修妤　婁齊年　王安皆　石瑞?！∪A麗峰

【摘 要】抗菌肽是生物機(jī)體進(jìn)行自我防御的屏障，能夠抑制殺死多種細(xì)菌及寄生蟲(chóng)，但不同生物體內(nèi)的抗菌肽在結(jié)構(gòu)特征上存在較大差異，本文主要介紹了家蠶抗菌肽的特性，并重點(diǎn)介紹了新疆家蠶抗菌肽的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】新疆家蠶；抗菌肽；特征；應(yīng)用

高等生物的免疫防御體系來(lái)其自身免受細(xì)菌的侵害的重要屏障。雖然昆蟲(chóng)沒(méi)有高度特異性的免疫體系， 但可以通過(guò)產(chǎn)生具有強(qiáng)活力的抗菌肽應(yīng)對(duì)受到外界微生物刺激。抗菌肽作為低等動(dòng)物機(jī)體快速有效的免疫屏障，是自然界中普遍存在的具有免疫效應(yīng)的陽(yáng)離子活性多肽，在機(jī)體的先天非特異性免疫中起重要作用[1-3]。第一個(gè)真正意義上的抗菌是于1972年由瑞典科學(xué)家boman等從惜古比天蠶（Hyatophora-cecropia）蛹中誘導(dǎo)分離出來(lái)的。boman等并將其命名為天蠶素（Cecropin）[4]。隨后在細(xì)菌、植物、昆蟲(chóng)、魚(yú)類、兩棲類和哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了種類繁多的抗菌肽[5]。

抗菌肽并不同于代謝過(guò)程酶促反應(yīng)生成的多肽類抗生素，它是由基因編碼、蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)合成的具有抗菌活性的一類小分子多肽的總稱[6]。目前，己經(jīng)通過(guò)研究分離獲得多種抗菌肽，并測(cè)定了其基因序列和氨基酸序列。大多數(shù)抗菌肽分子有兩性的α-螺旋結(jié)構(gòu)域，并富含堿性氨基酸，表現(xiàn)出抗菌肽的主要特征[7]。

自二十世紀(jì)中葉以后，抗菌肽的研究一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。研究表明，抗菌肽具有分子量小，熱穩(wěn)性較高，抗菌譜廣，并且不具有抗原性和不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)還表現(xiàn)出廣譜的抗菌性，尤其是在目前抗生素的耐藥性日益嚴(yán)峻的情況下，抗菌肽的應(yīng)用價(jià)值倍受關(guān)注，有望成為抗生素的最佳替代者，因而吸引了醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的廣泛關(guān)注。

新疆生物資源種類繁多、品種獨(dú)特、特性優(yōu)良，開(kāi)發(fā)和發(fā)展的潛力較大。但新疆生物資源研究領(lǐng)域還有許多空白點(diǎn)，資源的利用率較低。 近幾年對(duì)新疆家蠶的研究和開(kāi)發(fā)利用已經(jīng)成為焦點(diǎn)，本文就新疆家蠶抗菌肽的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用做以下綜合闡述。

1 抗菌肽的理化性質(zhì)

抗菌肽是生物機(jī)體產(chǎn)生一種小分子多肽，天然抗菌肽含氨基酸數(shù)目不等，堿性，水溶性好。大部分抗菌肽具有熱穩(wěn)定性，在100℃時(shí)加熱10～15min仍然可以保持活性。新疆家蠶的抗菌肽在加熱煮沸8h時(shí)，仍能保持良好活性[8]。帶有一個(gè)凈正電荷，兩親性，富含賴氨酸和精氨酸等陽(yáng)離子型氨基酸 ，親水端則富含丙氨酸和甘氨酸等非極性氨基酸，并往往發(fā)生酞胺化，是新疆家蠶抗菌肽的主要特征。目前，已從單細(xì)胞生物、昆蟲(chóng)和其它無(wú)脊椎動(dòng)物、植物、兩棲類動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)類和哺乳動(dòng)物，包括人類中分離到抗菌肽。此外部分抗菌肽還具備抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力[9]。

抗菌肽具有廣譜抗菌，單一的抗菌肽即可抑制殺死多種細(xì)菌、真菌和某些寄生蟲(chóng)，并對(duì)多種癌細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)體瘤有明顯的殺傷作用。另外，在加速免疫和傷口愈合方面抗菌肽同樣有顯著作用。雖然抗菌肽的作用對(duì)象種類繁多，但其發(fā)揮作用的位點(diǎn)是相同的，即膜成分?？咕陌l(fā)揮防御作用的基礎(chǔ)在于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)是動(dòng)植物所不具備的，這方面的研究使人們對(duì)抗菌肽的認(rèn)識(shí)更深入。

2 抗菌肽的分類

目前研究抗菌肽結(jié)構(gòu)的主要方法有圓二性色譜和二維核磁共振等。按照抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征主要將其劃分為4類：即α-螺旋、β-折疊、環(huán)形、伸展性結(jié)構(gòu)[10]等。

2.1 α-螺旋型抗菌肽

α-螺旋型抗菌肽主要特征為分子內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域，通常含有小的彎曲結(jié)構(gòu)域，如cecropin，magainin。以cecropin A為例，其N端和C端均為α-螺旋，形成兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)。其中N端的1～21個(gè)氨基酸構(gòu)成一段帶正電的親水螺旋，C端發(fā)生酞氨化，第25～37個(gè)氨基酸構(gòu)成一段帶負(fù)電的疏水螺旋結(jié)構(gòu)域，兩段α螺旋由1個(gè)短鏈的AGP（丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸）連接。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的20多種cecropin抗菌肽均具有較高的相似性。

α-螺旋抗菌肽分子通過(guò)其兩性α-螺旋上的正電荷與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜磷脂分子上負(fù)電荷的靜電吸引而結(jié)合，緊接著抗菌肽分子的疏水端借助于分子中AGP連接插入到質(zhì)膜中，然后抗菌肽分子兩性α-螺旋也插入到質(zhì)膜中，通過(guò)破壞脂質(zhì)雙分子層原有的有序結(jié)構(gòu)，使抗菌肽分子通過(guò)膜內(nèi)分子間的位移相互聚集在一起，從而在膜上形成離子通道，細(xì)菌最終因不能保持正常滲透壓而死亡[11]。

2.2 β-折疊型抗菌肽

β-折疊型抗菌肽分子內(nèi)存在β-折疊和反平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)含有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的二硫鍵，有助于抗菌肽穿過(guò)細(xì)胞膜。在分離自日本鱟（Tachypleus tridentatus）血細(xì)胞的酸性抽提物TachyplesinI（TPI）中， Tachyplesins與LPS之間具有較強(qiáng)的結(jié)合力，能引起磷脂分子在細(xì)胞膜中的翻轉(zhuǎn)及側(cè)移等。說(shuō)明此類抗菌肽能破壞磷脂分子的有序排列，在不形成穩(wěn)定性孔洞或通道的前提下，使多肽分子穿過(guò)脂雙層[12]。

2.3 環(huán)狀結(jié)構(gòu)型的抗菌肽

環(huán)形肽具有高度可變性結(jié)構(gòu)，thanatin即屬此類。除了β-折疊結(jié)構(gòu)， 環(huán)形肽也能夠形成具有兩性性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，肽分子中含有的半肽氨酸，能夠形成分子內(nèi)二硫鍵。如防御素（defensins）可通過(guò)二硫鍵連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。具有兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)域的環(huán)形肽，抗菌作用機(jī)理與α-螺旋型抗菌肽基本相同，都是破壞腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，從而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。不同之處是由于防御素分子太小而不能以單聚體的形式造成膜穿孔，但其分子結(jié)構(gòu)和電生理研究提示，防御素分子能以多聚體的形式作用于細(xì)胞膜[13]。

2.4 伸展性結(jié)構(gòu)型的抗菌肽

這類抗菌肽通常缺少典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，多呈線型，富含脯氨酸、甘氨酸等小分子氨基酸，其抗菌活性結(jié)構(gòu)是通過(guò)肽與質(zhì)膜間的氫鍵或范德華力形成，但一般不依賴于殘基間的氫鍵。這一類抗菌肽這結(jié)構(gòu)組成上主要表現(xiàn)為：富含脯氨酸的抗菌肽，如Indolicidin ；富含甘氨酸的抗菌肽，如Hemiptericin和Coleopterlcin。富含脯氨酸的抗菌肽抗菌機(jī)制比較特殊，它們能夠穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，錨定于細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的靶因子，并抑制其生物學(xué)功能，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。富含甘氨酸的抗菌肽，如Attacins，其作用模式可能是干擾大腸桿菌細(xì)胞外膜蛋白基因OpmC，OpmF和OpmA的轉(zhuǎn)錄，使這些細(xì)胞外膜的結(jié)構(gòu)性蛋白表達(dá)降低，從而導(dǎo)致膜的通透性增加，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制。

3 新疆家蠶抗菌肽特性及抗菌作用的超微結(jié)構(gòu)觀察

新疆家蠶抗菌肽的殺菌活力為：1 μg/μl，抗菌肽與24 000U 的氨芐青霉素殺菌活力相當(dāng)；抗菌肽具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性；在含有氨芐青霉素的金黃色葡萄球菌的固體培養(yǎng)基上， 加入抗菌肽的孔周圍有明顯的抑菌圈，表明新疆家蠶抗菌肽可以殺滅抗氨芐青霉素的環(huán)境微生物。抗菌肽能夠耐受一定范圍酸堿的影響；高濃度鹽不影響抗菌肽抗菌活性；用瓊脂孔擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌抗菌活性發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌、化膿桿菌、巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、谷氨酸桿菌、變形桿菌等有不同程度的殺滅抑制作用， 其中抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)， 對(duì)巨大芽孢桿菌、谷氨酸桿菌、蘇云金桿菌、變形桿菌的抗菌作用次之， 對(duì)大腸桿菌和化膿桿菌的抑菌作用稍弱一些，相當(dāng)于抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用的一半。

迄今為止， 已分離獲得700 多種抗菌肽，關(guān)于抗菌肽的抗菌機(jī)理看法不一，目前抗菌肽對(duì)細(xì)胞膜磷脂分子層的滲透主要有兩種模式：“桶-板”模型（barrel-stave pore）和“毯式”模型（carpet model）， 不同類型的抗菌肽可能采用不同模式的作用機(jī)制[14]。

劉忠淵等采用透射電鏡研究了新疆家蠶抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的作用過(guò)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在利用抗菌肽處理金黃色葡萄球菌時(shí)， 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞表面部分區(qū)域變模糊、粗糙， 并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)模糊、粗糙的區(qū)域性增大， 表明抗菌肽的作用可能使金黃色葡萄球菌內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡， 且作用效果與時(shí)間呈正相關(guān)。金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的抗菌肽處理后呈中空?qǐng)A環(huán)， 但是細(xì)胞壁完整，提示抗菌肽主要是作用靶位在細(xì)胞膜上，通過(guò)溶解使內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。王云起等研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽magainin Ⅱ 以“ 毯式” 作用方式破壞大腸桿菌的外壁， 抗菌肽分子環(huán)繞著菌體切斷胞膜， 使大腸桿菌細(xì)胞從中斷裂成兩節(jié)[15] 。如果新疆家蠶抗菌肽采用的是“毯式” 的作用模型殺菌，金黃色葡萄球菌細(xì)胞應(yīng)該可以觀察到斷裂、殘缺的胞體， 而在透射電鏡下卻未觀察到此類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因而推測(cè)新疆家蠶抗菌肽很可能是通過(guò)“桶-板” 模式滲透細(xì)胞膜，首先是抗菌肽分子多聚體化，然后插入細(xì)胞膜形成孔洞， 進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)容物從孔道向胞外滲漏，通過(guò)影響細(xì)菌的新陳代謝系統(tǒng)起到抑菌殺菌作用。目前關(guān)于抗菌肽的膜定位方式有待于進(jìn)一步的研究。

4 抗菌肽表達(dá)及優(yōu)化

抗菌肽Cecropin XJ通過(guò)提取新疆家蠶總RNA 并進(jìn)行RT-PCR， 獲得抗菌肽cDNA 分子， 通過(guò)與GenBank 中已發(fā)表抗菌肽序列進(jìn)行比對(duì)分析， 確定新的抗菌肽基因。將Cecropin-XJ亞克隆至穿梭質(zhì)粒pGAPZαA 上， 通過(guò)轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)濃度（330mg∕mL）和其分子量（理論值7kD）分析發(fā)現(xiàn) ， 酵母表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的產(chǎn)物為17.5kD ，說(shuō)明該分子很可能在水溶液中以二聚體的形式存在[8]。為了提高 Cecropin XJ 融合蛋白的產(chǎn)量，康蘇等通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基的碳氮比、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白進(jìn)行優(yōu)化提高蛋白的表達(dá)量，但是該研究并沒(méi)有對(duì)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，原因在于37℃未必是蛋白表達(dá)的最適溫度卻是細(xì)菌生長(zhǎng)的最佳溫度。這些條件的確定為我們后期要進(jìn)行的重組蛋白的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

5 新疆家蠶抗菌肽的應(yīng)用

5.1 新疆家蠶抗菌肽對(duì)鮮榨果汁防腐效果的影響

新疆家蠶抗菌肽（Cecropin XJ）基因是從阿克蘇新蠶 3 號(hào)蠶體中通過(guò)克隆獲得，并已在原核和真核系統(tǒng)中成功表達(dá)。Cecropin XJ 屬于天蠶素B 類家族，具兩親性α-螺旋區(qū)域，信號(hào)肽含26個(gè)氨基酸，前體肽含37個(gè)氨基酸，具有較強(qiáng)的熱和酸穩(wěn)定性，單一使用時(shí)抗菌譜廣，在食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

不同濃度的新疆家蠶抗菌肽（Cecropin XJ）可以作為防腐劑添加到鮮榨番茄汁和葡萄汁中，并能有效抑制鮮榨果汁中病原微生物的生長(zhǎng)，對(duì)鮮榨番茄汁和葡萄汁起防腐作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 0.02%（w/v） Cecropin XJ 與相同濃度的山梨酸鉀防腐效果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，能夠顯著延長(zhǎng)鮮榨番茄汁和葡萄汁保鮮期，表明 Cecropin XJ 在食品防腐產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中具有潛在的商業(yè)價(jià)值[16，17]。

5.2 新疆家蠶抗菌肽抑制掌面革蘭氏陰性菌的研究

抗菌肽也廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，目前主要的應(yīng)用抗菌肽有細(xì)菌素 Bacteriocin AS-48、Nisn 和乳源抗菌肽等。根據(jù)對(duì)Cecropin XJ 的廣譜抑菌作用的研究，設(shè)計(jì)并對(duì)手掌表面菌的抑制消毒進(jìn)行了初步探索，結(jié)果表明 Cecropin XJ 對(duì)手掌擦拭液中的微生物有明顯抑制作用。

5.3 新疆家蠶抗菌肽在番茄汁加工中的應(yīng)用研究

抗菌肽具有強(qiáng)大的抗菌活性，但它不是細(xì)胞毒素，可以被人體內(nèi)的酶系降解、消化，且多數(shù)具有酸、熱穩(wěn)定性和低溫貯藏穩(wěn)定性，是一類潛力很大的生物防腐劑。由于抗菌肽具有眾多優(yōu)點(diǎn)，迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，對(duì)昆蟲(chóng)抗菌肽的研究具有重要理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。由于其來(lái)源安全可靠，無(wú)毒副作用并可在一定食品范圍內(nèi)起到抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，防止食品腐敗變質(zhì)，具有降低相應(yīng)食品的殺菌強(qiáng)度的作；且有實(shí)驗(yàn)表明：抗菌肽無(wú)致畸變作用，無(wú)蓄積毒性，不容易產(chǎn)生抗藥性[18]，因而尋找和開(kāi)發(fā)應(yīng)用新的抗菌肽工作越來(lái)越受到重視。鄭力等以茄汁為載體對(duì)新疆家蠶抗菌肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行研究。分析認(rèn)為：抗菌肽可用于番茄汁的UHT（一般為135～150℃、1～3min）工藝，雖無(wú)法縮短殺菌時(shí)間，但在相同殺菌時(shí)間條件下可降低殺菌溫度，在工業(yè)化生產(chǎn)中大大降低生產(chǎn)動(dòng)力成本，因而抗菌肽的工業(yè)化應(yīng)用前景廣闊。

6 抗菌肽的應(yīng)用前景

目前在防治引起高等動(dòng)物的各種細(xì)菌性、病毒性疾病及其它病害時(shí)， 由于抗生素的濫用， 使某些病原體產(chǎn)生了耐藥性， 而導(dǎo)致無(wú)法有效地防治病害的發(fā)生，并且新的抗生素的篩選也極為困難， 特別是真菌病害在當(dāng)前仍是一個(gè)難以解決的問(wèn)題?？咕脑诶ハx(chóng)中的發(fā)現(xiàn)， 尤其是抗菌肽對(duì)耐藥性致病菌的有良好殺滅作用和在致畸變作用、蓄積毒性、抗藥性產(chǎn)生等方面的明顯弱化特點(diǎn)， 無(wú)疑為治療這幾類病害提供了新的途徑?？咕幕钚詮?qiáng)， 功能廣泛， 在應(yīng)用研究中的潛在重要價(jià)值，引起了越來(lái)越多研究者的重視。在腫瘤及癌癥治療方面， 大部分化療藥物往往會(huì)同時(shí)抑殺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞， 引發(fā)較大的毒副作用，而抗菌肽能選擇性地抑制某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)， 對(duì)正常細(xì)胞無(wú)副作用， 這是腫瘤化療藥物所不具備的。因此， 抗菌肽在醫(yī)藥中有廣闊的應(yīng)用前景， 有望成為抗菌素、抗病毒素、抗癌藥物的新替代者。

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[責(zé)任編輯：朱麗娜]