tài)清晰，尺寸在7～10 nm之間。當(dāng)納米金顆粒與胰島素分子相互作用后形成了如圖2B所示的形貌。納米金顆粒的尺寸和聚集程度發(fā)生了明顯的變化。與納米金顆粒連接的胰島素在胰蛋白酶的作用下水解，我們發(fā)現(xiàn)由于水解的作用，導(dǎo)致均勻分布的胰島素-納米金顆粒的大部分發(fā)生了納米金顆粒的脫落，其中一些金團(tuán)聚并且沉積在水解產(chǎn)物當(dāng)中（圖2C）。SEM的表征進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的設(shè)想和實(shí)驗(yàn)的方法。當(dāng)納米金與胰島素連接之后，顆粒清晰的圓形表面狀態(tài)消失，取而代之的是由于蛋白質(zhì)吸附而形成的絮狀的無規(guī)則的連接體。當(dāng)胰蛋白酶加入發(fā)生水解反應(yīng)后，可以看出大量的水解產(chǎn)物包裹住了納米金的顆粒，我們很難觀察到純納米金顆粒時(shí)的狀態(tài)。TEM和SEM的表征實(shí)驗(yàn)成功的證實(shí)了本論文提出的基于納米金顆粒作為指示劑的胰島素體外水解分析方法的可行性。

圖2?。ˋ）納米金顆粒（粒徑7～10 nm），（B）胰島素-納米金和（C）經(jīng)胰蛋白酶水解后的胰島素-納米金顆粒的透射電子顯微鏡照片

3.3胰島素-納米金-胰蛋白酶水解體系的監(jiān)測(cè)

我們采取紫外吸收法，利用測(cè)定納米金顆粒與胰島素相互作用吸附后形成的聚集體仍然具有紫外吸收特征的原理，對(duì)利用胰蛋白酶作為水解動(dòng)力的體外胰島素水解模擬體系進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)向體系中分別加入10，50和100μL的0.1mg/mL胰蛋白酶溶液后，位于542nm處的特征峰強(qiáng)度逐漸下降，說明了水解進(jìn)行的程度越來越強(qiáng)，同時(shí)進(jìn)一步證明了本方法的可行性。

4　結(jié)束語

通過實(shí)驗(yàn)提出了基于納米金顆粒的胰島素-胰蛋白酶水解體系模擬監(jiān)測(cè)體系，利用TEM，SEM和紫外吸收分光光度法對(duì)方案進(jìn)行了證實(shí)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用納米金顆粒能夠很好的監(jiān)測(cè)體外模擬狀態(tài)下的胰島素水解程度，為胰島素的分析檢測(cè)領(lǐng)域提供了有效的研究方法和創(chuàng)新的研究思路。

［1］ J.Wang，T.Tangkuaram，S.Loyprasert，T.Vazquez-Alvarez，W.Veerasai，P.Kanatharana，P.Thavarungkul，Anal.Chim.Acta 581（2007）1.

［2］ S.A.Ross，E.A.Gulve，M.H.Wang，Chem.Rev.104（2004）1255.

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［6］ R.S.Yalow，S.A.Berson，Nature 184（1959）1648.

Monitoring and Analysis of the Simulation Process of Insulin Hydrolysis Using Gold Nanoparticles as Indicator

Zhu Li-qin，Yu Ming-hua，Jiang Yu-feng，Zhu Chun-lian

Uses gold nanoparticles 7-10nm as an indicator，as the hydrolase trypsin，established in vitro insulin hydrolysis simulation process，and realize the simulation for the detection of insulin in vitro hydrolysis.Using transmission electron microscope and scanning electron microscope to observe the morphological changes of gold nanoparticles and insulin molecules and Trypsin Hydrolysis after insulin，confirmed the in vitro hydrolysis process，and finally the use of UV absorption method for the determination of insulin in vitro hydrolysis degree.

insulin；trypsin；gold nanoparticles；hydrolysis；detection

R914

A

1003-6490（2016）06-0104-02