楊秀梅楊雨王丹陽吳道澄張愛蓮

（1.新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046；2.西安交通大學生命科學與技術學院，西安 710000）

新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉提取物免疫活性研究

楊秀梅1楊雨1王丹陽1吳道澄2張愛蓮1

（1.新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046；2.西安交通大學生命科學與技術學院，西安 710000）

旨在比較新疆野生與栽培荒漠肉蓯蓉提取物主要活性成分差異，并檢測其誘導小鼠體內樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）成熟能力，評價其免疫活性。采用超聲法制備提取物，紫外法測定多糖及苯乙醇苷類化合物含量；腳掌免疫小鼠，流式細胞術檢測其對小鼠體內CD11c+DCs表面CD86（Cell differentiation antigens 86，CD86）和MHCII（Major histocompatibility complex II，MHCII）表達情況。結果表明，野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物中多糖含量分別為59.58%和76.82%，醇提物中苯乙醇苷類化合物含量分別為17.12%和8.47%；小鼠免疫實驗結果表明，野生和栽培荒漠肉蓯蓉提取物可顯著增強小鼠體內CD11c+DCs表面CD86和MHCII上調表達（P＜0.01），且效果與陽性對照組LPS相當，相同劑量野生與栽培醇提物除對CD86的作用差異顯著外（P＜0.05），其它提取物之間對CD86和MHCII的作用均無顯著差異（P＞0.05）。新疆野生和栽培荒漠肉蓯蓉主要成分之間存在一定差異，且在適宜濃度下均可顯著促進小鼠體內DCs成熟，且差異不大。

荒漠肉蓯蓉；多糖；苯乙醇苷類化合物；樹突狀細胞

荒漠肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）又稱肉蓯蓉，為列當科肉蓯蓉屬沙生植物，主要寄生在梭梭、紅柳等荒漠植物根部，其主要成分包括多糖、苯乙醇苷類化合物、有機酸、生物堿等［1］，其中多糖含量較高具有抗氧化、抗病毒等調節(jié)免疫系統(tǒng)多種功能；苯乙醇苷類化合物具有抗腫瘤、抗衰老等多種功能［2，3］，其含量被定為評定肉蓯蓉藥理學活性的重要指標［4］。由于肉蓯蓉極高的藥用價值［5］，野生肉蓯蓉過度開采瀕臨滅絕，鑒于此人工栽培肉蓯蓉已經(jīng)在新疆大面積成功種植［6］。雖然國內外學者對肉蓯蓉的化學成分、有效成分的分離、純化及藥理作用的研究、抗衰老活性成分、食品保健等諸多方面做了大量研究，但對肉蓯蓉提取物的免疫活性研究較少，尤其是比較野生與栽培荒漠肉蓯蓉提取物免疫活性的研究還未見報道。

樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）是目前功能最強的專職性抗原提呈細胞，在誘導免疫應答過程中起著重要作用，其成熟狀態(tài)決定機體免疫調節(jié)的方向，DCs由未成熟轉向成熟，細胞表面共刺激分子高表達［7］，同時遷移到淋巴結誘導抗原特異性T細胞增殖，激活免疫應答［8，9］，因此，對DCs的研究為天然產(chǎn)物調節(jié)免疫功能提供了新的視角。

本實驗以新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉為原材料，利用超聲結合水提醇沉法［10］，經(jīng)Sevag試劑除蛋白［11］制備水提物和超聲輔助制備醇提物，水提物中主要活性分成為多糖，蒽酮硫酸法［12］測定多糖含量；醇提物中主要的活性成分為苯乙醇苷類化合物，Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系［13］測定苯乙醇苷類化合物含量，并通過腳掌免疫BALB/c小鼠，流式細胞術檢測提取物對BALB/c小鼠體內DCs成熟的影響，初步評價新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉提取物的免疫活性，旨在為更好地開發(fā)利用新疆栽培荒漠肉蓯蓉提供參考，也為利用新疆藥用植物篩選新型疫苗佐劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 5-6周雌性BALB/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學動物中心。新疆野生和栽培荒漠肉蓯蓉（市售）。

1.1.2 試劑 石油醚、三氯甲烷、正丁醇、蒽酮、葡萄糖、松果菊苷等均為分析純，流式抗體：PECD11c、APC-CD86/FITC- MHCII購自美國BD公司，其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 721型全波長分光光度計：上海第三分析儀器廠；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；78-1磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；A L204電子天平：梅特勒一托利多儀器有限公司，精度0.1 mg；流式細胞儀：美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物的制備 水提物的制備采用超聲結合水提醇沉的方法。步驟如下：取新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉粉末，加入10倍體積的石油醚超聲輔助脫脂；加入10倍體積無水乙醇超聲輔助脫色；加入10倍體積蒸餾水37℃超聲兩次，4 000 r/min離心10 min，合并上清，真空旋蒸濃縮；加入4倍體積的無水乙醇，4℃過夜醇沉；真空抽濾烘干，得粗提物粉末；加入100倍體積蒸餾水磁力攪拌器使其充分溶解，加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）除蛋白，4 000 r/min離心10 min，重復多次，直到無乳白色變性蛋白吸出為止，收集上清，真空旋蒸濃縮，以同樣的方法醇沉，即得新疆野生及栽培疆荒漠肉蓯蓉水提物。

1.2.2 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物的制備 醇提物的制備選擇超聲醇提法制備。步驟如下：新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉粉末，以相同條件用石油醚脫脂后烘干，加入80%乙醇（料液比為1∶10），真空旋蒸，65℃烘干得到醇提物，助溶劑（Tween-20∶0.9% NaCl=1∶9）（V/V）溶解醇提物。1.2.3 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物多糖含量測定 采用蒽酮-硫酸法檢測水提物中多糖含量。步驟如下：以葡萄糖為標準品繪制標準曲線，精密稱取葡糖糖用蒸餾水溶解，濃度調整為0.5 mg/mL，分別加入上述溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL，再加入8 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，沸水浴10 min，檢測OD625nm值，得回歸方程：A=0.8022C+0.0632，r=0.9954。樣品以相同方式處理，根據(jù)標準曲線方程計算多糖含量及得率：

其中，M1代表樣品經(jīng)過脫脂、脫色、水提濃縮、醇沉后的質量（g），M0代表提取前樣品的質量（g），C代表樣品中多糖含量（mg/mL），N代表樣品稀釋倍數(shù)，V代表樣品體積（mL），M代表含量測定時樣品的質量（g）。

1.2.4 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物中苯乙醇苷類化合物含量測定 采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯示體系檢測醇提物中苯乙醇苷類化合物含量。步驟如下：以松果菊苷為標準品繪制標準曲線，甲醇溶液溶解松果菊苷，將濃度調整為0.43 mg/mL，等比列稀釋標準品，分別加入上述溶液0、20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 μL，加入100 μL 5%硝酸鈉溶液，室溫靜置6 min，加入10%硝酸鋁靜置6 min，加入10%氫氧化鈉靜置18 min，檢測OD510nm值，得回歸方程：A=0.0759C+0.0436，r= 0.9968。以同樣的方式處理樣品，根據(jù)標準曲線方程計算苯乙醇苷類化合物含量及得率：

其中，M1代表經(jīng)過脫脂、醇提濃縮后的質量（g），M0代表提取前樣品的質量（g），C代表待測樣中苯乙醇苷類化合物含量（mg/mL），N代表樣品的稀釋倍數(shù)，M代表含量測定樣品的質量（g）。

1.2.5 動物分組及免疫 野生荒漠肉蓯蓉水提物（Aqueous extracts of wild C. deserticola，AEWCD）、栽培荒漠肉蓯蓉水提物（Aqueous extracts of cultivated C. deserticola，AECCD）、野生醇提物（Ethanol extract of wild C. deserticola，EEWCD）、栽培醇提物（Ethanol extract of cultivated C.deserticola，EECCD）分別選用50 μg和200 μg兩個劑量免疫小鼠。隨機將BALB/c小鼠分成11組：陰性對照組（0.9% NaCl、Tween-20）、陽性對照組（LPS 100 ng）、AEWCD 50 μg、AEWCD 200 μg、AECCD 50 μg、AECCD 200 μg、EEWCD 50 μg、EEWCD 200 μg、EECCD 50 μg和EECCD 200 μg實驗組，每組6只，腳掌免疫小鼠，每只50 μL。

1.2.6 流式細胞術檢測新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物及醇提物對小鼠DCs的影響 腳掌免疫小鼠36 h后，取腿窩及腹股溝淋巴結制備單細胞懸液，將細胞數(shù)調整為1×106cells，進行CD11c+DCs表面CD86/MHCII染色，室溫避光20 min，用10 mL含0.5%胎牛血清的磷酸緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）1 200 r/min 7 min洗一次，加入300 μL PBS，過200目銅網(wǎng)，流式細胞術檢測CD11c+DCs表面CD86/MHCII表達情況。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 采用FlowJo 7.6 軟件處理流式細胞術檢測結果，GraphPad Prism 5.0進行分析，計量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差，數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多組均數(shù)間比較，差異顯著標準為P＜0.05。

2 結果

2.1 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物中多糖含量

葡萄糖標準曲線回歸方程為A=0.8022C+0.0632，r=0.995 4，表明葡萄糖含量在0.05-0.5 mg/mL范圍內線性關系良好。根據(jù)回歸方程計算野生及栽培荒漠肉蓯蓉中多糖含量及得率。結果（表1）顯示，野生荒漠肉蓯蓉水提物中多糖含量為59.58%，栽培荒漠肉蓯蓉水提物中多糖含量為76.82%，兩者間差異顯著（P＜0.05）。

表1 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物中多糖含量測定

2.2 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物中苯乙醇苷類化合物含量

松果菊苷標準曲線回歸方程為A=0.0759C+ 0.0436，r=0.9968，說明松果菊苷在0.043-0.43mg/mL范圍內線性關系良好。根據(jù)回歸方程計算得出野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物中苯乙醇苷類化合物含量及得率。結果（表2）顯示，野生荒漠肉蓯蓉醇提物中的苯乙醇苷類化合物含量為17.12%，栽培荒漠肉蓯蓉醇提物中的苯乙醇苷類化合物含量為8.47%，兩者之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物苯乙醇苷含量檢測

2.3 流式細胞術檢測新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物對小鼠DCs表面分子表達的影響

野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物不同劑量，腳掌免疫小鼠36 h后取腿窩及腹股溝淋巴結，流式細胞術檢測結果（圖1）表明，隨著水提物濃度越高，促進CD11c+DCs表面MHCII及CD86的表達能力越強；低劑量和高劑量組與對照相比差異極顯著（P＜0.01），高劑量組優(yōu)于陽性對照LPS組，且差異顯著（P＜0.05）；野生及栽培水提物相同劑量之間沒有顯著差異（P＞0.05）；說明野生及栽培荒漠肉蓯蓉水提物能顯著促進DCs成熟。

2.4 流式細胞術檢測EEWCD/EECCD對BALB/c小鼠體內DCs表面分子表達的影響

野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物不同劑量，腳掌免疫小鼠36 h后取腿窩及腹股溝淋巴結，流式細胞術檢測結果（圖2）表明，低劑量組與對照相比無顯著差異（P＞0.05），高劑量組可顯著促進CD11c+DCs表面MHCII的表達（P＜0.01），與陽性對照LPS組效果相當（P＞0.05），且野生和栽培醇提物之間無顯著差異（P＞0.05）；低劑量和高劑量組與對照相比都顯著促進CD86分子的表達（P＜0.01），野生及栽培醇提物高劑量組間差異顯著（P＜0.05）。說明野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物顯著促進DCs成熟。

3 討論

中草藥有效成分對機體存在著普遍的免疫調節(jié)作用，如人參、肉蓯蓉、枸杞、黃芪等都可以綜合性地提高機體免疫力，研究者發(fā)現(xiàn)中藥中的多糖、黃酮、皂苷、凝集素等成分對機體具有一定的免疫增強作用，而對正常細胞沒有毒副作用，因此，從中草藥中尋找有免疫活性成分成為研究的熱點。大量研究表明：中草藥提取物能促進DCs成熟［14，15］、增強巨噬細胞的吞噬作用［16，17］、促進淋巴細胞增殖［18］、細胞因子的分泌［19］、具有抗腫瘤［20，21］、抗病毒［22］、抗炎［23］等功能，從而起到調節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。肉蓯蓉是我國名貴中草藥，其多糖和苯乙醇苷類化合物具有調節(jié)免疫、抗病毒、抗衰老等作用而引起關注。

由于DCs在誘導免疫應答過程中的重要作用，本研究利用DCs作為肉蓯蓉提取物免疫活性的檢測平臺，比較新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉的免疫活性，檢測水提物及醇提物對BALB/c小鼠淋巴系DCs的影響。結果表明，水提物及醇提物均可顯著促進DCs成熟。這與之前Li［24］和Kim［25］的關于植物多糖能顯著促進DCs成熟的報道基本一致；李暖等［26］關于苯乙醇苷類化合物中的松果菊苷能顯著增強DCs成熟的結論一致；相同劑量野生與栽培荒漠肉蓯蓉提取物促進DCs成熟差異不大，雖然野生與栽培肉蓯蓉提取物中多糖含量與苯乙醇苷類化合物含量存在一定的差異：即200 μg野生與栽培水提物中多糖約為119 μg（200×59.58%）和153 μg（200×76.82%），栽培肉蓯蓉中多糖含量較高，但不影響其對DCs的作用，153 μg栽培多糖與119 μg野生多糖效果作用DCs效果相當；200 μg野生及栽培醇提物中苯乙醇苷類化合物約為34.24 μg（200×17.12%）和16.94 μg（200×8.47%），野生肉蓯蓉中苯乙醇苷類化合物含量較高，但對DCs作用只有CD86的表達存在一定差異，MHCII的表達無顯著差異，說明野生與栽培醇提物相比激活T細胞的能力較強，遞呈抗原的能力相當。綜上所述野生與栽培肉蓯蓉對DCs作用相當，在后續(xù)研究中可用栽培替代野生荒漠肉蓯蓉，進一步驗證新疆栽培荒漠肉蓯蓉在免疫學方面的運用前景，為從新疆藥用植物資源中篩選新的免疫活性物質奠定基礎。

4 結論

通過超聲結合水提醇沉法制備水提物，野生及栽培新疆荒漠肉蓯蓉多糖含量分別為59.58%和76.82%；利用超聲醇提得新疆野生及栽培荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷類化合物含量分別為17.12%和8.47%。結果表明，新疆野生和栽培荒漠肉蓯蓉主要成分之間存在一定差異。免疫小鼠后，流式細胞術檢測結果表明，野生和栽培荒漠肉蓯蓉提取物可顯著增強小鼠體內CD11c+DCs表面CD86和MHCII上調表達，且效果與陽性對照組LPS相當，相同劑量的水提物之間差異不顯著。同一劑量野生及栽培荒漠肉蓯蓉醇提物上調CD11c+DCs表面MHCII之間差異不顯著，但CD86的表達存在一定差異。說明新疆野生荒漠肉蓯蓉提取物在適宜劑量范圍與栽培提取物的一定劑量范圍對BALB/c小鼠體內DCs作用效果相當。

圖1 AEWCD/AECCD促進小鼠體內DCs成熟

圖2 EEWCD/EECCD促進體內DCs成熟

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（責任編輯馬鑫）

The Study of Immune Activities of Extracts from Wild and Cultivated Cistanche deserticola in Xinjiang

YANG Xiu-mei1YANG Yu1WANG Dan-yang1WU Dao-cheng2ZHANG Ai-lian1
（1. Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urmqi 830046；2. College of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710000）

This work is to compare the differences of major active components in the extracts between wild and cultivated Cistanche deserticola in Xinjiang， detect their capacities to induce the maturation of dendritic cells（DCs）in mice， and evaluate their immune activities. The extracts were prepared by ultrasonic extraction， and the contents of polysaccharides and phenylethanoid glycosides were measured by ultraviolet-visible spectrophotometer method. The immune to BALB/c mice with extracts was through foot pad， and the expressions of CD86（cell differentiation antigens 86）and MHCII（major histocompatibility complex II）on the surface of CD11c+DCs inside mouse were detected by flow cytometry. The polysaccharides contents in the aqueous extracts from wild and cultivated C. deserticola were 59.58% and 76.82% respectively，and the contents of phenylethanoid glycosides in the alcohol extracts were 17.12% and 8.48% respectively. The immune tests of mice showed that the extracts from both wild and cultivated C. deserticola enhanced the expression level of CD86 and MHCII on the surface of CD11c+DCs inside mice（P＜0.01）；and the effect was similar to that of the positive control group（LPS）. The effect of the same dosage of wild and cultivated ethanol extracts on the CD86 was significantly different（P＜0.05）. The effect of the other extracts on MHCII and CD86 was not significantly different（P＞0.05）. In conclusion， there were differences in the main components between Xinjiang wild and cultivated C. deserticola， and in appropriate concentration they both could significantly promoted DCs maturation in mice， and the difference was not significant.

Cistanche deserticola；polysaccharides；phenylethanoid glycosides；dendritic cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.022

2015-08-18

新疆維吾爾自治區(qū)科技援疆項目（201591150）

楊秀梅，女，碩士研究生，研究方向：新型疫苗佐劑的研究；E-mail：444375019@qq.com

張愛蓮，女，副教授，研究方向：新型疫苗佐劑的研究；E-mail：zal@xju.edu.cn