趙玲云范東穎李燕芳顏霞黃麗麗

（1. 西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學植物保護學院，楊凌 712100；3. 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，楊凌 712100）

枝干樹皮宏基因組DNA的提取

趙玲云1，3范東穎1，3李燕芳1，3顏霞1，3黃麗麗2，3

（1. 西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學植物保護學院，楊凌 712100；3. 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，楊凌 712100）

旨在得到一種適用于提取多種枝干樹皮的高質量DNA的方法。參考前人提取植物DNA的經(jīng)驗，綜合了研磨時加PVP、緩沖液洗滌、SDS與CTAB結合使用、高濃度KAc低溫凍融、高濃度NaCl條件下異丙醇沉淀、DNA完全溶解后加微量RNase A處理等操作，所得5種基因組DNA濃度介于190-970 ng/μL，純度都很高，皆能被限制性內切酶切割，都可用作模板擴增到細菌16S rRNA基因片段，以蘋果樹皮DNA為模板擴增到蘋果BIP和PDI基因且蘋果樹皮基因組DNA經(jīng)測序公司檢測，質量滿足高通量測序法研究微生物多樣性對環(huán)境宏基因組的要求。

枝干樹皮；DNA提??；KAc；RNase A；高通量測序

蘋果樹腐爛病、梨枝枯病、楊樹潰瘍病等枝干皮層病害嚴重影響樹木的生長，甚至導致植株的死亡。目前對此類病害的防治以施用化學藥劑為主，但該方法易引發(fā)農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病原物產(chǎn)生抗藥性等問題。20世紀80年代，微生態(tài)防治在植物病害防治中興起［1］。植物微生態(tài)學是研究植物內微生物的組成、功能、演替、微生物互作及其與寄主間相互關系的生命分支。以往人們采用純培養(yǎng)技術研究微生物的種群結構，但環(huán)境中大多數(shù)微生物處于存活但不能培養(yǎng)的狀態(tài)［2］。Illumina公司的MiSeq、Roche公司的454等第二代測序技術直接提取微生物環(huán)境宏基因組DNA，擴增微生物保守區(qū)域內的序列可變區(qū)進行高通量測序、比對、分析，為研究環(huán)境微生物組成提供了新的手段［3］。例如Sun等［4］利用16S rDNA V1-V3區(qū)高通量測序技術研究施用生防菌Phlebiopsis gigantea后挪威云杉樹樁內細菌群落的變化。若要使用高通量測序技術研究樹皮內微生物組成，進而借助微生態(tài)理論防治枝干皮層病害，提取高質量的樹皮宏基因組DNA是首要任務。另外，以植物樹皮為材料提取遺傳物質，可以降低空間和季節(jié)等因素對取樣的限制，為植物分子生物學研究提供便利條件。

目前人們已成功地從植物葉片、果實等材料中提取出DNA［5，6］。植物DNA的提取方法有很多，傳統(tǒng)的方法有CTAB法和SDS法，國內外生物公司還開發(fā)了多種商品化的植物DNA提取試劑盒，但由于不同植物中次生代謝產(chǎn)物的種類和含量差異很大，有時同種植物不同器官或組織的次生代謝產(chǎn)物的種類和含量也不一樣，使得針對某種材料優(yōu)化的DNA提取方法不一定適用于其它材料［7］。枝干樹皮組織厚且硬，富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質，用簡易CTAB法分離出的DNA因多酚氧化而呈褐色，多糖、單寧等物質與DNA結合成黏稠的膠狀物，用改良的CTAB法［8，9］、常用的SDSCTAB結合法［10-12］以及天根植物DNA提取試劑盒也不能避免多糖與核酸共沉淀，提取的基因組DNA純度低，不能進行穩(wěn)定的PCR擴增和限制性酶切反應。因此本研究繼續(xù)嘗試整合多步除雜步驟，旨在得到一種適合提取多種枝干樹皮高質量DNA的方法，為應用高通量測序技術研究樹皮內微生物組成和其他植物分子生物學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品：蘋果樹皮、楊樹樹皮、梨樹樹皮、柳樹樹皮和棗樹樹皮采自西北農(nóng)林科技大學經(jīng)濟樹木園和周邊村落。樣品采集后4 h內經(jīng)液氮冷凍后貯存于-80℃冰箱。

儀器：Thermo 702超低溫冰箱，海門其林貝爾QL-901漩渦混合器，精宏XMTE 8112水浴鍋，Eppendorf 5810R高速冷凍離心機，Thermo NanoDrop 2000分光光度計，Bio-Rad S1000TMThermalcycler PCR儀，JUNYI JY600c電泳儀，Gene Genius Bioimaging System凝膠成像系統(tǒng)。

試劑：PCR buffer、MgCl2和dNTPs等PCR反應試劑購自TaKaRa，Taq DNA聚合酶、限制性內切酶Hind Ⅲ、限制性內切酶EcoRⅠ等購自Thermo scientific，2×Es Taq MasterMix、RNase A購自康為世紀，16S引物由北京華大基因合成，引物MdPDIF、MdPDIR、MdBipF、MdBipR由Invitrogen公司合成，DNA Marker購自Vazyme，其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

緩沖液BufferⅠ：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L EDTA（pH8.0），250 mmol/L NaCl，0.5% β-巰基乙醇。

2% SDS緩沖液：2% SDS，2% PVP，1 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L EDTA（pH8.0）。

2% CTAB緩沖液：2% CTA，2% PVP，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 mmol/L EDTA（pH8.0）。

1.2 方法

1.2.1 樹皮宏基因組DNA的提取 實驗首先以蘋果樹皮為材料，主要參考文獻［7-12］探索適合蘋果枝干樹皮DNA的提取方法，之后用得到的方法提取楊樹、梨樹、柳樹、棗樹樹皮宏基因組DNA，觀察該法通用性。具體步驟為：（1）取約1 g于-80℃保存的蘋果樹皮和0.1 g PVP放入預冷的研缽中，加液氮用研杵碾壓樣品，待剩余少量液氮時快速用力研磨，重復研磨3-4次，將適量徹底研碎的細粉迅速轉移至2 mL離心管（管中體積約1 mL），加入1.5mL BufferⅠ渦旋混勻后冰浴10 min，期間不時搖勻。（2）4℃，5 000×g離心10 min，棄上清，沉淀中加入700 μL 65℃預熱的2% SDS緩沖液和100 μL β-巰基乙醇混勻，65℃水浴1 h。（3）加入300 μL 5 mol/L KAC（pH6.0），混勻后-20℃放置1 h。（4）4℃，12 000×g離心10 min，取上清，加入1/5體積65℃預熱的2% CTAB緩沖液，混勻，65℃水浴40 min。（5）冷卻至室溫，加入1/2體積酚∶氯仿∶異戊醇抽提2次，每次5 min。（6）4℃，12 000×g離心10 min，取上清，加入1/2體積5 mol/L NaCl 和等體積異丙醇，混勻后-20℃放置4 h。（7）4℃，12 000×g離心10 min，棄上清，70%乙醇洗滌沉淀兩次，每次10 min，過夜風干沉淀，加100 μL滅菌水，37℃水浴2 h溶解DNA后加入0.5 μL RNase A（10 mg/mL），37℃過夜，最后置4℃冰箱備用，若長期保存應放于-80℃。

1.2.2 DNA質量檢測

1.2.2.1 DNA產(chǎn)量和質量分析 分別取1 μL蘋果樹、楊樹、梨樹、柳樹和棗樹樹皮DNA，用Thermo NanoDrop 2000分光光度計測定各樣本DNA的濃度及A260/A280和A260/A230值。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測各樣本DNA質量 取8 μL DNA樣品與1 μL 10×loading buffer混合，90 V電壓下1%瓊脂糖凝膠中電泳50 min，溴化乙錠染色，Gene Genius Bio-imaging System凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.2.3 DNA限制性內切酶酶切 選擇限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ分別酶切5種樹皮DNA。采用10 μL反應體系，其中DNA樣品2.5 μL，限制性內切酶1 μL，10×buffer 1 μL，滅菌水5.5 μL。37℃放置2 h，90 V電壓下1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測酶切情況。

1.2.2.4 PCR擴增樹皮內細菌16S rRNA基因序列 分別以5種樹皮DNA為模板，用16S通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'擴增蘋果樹、楊樹、梨樹、柳樹、棗樹樹皮環(huán)境中細菌的16S rRNA基因。擴增體系為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，2.5mmol/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，滅菌水18.4 μL，模板DNA 0.5 μL。所用PCR擴增程序為：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，34個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 10×loading buffer混合，90V電壓下1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增情況。

1.2.2.5 PCR擴增蘋果基因 以蘋果樹皮DNA為模板，用兩對引物MdBipF：5'-ACACCATGGCTGGCTCTTG-3'；MdBipR：5'-TTAAAGCTCGTCATGCGACTC-3'和MdPDIF：5'-TATGGCGTCGTCTTCTAGGGT -3'；MdPDIR：5'-CGTTAGAGGCTCCATCCTTTCCG-3'分別擴增蘋果Bip和PDI基因，擴增體系為25 μL，其中2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，滅菌水12 μL，模板DNA 0.5 μL。所用擴增程序同1.2.2.4，取5 μL PCR產(chǎn)物，90 V電壓下1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增情況。

1.2.2.6 測序公司檢驗蘋果樹皮宏基因組DNA質量將6份蘋果樹皮宏基因組DNA送北京諾禾致源公司，經(jīng)電泳檢測合格后，以該DNA為模板擴增樹皮環(huán)境中細菌16S高變區(qū)，判斷 DNA質量是否滿足后續(xù)建庫測序需求。

2 結果

2.1 DNA濃度及純度測定

用分光光度計測定DNA的濃度和純度，高純度DNA的A260/A280比值應在1.8-2.0之間，A260/A230的數(shù)值處于2.0左右時，表明小分子鹽離子、色素、多糖或醇等雜質含量較少。表1顯示，5種植物樹皮的宏基因組DNA產(chǎn)量滿足常規(guī)實驗需求，且純度很高。

表1 五種樹皮DNA的濃度及純度值

2.2 DNA電泳檢測

瓊脂糖凝膠電泳（圖1）顯示，5種樹皮DNA各顯示出一條高分子量條帶，點樣孔較干凈，均無明顯的拖尾現(xiàn)象，說明5種DNA都相對完整，多糖等雜質去除干凈，DNA穩(wěn)定無降解。

2.3 限制性內切酶酶切結果

圖2顯示，5種DNA都能被HindⅢ和EcoRⅠ識別并在2 h內切割完全。說明所提DNA純度高，抑制內切酶活性的多糖等雜質含量很少。

圖1 五種樹皮基因組DNA電泳圖

圖2 五種樹皮基因組DNA限制性內切酶酶切圖譜

2.4 樹皮內細菌16S rRNA基因和蘋果基因PCR擴增產(chǎn)物檢測結果

以5種樹皮DNA為模板，用16S引物擴增細菌16S rRNA基因PCR產(chǎn)物電泳及以蘋果樹皮DNA為模板擴增Bip和PDI基因，結果（圖3）顯示，所有擴增產(chǎn)物主條帶明亮清晰，16S rRNA基因大小為1 500 bp左右，Bip和PDI基因3 000 bp以上，符合相應片段特征。此項結果進一步證明該方法提取到高質量的樹皮宏基因組DNA。

圖3 五種樹皮內細菌16S rRNA基因（A）及蘋果Bip和PDI基因擴增產(chǎn)物（B）電泳圖

2.5 測序公司檢驗蘋果樹皮DNA質量

經(jīng)檢測，本研究方法提取到的蘋果樹皮宏基因組DNA電泳條帶整齊明亮，送樣過程中略有降解，以此DNA為模板擴增到的16S rRNA基因V4+V5高變區(qū)序列為A級，即PCR產(chǎn)物目的條帶單一（圖4），大小正確，總量滿足兩次或者兩次以上建庫需要。綜合各項指標確定該宏基因組DNA質量合格，可不經(jīng)PCR擴增而直接用于后續(xù)建庫測序。

圖4 蘋果樹皮內細菌16S rRNA基因V4+V5區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

提取高質量的枝干樹皮宏基因組DNA是應用高通量測序技術研究樹皮內微生物組成，進而借助微生態(tài)理論防治枝干皮層病害的前提，以樹皮為材料提取遺傳物質還可以使取樣免受空間和季節(jié)等因素的限制，為限制性酶切、PCR擴增等植物分子生物學研究提供便利。從當前發(fā)表的植物DNA 提取文獻看，各種方法的建立大多基于CTAB和SDS兩種提取技術之上，但由于提取對象、緩沖液成分及提取步驟的差異，使得 DNA 提取效果不盡相同［13］。頑拗型枝干樹皮材料厚且硬，富含干擾DNA提取的次級代謝產(chǎn)物，需要更完善的提取操作才能得到質量合格的DNA。

研磨好的材料中加入洗滌液BufferⅠ，洗去了大量色素等雜質，減輕后續(xù)除雜過程的負擔。為了去除植物中的酚類物質，防止其氧化變褐后與核酸不可逆結合，普遍是在研磨時或提取液中加入適量的高分子螯合劑PVP和抗氧化劑β-巰基乙醇，也可以用TCEP、抗壞血酸、硼砂等試劑抑制氧化反應，避免DNA褐化［14］。適當?shù)靥岣擀?巰基乙醇的量還能有效去除多糖等次生物質［15］。SDS在高溫（55-65℃）條件下能裂解細胞，同時與蛋白質和多糖結合成復合物，釋放出核酸，之后加入高濃度KAc或NH4Ac低溫放置，使形成的復合物轉變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式，沉淀更加完全，離心后除去［16］。CTAB能與核酸形成復合物，此復合物在高鹽（＞0.7 mol/L）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，經(jīng)過酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提去除蛋白質、多糖、色素等雜質，最后用異丙醇或乙醇將DNA沉淀出來，離心棄上清后，CTAB-核酸復合物再用70%酒精浸泡可洗脫掉CTAB［17，18］。

植物組織往往富含多糖，多糖污染是提取植物DNA時遇到的最棘手的問題。多糖的許多理化性質與DNA很相似，所以很難將它們分開。Dellaporta等［19］認為加入高濃度的KAc有利于除去多糖；Fang等［20，21］認為在1.0-2.5 mol/L NaCl的高鹽TE中，用無水乙醇沉淀DNA能除去多糖。

以往在提取植物DNA時，大多選用植物葉片等材料，選取以上操作的幾個方面即可滿足植物分子生物學的要求［5，7，9，18，21］。本研究的目的是得到適用于高通量測序的枝干樹皮宏基因組DNA，對DNA質量要求較高，又因枝干樹皮屬頑拗型植物材料，實驗綜合多步抑制多酚氧化、除蛋白、除多糖等處理，才得到質量合格的基因組DNA且該DNA適用于普通植物分子生物學研究。研究中發(fā)現(xiàn)，略去DNA提取過程中洗滌、加KAc -20℃放置、加CTAB 65℃水浴、沉淀時加NaCl、DNA完全溶解后加RNase A中的任何一步操作，都會影響DNA的質量和穩(wěn)定性，其中KAc和RNase A處理是至關重要的兩個步驟，分別對所提DNA的純度和穩(wěn)定性起著決定性的作用。使用本實驗方法提取5種樹皮DNA，產(chǎn)量差異較大，可能與植物本身特性有關。

4 結論

本研究得到一種適合多種枝干樹皮基因組DNA的提取方法，該法操作簡單，所用試劑廉價易得，儀器常見，所得5種樹皮DNA完整性好，純度高，蘋果樹皮DNA滿足高通量測序法研究微生物多樣性對環(huán)境宏基因組DNA的要求。經(jīng)PCR擴增蘋果基因和5種樹皮內細菌16S rRNA基因及酶切實驗驗證，此方法得到的DNA也適用于植物分子生物學研究。

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（責任編輯馬鑫）

The Extraction of Metagenom DNA in Branch Bark

ZHAO Ling-yun1，3FAN Dong-ying1，3LI Yan-fang1，3YAN Xia1，3HUANG Li-li2，3
（1. College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling 712100；2. College of Plant Protection，Northwest A&F University，Yangling 712100；3. State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas，Yangling 712100）

A suitable method capable of extracting high-quality metagenom DNA from a variety of branch barks was developed based on previous experiences of plant DNA extraction. The method consisted of several steps：adding PVP while grinding materials， washing bark powder with bufferⅠ， simultaneously using SDS and CTAB， low-temperature frozen and then melting samples after adding high concentration of potassium acetate（KAc）， precipitating DNA using isopropanol under high concentration of NaCl， and adding trace RNase A after DNA completely dissolved. Finally， the concentrations of genomic DNA obtained by this method ranged from 190 to 970 ng/μL with all in high purity. All DNA can be digested by restriction endonuclease and used as templates for bacterial 16S rRNA gene amplification. The DNA of apple bark as the template was amplified into gene BIP and PDI， then the genome DNA of apple bark was detected by a sequencing firm， and the quality satisfied the requirements of environmental metagenome for studying microbial diversity by high-throughput sequencing.

branch bark；DNA extraction；KAc；RNase A；high-throughput sequencing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.018

2015-03-24

國家自然科學基金項目（31101476，31171796），陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目（2013K01-45），楊凌示范區(qū)科技計劃項目（2014NY-41），果樹腐爛病防控技術研究與示范項目（201203034）

趙玲云，女，碩士研究生，研究方向：微生物資源與利用；E-mail：hebeizhaolingyun@163.com

顏霞，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源與利用；E-mail：yanxia@nwsuaf.edu.cn黃麗麗，女，教授，研究方向：果樹病害綜合治理；E-mail：huanglili@nwsuaf.edu.cn