李曉麗　高　俊　樊　瑩　郝娟娟　高　翔　宋美卿　張晉峰△

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調(diào)經(jīng)助孕膠囊對不孕大鼠卵巢FSHR、LHR的影響*

李曉麗1高俊2樊瑩3郝娟娟4高翔1宋美卿5張晉峰5△

目的建立SD大鼠ASR模型，探討調(diào)經(jīng)助孕膠囊對排卵障礙性不孕模型大鼠性周期、卵巢組織形態(tài)、血清Inhibin-B(抑制素B)及卵巢FSHR(卵泡刺激素受體)、LHR(黃體生成素受體)的影響。方法給幼年雌性SD大鼠注射雄激素可導(dǎo)致其成年后不孕，這種雄激素致不孕的大鼠不排卵。結(jié)果調(diào)經(jīng)助孕組大鼠陰道上皮細(xì)胞有明顯的周期性變化；調(diào)經(jīng)助孕組大鼠卵巢各級卵泡總數(shù)大于模型組(P<0.05)，調(diào)經(jīng)助孕組大鼠卵巢病理性囊性卵泡個(gè)數(shù)小于模型組(P<0.05)；調(diào)經(jīng)助孕組大鼠血清抑制素B含量高于模型組(P<0.05)；調(diào)經(jīng)助孕組大鼠卵巢FSHR、LHR表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)。結(jié)論調(diào)經(jīng)助孕膠囊有使排卵障礙性不孕癥的大鼠恢復(fù)性周期趨勢的作用，增加模型大鼠血清Inhibin-B含量，提升卵巢儲備功能，增強(qiáng)模型大鼠卵巢FSHR、LHR的表達(dá)水平，促進(jìn)卵泡的發(fā)育與成熟。

調(diào)經(jīng)助孕膠囊；排卵障礙性不孕；SD大鼠；FSHR；LHR；Inhibin-B

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及造模SD大鼠40只(動物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2014-0004)。參照魏美娟、俞瑾等[1]方法，制作無排卵大鼠模型(ASR模型)。取40只第9日齡雌性SD大鼠于頸背部皮下注射丙酸睪丸酮注射液2.25mg/只(0.05ml/只)，第22日齡斷奶，利用自然光照，室溫維持在20℃左右，同樣條件飼養(yǎng)，于山西省中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)室由專人喂養(yǎng)。第70日齡大鼠體質(zhì)量約150 g左右陰道開口, 連續(xù)陰道涂片2個(gè)性周期(1個(gè)性周期5天)，陰道上皮無性周期變化、呈持續(xù)性角化，提示無排卵大鼠模型制作成功。其病理機(jī)制可能是通過外源性雄激素影響腎上腺功能，進(jìn)而干擾雌性大鼠早期分化中樞，繼之使垂體卵泡刺激素、促黃體生成素分泌不足，最終影響卵泡發(fā)育及排卵[1，2]。

1.2分組隨機(jī)將造模成功的30只大鼠分為模型組10只，調(diào)經(jīng)助孕組10只，枸櫞酸氯米芬組10只，同時(shí)設(shè)健康80日齡SD大鼠10只為正常組。

1.3給藥方法從第80天開始分別按臨床用藥以60kg的人為標(biāo)準(zhǔn), 按照體表面積劑量換算法計(jì)算大鼠給藥劑量，每日給予10ml/kg灌胃。每天灌胃1次, 均連續(xù)灌胃28天。正常組每日給予蒸餾水灌胃；模型組每日給予蒸餾水灌胃；調(diào)經(jīng)助孕組每日給予調(diào)經(jīng)助孕膠囊溶液(濃度為0.15 g/ml)灌胃；枸櫞酸氯米芬組每日給予枸櫞酸氯米芬膠囊溶液(濃度為0.415mg/ml)灌胃。

1.4實(shí)驗(yàn)用藥丙酸睪酮注射液(國藥準(zhǔn)字H31020524由上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))，調(diào)經(jīng)助孕膠囊(批準(zhǔn)文號：晉藥制字AZ20080237由山西省中醫(yī)藥研究院制劑室生產(chǎn))，枸櫞酸氯米芬膠囊(國藥準(zhǔn)字：H44021870由廣州康和藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1大鼠陰道分泌物涂片觀察連續(xù)給藥28天后，于108天開始每天作陰道涂片1次，連續(xù)10天(兩個(gè)性周期)。陰道分泌物采集：用消毒棉拭子旋轉(zhuǎn)插入動物陰道內(nèi)，然后在陰道內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動幾下后取出，將帶有陰道內(nèi)含物的棉簽在載玻片上均勻轉(zhuǎn)動做成涂片，用95%酒精固定細(xì)胞，將涂片在空氣中自然干燥。染色方法：蘇木素4min，水2s，水2s，鹽酸2s，水2s，水2s，氨水2s，伊紅2min，75%酒精，85%酒精，95%酒精，無水乙醇10min，二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，晾干。于視頻顯微鏡(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所出品)下觀察涂片。

1.5.2血清中Inhibin-B含量測定給藥28天后股動脈采血，4℃離心(3000r/min，10min)，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測方法，試劑盒購自中國伊來瑞特公司，線性范圍15.6～1000 pg/ml，顯色終止后用美國Awareness公司生產(chǎn)的Start Fax-2100型自動生化分析儀，于波長450nm處讀取吸光值，檢測及操作步驟均嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。

1.5.3顯微鏡下卵巢的觀察采血后處死大鼠，取出卵巢組織，左側(cè)卵巢放于4%多聚甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，透明、浸蠟、 包埋，石蠟切片，裱于載玻片上，于400倍光鏡下觀察,在 3個(gè)視野下，數(shù)各級卵泡和病理性囊性卵泡的個(gè)數(shù)，求平均值。

1.5.4卵巢組織中FSHR、LHR含量檢測采用Westenblot法檢測卵巢組織中FSHR、LHR的含量：將右側(cè)卵巢組織，液氮研磨成粉末，稱重，粉末放入2.5ml離心管中，加40ul裂解混合液(RIPA:PMSF=100:1)，冰浴30min；離心15min(1100rpm，4℃)；吸取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，通過計(jì)算，取各組等量蛋白質(zhì)用于 SDS- PAGE 電泳，用10%～12%的梯度預(yù)制膠分離蛋白質(zhì)，將凝膠上蛋白質(zhì)經(jīng)電轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，經(jīng)過封閉、漂洗、一抗孵育、漂洗、二抗孵育和漂洗后加入新配制的ECL顯色液顯影、曝光。用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件定量蛋白質(zhì)，所有數(shù)據(jù)均用內(nèi)參Actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠陰道上皮細(xì)胞涂片觀察調(diào)經(jīng)助孕組大鼠陰道涂片有不同程度的周期性變化，連續(xù)兩周期內(nèi)(10 d)陰道涂片可見橢圓形扁平上皮細(xì)胞，白細(xì)胞和角化細(xì)胞的3種形態(tài)，較正常組周期有所延長,而模型組大鼠陰道涂片仍呈無周期性的角化細(xì)胞，枸櫞酸氯米芬組3種細(xì)胞形態(tài)無規(guī)律。說明調(diào)經(jīng)助孕膠囊有使排卵障礙性不孕大鼠恢復(fù)性周期趨勢的作用。見表1。

表1　各組大鼠陰道細(xì)胞呈周期變化

2.2顯微鏡下卵巢的觀察結(jié)果鏡下可觀察到模型組卵巢蒼白，表面見卵泡，但卵泡多呈囊性擴(kuò)張，大量閉鎖卵泡和原始卵泡存在，無成熟卵泡，卵泡較小，無黃體，卵泡內(nèi)含大量漿液性物質(zhì)，卵泡壁顆粒細(xì)胞稀疏，層次明顯減少。正常組和調(diào)經(jīng)助孕組大鼠卵巢色澤鮮紅，卵泡各級數(shù)目明顯多于模型組，卵泡明顯增大，表面見較多黃體。卵巢HE染色后，在400倍光鏡下觀察，在3個(gè)視野下，數(shù)各級卵泡和病理性囊性卵泡個(gè)數(shù)，求平均值，結(jié)果模型組卵泡數(shù)目明顯少于正常組和調(diào)經(jīng)助孕組，有顯著差異(P<0.05)；模型組病理性囊性卵泡明顯多于調(diào)經(jīng)助孕組，有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠各級卵泡和病理性囊性卵泡個(gè)數(shù)比較　±s)

注：與模型組比較1)P<0.05

2.3各組大鼠血清中Inhibin-B含量大鼠血清中Inhibin-B含量的比較，正常組高于模型組(P<0.05)，調(diào)經(jīng)助孕組與枸櫞酸氯米芬組高于模型組(P<0.05)。現(xiàn)代研究認(rèn)為抑制素B可作為預(yù)測卵巢儲備力的直接指標(biāo)[1]，調(diào)經(jīng)助孕膠囊可以增加血清抑制素B含量。見表3。

組別樣本數(shù)INHB(pg/ml)正常組10128.45±32.281)模型組1078.73±16.29調(diào)經(jīng)助孕組10116.38±30.211)枸櫞酸氯米芬組10103.03±22.191)

注：與模型組比較1)P<0.05

2.4各組大鼠卵巢FSHR、LHR蛋白水平表達(dá)大鼠卵巢FSHR蛋白水平的比較，正常組高于模型組(P<0.05)，調(diào)經(jīng)助孕組與枸櫞酸氯米芬組高于模型組(P<0.05)。大鼠卵巢LHR蛋白水平的比較，正常組高于模型組(P<0.05)，調(diào)經(jīng)助孕組與枸櫞酸氯米芬組高于模型組(P<0.05)。見表 4、圖1。

組別樣本數(shù)FSHRLHR正常組30.323±0.0261)0.318±0.0381)模型組30.102±0.0560.131±0.044調(diào)經(jīng)助孕組30.369±0.0271)0.388±0.0201)枸櫞酸氯米芬組30.254±0.0391)0.303±0.0421)

注：與對照組比較1)P<0.05

圖1　鼠卵巢 FSHR、LHR Westernblot結(jié)果

3　討論

不孕癥是世界關(guān)注的人類自身生殖健康的問題，是女性最常見的婦科疾病之一，排卵障礙是導(dǎo)致不孕的主要原因之一，特別是在原發(fā)性不孕癥中約占25%～30%。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的臨床、基礎(chǔ)研究結(jié)果證實(shí)，卵泡發(fā)育及排卵主要是由“下丘腦-垂體-卵巢”性腺軸調(diào)控的，性腺軸的任何一個(gè)部位異常都可引起排卵障礙。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為排卵障礙性不孕癥的根本病機(jī)在于腎虛，其中又夾雜著肝郁、血虛、痰濕等多種致病原因。腎主生殖功能的實(shí)現(xiàn)與調(diào)節(jié)天癸、沖任密切相關(guān)，也就是“腎-天癸-沖任-胞宮”, 這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“下丘腦-垂體-卵巢軸”生理極為吻合?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，補(bǔ)腎藥能提高垂體對下丘腦的反應(yīng)，改善內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能；改善低雌激素環(huán)境，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟。因而中醫(yī)藥治療排卵障礙性不孕癥多從補(bǔ)腎立法。基于此，我們選用補(bǔ)腎填精、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之調(diào)經(jīng)助孕膠囊對排卵障性不孕模型大鼠進(jìn)行干預(yù)。對排卵障礙不孕患者，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多選用枸櫞酸氯米芬膠囊進(jìn)行促排卵治療，有明顯的療效，故本實(shí)驗(yàn)選擇與其進(jìn)行陽性對照。

本實(shí)驗(yàn)研究表明調(diào)經(jīng)助孕膠囊可以增加血清抑制素B含量，提升卵巢儲備功能；顯著增加模型大鼠各級卵泡總數(shù)、減少病理性卵泡個(gè)數(shù)，重建性周期變化，并且通過增強(qiáng)卵巢FSHR、LHR的表達(dá)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育、成熟，有利于優(yōu)勢卵泡的形成，從而達(dá)到排卵的目的，治療排卵障礙性不孕癥。

[1]魏美娟，俞謹(jǐn)．補(bǔ)腎中藥對雄激素致不孕大鼠腎上腺皮質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1994，14(12):736 -738.

[2]呂瑞莎，張建偉.婦科腎虛動物模型的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)研究，2013，26(1)：72-75.

[3]魏俊英,傅金英.血清抑制素B對卵巢儲備功能預(yù)測的研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，25(4):764-765.

[4]樂杰．婦產(chǎn)科學(xué)[M].8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2012:381-384.

[5]羅元凱．實(shí)用中醫(yī)婦科學(xué)[M].2版．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2010:278.

山西省自然基金項(xiàng)目(No.2013011053-8)

1.山西省中醫(yī)藥研究院碩士研究生2015級(太原 030012)；2.山西中醫(yī)學(xué)院碩士研究生2015級(太原 030012)；3.山西省中醫(yī)藥研究院碩士研究生2014級(太原 030012)；4.山西中醫(yī)學(xué)院碩士研究生2014級(太原 030012)；5.山西省中醫(yī)院婦科(太原 030012)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.18.025

1003-8914(2016)-18-2662-03

(本文校對：李新玲2016-05-10)