張新文， 李盈甫， 史　荔， 馬千里， 洪　超， 王婷婷， 俞建昆， 李傳印， 姚宇峰， 楊慧娟

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 云南 昆明　650118； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 干療科， 云南 昆明　650032； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 胸外科， 云南 昆明　650118)

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云南漢族人群HSPA1A基因多態(tài)性位點與肺癌的相關(guān)性研究*

張新文1， 李盈甫2， 史荔1， 馬千里3， 洪超1， 王婷婷1， 俞建昆1， 李傳印1， 姚宇峰1， 楊慧娟**

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 云南 昆明650118； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 干療科， 云南 昆明650032； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 胸外科， 云南 昆明650118)

目的： 探討HSPA1A基因多態(tài)性與肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。方法： 選取云南地區(qū)漢族人群肺癌患者288例為病例組，健康體檢人群298例為對照組，采用TaqMan探針基因分型方法對HSPA1A基因中的4個多態(tài)性位點(SNPs)位點rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)、rs1008438(G>T)及rs1043618(G>C)進行基因分型，研究其等位基因、基因型及所構(gòu)建的單倍型在兩組人群中分布差異。結(jié)果： 2組人群rs1043618(G>C)等位基因C和G的分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)，其中等位基因C是肺癌發(fā)生的保護性因素[OR=0.767；95%CI(0.597～0.986)]；rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)和rs1008438(G>T)的等位基因和基因型的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；rs12190359與rs1008438(G>T)以及rs562047(C>G)與rs11043618(G>C)的單倍型在2組間分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：HSPA1A基因rs1043618(G>C)等位基因C可能是云南漢族肺癌發(fā)生的保護性因素。

肺腫瘤; HSPA1A; 單核苷酸多態(tài)性; 相關(guān)性； 漢族； 云南

肺癌是世界范圍內(nèi)死亡率最高的腫瘤，新發(fā)病例在亞洲和非洲呈逐年增加[1-2]。在中國，肺癌新發(fā)病例和死亡人數(shù)約為70萬和60萬。研究表明 ，吸煙是肺癌發(fā)生的重要因素[3]，但并非所有吸煙者均會發(fā)展為肺癌。近年來的研究顯示，宿主遺傳因素在肺癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，尤其是與腫瘤相關(guān)的基因中存在的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。鑒于位于啟動子區(qū)域或5′-UTR區(qū)域的SNPs有可能會對基因的表達產(chǎn)生影響，而位于氨基酸編碼區(qū)的SNPs有可能會對基因的功能產(chǎn)生影響，因此本研究選取HSPA1A基因啟動子和5′-UTR區(qū)域的SNPs位點rs1008438(G>T)和rs1043618(G>C)，以及與Hsp70蛋白ATP結(jié)合相關(guān)的第110位和116位氨基酸密碼子的SNPs位點rs562047(C>G)和rs12190359(C>T)，研究這些SNPs位點在肺癌患者以及健康對照人群中的分布情況，以期找到與肺癌發(fā)生具有相關(guān)性的HSPA1A基因中的多態(tài)性位點，為肺癌診斷及治療提供新的靶點及思路。

1　對象與方法

1.1對象

根據(jù)“知情同意”原則，隨機選取2012年10月～2014年5月確診為肺癌的患者288例為病例組，采用世界衛(wèi)生組織(WHO 2004)肺癌組織類型劃分標(biāo)準(zhǔn)進行病理分型，采用國際肺癌臨床分期系統(tǒng)進行臨床分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受放化療等抗腫瘤治療的病例，(2)患有其他惡性腫瘤，或合并心血管疾病、糖尿病、肝炎、腎病等疾病的患者，(3)資料不全者。對照組288人為2013年10月～2016年5月正常體檢者。所有對象均為居住于云南地區(qū)彼此無血緣關(guān)系的漢族個體，年齡30～75歲。病例組平均(55.55±10.67)歲，男女性別比197/91，病理類型鱗癌101例，腺癌178例，鱗腺癌5例，其他4例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期92例，196例。對照組平均(54.01±10.12)歲，男女性別比192/96，兩組被檢者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

采集空腹靜脈血5 mL，用EDTA 或肝素抗凝，使用QIAGEN血基因組DNA 小量試劑盒提取DNA。并用超微量紫外可見分光光度計(ND-2000，美國ThermoScientific公司)檢測DNA的濃度和純度。采用TaqMan探針熒光定量PCR方法檢測SNPs位點的基因分型，TaqMan探針、引物和SNPs分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix)均購自美國ABI公司(http://www.appliedbiosystems.com)。羅氏LightCycler 480 實時熒光定量PCR 儀檢測SNPs 位點及分型，PCR 反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min，共40 個循環(huán)，40 ℃ 5 min 長延伸。以3 個已知基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對照，用羅氏LightCycler 480 基因分型軟件(LCS480 1.5.1.62)進行結(jié)果分析和基因分型，同時對部分TaqMan分型結(jié)果進行測序驗證。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

Hardy-Weinberg平衡檢驗樣品的代表性。t檢驗檢測兩組被檢者的年齡是否有差異，χ2檢驗檢測病例組組和對照組性別差異及HSPA1A基因各SNPs 位點基因型和等位基因頻率差異。SHEsis軟件程序計算連鎖不平衡，常用D’表示，D’值為0時、連鎖完全平衡，D’值為1 時、連鎖完全不平衡，D′>0.8時、認(rèn)為存在強連鎖[4]，根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果構(gòu)建單倍型，并檢測單倍型頻率在病例組與對照組之間的差異[5]。多重比較時采用Bonferroni進行校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1樣品的代表性

HSPA1A基因啟動子區(qū)SNPs位點rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)、rs1008438(G>T)和rs1043618(G>C)的基因型在兩組人群中的分布全部符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明本研究所采集的樣本為具有群體代表性的隨機樣本。

2.2HSPA1A基因SNPs位點與肺癌的相關(guān)性

rs1043618(G>C)等位基因C和G分布頻率在2組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)，rs1043618(G>C)等位基因C是肺癌發(fā)生的保護性因素[OR=0.767；95%CI(0.597～0.986)]。rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)和rs1008438(G>T)基因型和等位基因分布頻率在2組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　HSPA1A 4個SNPs位點基因型和等位基因頻率在病例組和對照組人群中的分布

2.3HSPA1ASNPs位點連鎖不平衡

連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，病例組和對照組中rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)、rs1008438(G>T)和rs1043618(G>C)間均存在連鎖不平衡，其中rs12190359(C>T)與rs1008438(G>T)間、rs562047(C>G)與rs1043618(G>C)間存在強連鎖(D’=0.918、0.964)；而rs12190359(C>T)與rs562047(C>G)、rs12190359(C>T)與rs1043618(G>C)、rs562047(C>G)與rs1008438(G>T)以及rs1008438(G>T)與rs1043618(G>C)間的連鎖不平衡D′值均<0.8，這些位點間的連鎖關(guān)系不明顯。

2.4HSPA1A4個SNPs位點單倍型

根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果，構(gòu)建HSPA1ASNPs4個位點中rs12190359(C>T)與rs1008438(G>T)以及rs562047(C>G)與rs1043618(G>C)之間的單倍型，并對出現(xiàn)頻率>3%的SNPs位點單倍型進行分析，結(jié)果顯示，在病例組與對照組中各單倍型的分布頻率分別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　HSPA1A 4個SNPs位點的單倍型在病例組和對照組中分布頻率

2.5HSPA1A4個SNPs位點與肺癌臨床分期的關(guān)系

HSPA1A基因中4個SNPs的基因型和等位基因在肺癌Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明HSPA1A4個SNPs位點與肺癌的臨床分期無關(guān)。見表3。

2.6HSPA1A4個SNPs與肺癌病理類型的關(guān)系

HSPA1A4個SNPs的基因型和等位基因在鱗癌患者和腺癌患者中的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示HSPA1A4個SNPs位點與肺癌的病理類型無關(guān)。見表4。

表3　 HSPA1A 4個位點SNPs位點基因型和等位基因在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期肺癌患者中的分布

表4　HSPA1A 4個位點SNPs位點基因型和等位基因在肺鱗癌和腺癌患者中的分布

3　討論

熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是一類在進化上高度保守的蛋白，Hsp70蛋白屬于是一類應(yīng)急表達的分子伴侶蛋白[6]。Hsp70家族中的HSPA1A是誘導(dǎo)型表達基因(編碼Hsp70、Hsp72)。研究顯示，存在于HSPA1B中的多態(tài)性位點可以影響HSPA1A和HSPA1B的表達量，甚至與肺癌患者的存活率具有相關(guān)性[7]，Gunther等[8]研究發(fā)現(xiàn)血清Hsp70蛋白水平高低影響肺癌腫瘤組織的生長。分子伴侶主要參與新合成多肽的折疊、多蛋白復(fù)合物的裝配、蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運以及蛋白質(zhì)經(jīng)溶酶體途徑的降解等過程[9-10]。Hsp70蛋白通常在細(xì)胞內(nèi)是不表達或低表達，但當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激時，Hsp70蛋白會迅速累積，以應(yīng)對細(xì)胞中大量新合成蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運，增強細(xì)胞應(yīng)激能力[11]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程需要腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量蛋白的合成，具有典型的壓力表型，因此在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、前列腺癌、食道癌以及宮頸癌中均出現(xiàn)了Hsp70蛋白的高表達[12]。相關(guān)研究顯示，Hsp70蛋白與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和抗凋亡有關(guān)[13]。臨床研究也顯示，Hsp 70蛋白的高表達會導(dǎo)致較差的預(yù)后[14]。以上資料表明Hsp70的表達量多少在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。存在于基因中的SNPs可以影響基因的表達與功能，從而與許多疾病(包括癌癥)相關(guān)。目前已有大量研究聚焦于HSPA1A基因中的SNPs與疾病的相關(guān)性。這些研究多針對于rs1008438(G>T)以及rs1043618(G>C)兩個位點在不同人種中與不同疾病的相關(guān)性研究[14]。本研究選擇HSPA1A基因中的SNPs位點rs1008438(G>T)以及rs1043618(G>C)，研究其在肺癌與健康人群中的分布頻率，以期發(fā)現(xiàn)這些SNPs位點與肺癌的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，rs1043618(G>C)等位基因C是肺癌發(fā)生的保護性因素。Gunther等[8]研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清Hsp70蛋白水平明顯高于健康對照人群， Dullin等[14]發(fā)現(xiàn)rs1043618(G>C)等位基因C以及rs1008438(G>T)等位基因G與細(xì)胞內(nèi)Hsp70蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。因此，推測位于基因5′-UTR區(qū)域的rs1043618(G>C)等位基因C可能不利于Hsp70的表達，從而在肺癌發(fā)生過程發(fā)揮保護作用。雖然Dullin等[14]的研究顯示rs1008438(G>T)等位基因與Hsp70蛋白表達水平相關(guān)，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1008438(G>T)等位基因和基因型與肺癌發(fā)生的關(guān)系并不明顯。這可能與本研究樣本量有關(guān)，鑒于其對Hsp70蛋白表達的影響，可能隨著樣本量的增加結(jié)果會有所改變。

本研究還選取了位于Hsp70蛋白功能區(qū)域氨基酸密碼子中的SNPs位點進行研究，其中位于第110位氨基酸密碼子的位點rs562047(C>G)可導(dǎo)致谷氨酸與天冬氨酸的錯義突變，而位于第116位氨基酸的rs12190359(C>T)可導(dǎo)致氨基酸密碼子的同義突變，結(jié)果顯示這兩個位點與肺癌的發(fā)生無關(guān)。這可能是因為即使該位點的等位基因?qū)е翲sp70蛋白分子伴侶功能發(fā)生變化，但由于失去分子伴侶功能的Hsp70蛋白同樣具有抗凋亡作用，未影響到Hsp70蛋白在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用[15]。本研究還分析了4個SNPs位點與肺癌嚴(yán)重程度以及病理類型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這4個SNPs位點在肺癌不同臨床分期患者之間以及不同病理類型患者之間中的分布頻率沒有顯著差異。

綜上所述，本研究中HSPA1A基因中的4個SNPs位點，只有位于基因5’-UTR區(qū)域的rs1043618(G>C)與肺癌的發(fā)生具有相關(guān)性，其中等位基因C是肺癌發(fā)生的保護性因素。肺癌是一種治療及預(yù)后都極差的惡性腫瘤，因此尋找與肺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志對于肺癌的診斷、治療以及預(yù)后都具有重要意義。本研究結(jié)果對于研究肺癌發(fā)生發(fā)展機制以及肺癌診斷、治療具有一定意義。

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(2016-05-08收稿，2016-08-15修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

The Association of SNPs inHSPA1AGene with Lung Cancer in Yunnan Han Population

ZHANG Xinwen1, LI Yingfu2, SHI Li1, MA Qianli3, HONG Chao1,WANG Tingting1, YU Jiankun1, LI Chuanyin1, YAO Yufeng1， YANG Huijuan1

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentonSevereInfectiousDisease,Kunming650118,Yunnan,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,Yunnan,China; 3.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To explore the association of four single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs12190359 C>T, rs562047 C>G, rs1008438 G>T and rs1043618 G>C inHSPA1Agene with the lung cancer in a Yunnan Han population. Method: A total 288 patients with lung cancer and 298 healthy individuals were recruited in this study, and the genotyping of above-mentioned four SNPs was analyzed by Taqman assay. The distribution of alleles, genotypes and constructed haplotypes in the two groups was studied. Result: There were statistically significant differences in distribution frequency of alleles G and C of rs1043618 G>C were significantly different between case and control groups (P=0.038), and allel C was a protective factor of lung cancer[OR=0.767；95%CI(0.597～0.986)]. There were no statistically significant differences in distribution of the allele and genotype of rs12190359 C>T, rs562047 C>G and rs108438 G>T between the case group and control group(P>0.05). There were no statistically significant differences in the distribution frequencies of haplotypes of rs12190359 and rs1008438(G>T), rs562047(C>G) and rs11043618(G>C) between case and control groups (P>0.05). Conclusion: The C allele of rs1043618 G>C inHSPA1Agene may be a protection factor of lung cancer, and the other sites may be not related to occurrence occurrence of lung cancer.

lung cancer; HSPA1A; single nucleotide polymorphism; association; Han nationality; Yunnan province

國家自然基金項目(31270030和81573206)； 協(xié)和青年基金(3332015149)； 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目(2016FA034)； 云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(2013FB169)； 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費項目(2012IPB107)

E-mail:huijuanyang@imbcams.wm.cn

R734.2； RZ274

A

1000-2707(2016)09-1010-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.005

**

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.032.html