謝閨娥， 杜晶春， 董桂蘭， 徐　霞**

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 金域檢驗(yàn)學(xué)院， 廣東 廣州　510182； 2.廣州大學(xué) 門診部， 廣東 廣州　510006)

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扁蒴藤素對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.012.html

謝閨娥1， 杜晶春1， 董桂蘭2， 徐霞1**

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 金域檢驗(yàn)學(xué)院， 廣東 廣州510182； 2.廣州大學(xué) 門診部， 廣東 廣州510006)

目的： 研究扁蒴藤素對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/TAX生長(zhǎng)的作用。方法： 以乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為對(duì)照，同時(shí)制作紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/TAX；在兩組細(xì)胞中分別給與7種濃度(0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)扁蒴藤素或紫杉醇培養(yǎng)48 h，用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)MCF-7和MCF-7/TAX細(xì)胞作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)值，并計(jì)算MCF-7/TAX細(xì)胞對(duì)紫杉醇或扁蒴藤素的耐藥指數(shù)(RI)；同時(shí)用Annexin V-FITC/PI染色觀察扁蒴藤素作用后MCF-7/TAX凋亡細(xì)胞比例。結(jié)果： MCF-7/TAX對(duì)紫杉醇RI達(dá)19.39，而扁蒴藤素對(duì)MCF-7/TAX細(xì)胞的生長(zhǎng)有高效抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，對(duì)其作用48 h的IC50為0.52 μmol/L，MCF-7/TAX對(duì)扁蒴藤素的RI僅為0.88；扁蒴藤素作用后，Annexin V染色陽(yáng)性的MCF-7/TAX細(xì)胞比例較對(duì)照明顯升高。結(jié)論： 扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，激活MCF-7/TAX細(xì)胞凋亡，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)揮高效抑制作用。

紫杉醇耐藥； 扁蒴藤素； MCF-7/TAX； 凋亡

南蛇藤衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，在我國(guó)廣泛分布?，F(xiàn)已從南蛇藤中提取出大量萜類、生物堿、黃酮類化合物，三萜類化合物主要存在于南蛇藤的根皮中，研究表明，其中的扁蒴藤素(Pristimerin)具有廣譜抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[1-7]。紫杉醇廣泛應(yīng)用于包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的治療，然而腫瘤對(duì)紫杉醇的耐藥性嚴(yán)重影響了治療效果[8-9]。本文以紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/TAX為模型，研究扁蒴藤素對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/TAX生長(zhǎng)的作用，為探索抵抗紫杉醇耐藥性的腫瘤高效化療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1主要材料與試劑

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(american type culture collection, ATCC)，MCF-7紫杉醇耐藥細(xì)胞株(MCF-7/taxol-resistant, MCF-7/TAX)購(gòu)自廣州吉尼歐生物科技有限公司，扁蒴藤素、紫杉醇、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、碘化丙啶 (propidium iodide, PI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素混合溶液及Hepes為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，MTT購(gòu)自美國(guó)Genview公司，細(xì)胞培養(yǎng)板為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 000 IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/TAX培養(yǎng)于含1.0 μmol/L紫杉醇的上述培養(yǎng)基中以維持其耐藥表型；傳代時(shí)用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。

1.2.2MTT比色法取傳代培養(yǎng)24 h后增長(zhǎng)迅速、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/L；每孔種200 μL細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)；24 h后，取出培養(yǎng)板，吸去舊培養(yǎng)液，加入不同濃度的扁蒴藤素(設(shè)7個(gè)濃度：0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)或不同濃度的紫杉醇(設(shè)7個(gè)濃度：0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)平行孔，置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)；48 h后取出96孔板，在超凈工作臺(tái)內(nèi)每孔加MTT(5 g/L)20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出培養(yǎng)板，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)MTT與線粒體酶反應(yīng)后生成的藍(lán)紫色結(jié)晶物；用注射器小心吸棄培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(OD)值，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率：抑制率%=[(1-OD加藥組)/OD對(duì)照組]×100%，并參照文獻(xiàn)[9]用Bliss’s軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值。耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/TAX接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜；加入終濃度為1.0 μmol/L的扁蒴藤素，8 h后用不含EDTA的胰蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)皿消化下來(lái)，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌細(xì)胞2次；用1×binding buffer懸浮細(xì)胞至1×109個(gè)/L，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；然后再加入400 μL 1×binding buffer充分混合后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1MCF-7/TAX對(duì)紫杉醇的耐藥情況

MTT結(jié)果顯示(圖1A)，紫杉醇對(duì)MCF-7作用48 h的 IC50為1.07 μmol/L，對(duì)紫杉醇耐藥細(xì)胞株MCF-7/TAX作用48 h的 IC50為20.75 μmol/L，RI達(dá)19.39(表1)。

2.2扁蒴藤素對(duì)MCF-7/TAX的生長(zhǎng)抑制情況

MTT結(jié)果顯示(圖1B)，扁蒴藤素能抑制紫杉醇耐藥細(xì)胞MCF-7/TAX的生長(zhǎng)，且具有明顯的劑量依賴性，作用48 h的 IC50僅為0.52 μmol/L，對(duì)MCF-7作用48 h的 IC50為0.59 μmol/L，MCF-7/TAX對(duì)扁蒴藤素的RI僅為0.88(表1)。

表1　扁蒴藤素及紫杉醇對(duì)MCF-7/TAX和MCF-7細(xì)胞的IC50及RI

2.3扁蒴藤素誘導(dǎo)MCF-7/TAX細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，MCF-7/TAX不加扁蒴藤素的細(xì)胞凋亡率為0.8%，加1.0 μmol/L扁蒴藤素作用8 h后的細(xì)胞凋亡率達(dá)28.9%，凋亡細(xì)胞的比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3　討論

腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化學(xué)藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，稱多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，是造成腫瘤化療失敗的主要原因[10]。由于傳統(tǒng)的抗癌藥在化療過(guò)程中都往往會(huì)導(dǎo)致多藥耐藥的產(chǎn)生，因此開(kāi)發(fā)一些新的能夠?qū)Χ嗨幠退幍哪[瘤細(xì)胞也敏感的抗癌藥物是當(dāng)務(wù)之急。扁蒴藤素是雷公藤紅素的甲酯衍生物，主要存在于衛(wèi)矛科和希藤科植物中。隨著研究范圍不斷擴(kuò)大，扁蒴藤素的多種藥理活性逐漸被人們關(guān)注和研究，研究表明扁蒴藤素具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性，并具有廣譜抗腫瘤作用[1-7]。據(jù)報(bào)道，給藥6 h后，3 μmol/L的扁蒴藤素可抑制81%人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)[11]。但有關(guān)于扁蒴藤素研究的報(bào)道還很有限，其對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的作用尚未明確。

注：A為紫杉醇，B為扁蒴藤素；(1)與MCF-7/TAX+紫杉醇比較，P<0.05圖1　MCF-7/TAX細(xì)胞對(duì)紫杉醇和扁蒴藤素耐藥情況(MTT法)Fig.1　The resistance situation of MCF-7/TAX cells to paclitaxel by MTT assay

注：A為對(duì)照，B為1.0 μmol/L扁蒴藤素；橫坐標(biāo)為Annexin-V，縱坐標(biāo)為PI圖2　扁蒴藤素對(duì)MCF-7/TAX細(xì)胞凋亡的影響(Annexin V-FITC/PI)Fig.2　Effect of pristimerin on apoptosis of MCF-7/TAX cells (Annexin V-FITC/PI staining)

本文對(duì)扁蒴藤素對(duì)紫杉醇耐藥細(xì)胞株MCF-7/TAX生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了探討。MTT比色結(jié)果顯示，紫杉醇耐藥細(xì)胞株MCF-7/TAX對(duì)紫杉醇的耐藥指數(shù)達(dá)19.39；而扁蒴藤素作用MCF-7/TAX細(xì)胞48 hr的IC50僅為0.52 μmol/L，降低其耐藥指數(shù)至0.88，說(shuō)明扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)揮高效抑制作用。凋亡是一種生理性、程序性的細(xì)胞死亡過(guò)程，細(xì)胞凋亡異常是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。MDR產(chǎn)生的機(jī)制非常復(fù)雜，研究表明凋亡逃逸(細(xì)胞抗凋亡能力提高)也是其重要機(jī)制之一。激發(fā)和恢復(fù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力，是腫瘤防治的有效途徑[12]。本研究Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果表明，經(jīng)扁蒴藤素作用后，Annexin V-FITC染色陽(yáng)性的MCF-7/TAX細(xì)胞比例升高，表明扁蒴藤素能誘導(dǎo)紫杉醇耐藥MCF-7/TAX細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果證實(shí)，扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，激活MCF-7/TAX細(xì)胞凋亡，從而對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)揮高效抑制作用，這將為開(kāi)發(fā)治療紫杉醇耐藥的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2016-03-25收稿，2016-07-31修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Inhibitory Effect of Pristimerin on Growth of Taxol-Resistant Breast Cancer Cells

XIE Guie1, DU Jingchun1, DONG Guilan2, XU Xia1

(1.KingmedSchoolofLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,Guangdong,China; 2.OutpatientDepartment,GuangzhouUniversity,Guangzhou510006,Guangdong,China)

Objective: To investigate the effect of pristimerin on the growth of taxol-resistant breast cancer cells MCF-7/TAX. Methods: The breast cancer cell line MCF-7 was the control group, and the taxol-resistant breast cancer cells line MCF-7/TAX was the observation group. In two groups of cells were cultured in 7 kinds of concentrations (0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 and 20 mol/L) pristimerin and paclitaxel for 48 h. MTT assay was used to detect half inhibition concentration (IC50) value of drug on MCF-7 and MCF-7/tax cells, and resistance index (RI) of cells to paclitaxel or pristimerin were calculated. At the same time Annexin V-FITC/PI staining was adopted to observe changes of proportion of apoptotic cells after pristimerin involvement. Results: The resistance index of MCF-7/TAX cells to paclitaxel was 19.39. After treatment with pristimerin for 48 h, MCF-7/TAX cells displayed markedly growth inhibition in a dose-dependent manner, and IC50 for 48 h was 0.52 μM. The resistance index of MCF-7/TAX cells to pristimerin was 0.88. After treatment with pristimerin, the proportion of positive MCF-7/TAX cells of Annexin V-FITC/PI staining was significantly higher than that of the control group. Conclusion: Pristimerin can resist resistance to paclitaxel resistance to breast cancer cells, activate apoptosis of MCF-7/TAX cells, thus effectively inhibit cancer cells growth.

taxol resistance; pristimerin; MCF-7/TAX; apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101682)； 廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金(2014A020212015)

R285

A

1000-2707(2016)09-1029-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.009

**通信作者 E-mail:xux2014@126.com