張坤木, 李長輝,宋紅梅,陳　彥，陳倩婧,鐘灼琴

(1. 福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2. 福建省立醫(yī)院，福建 福州 350003)

?

論著

分子生物學技術研究桂枝加葛根湯和獨活寄生湯防治頸/腰椎病的機制

張坤木1, 李長輝1,宋紅梅1,陳彥1，陳倩婧1,鐘灼琴2

(1. 福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2. 福建省立醫(yī)院，福建 福州 350003)

目的運用分子生物學技術研究桂枝加葛根湯和獨活寄生湯防治頸/腰椎病的起效機制。方法用低、中、高劑量桂枝加葛根湯血清和獨活寄生湯血清及空白血清分別干預大鼠頸/腰椎間盤細胞，再采用MTT比色法和Western blotting技術分別檢測各組大鼠頸/腰椎間盤細胞生長情況和CaM、CaMK、CREB相關蛋白表達水平。結果干預后第1天，5組間頸/腰椎間盤細胞生長情況比色值比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；干預后的第2—7天，各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細胞生長情況比色值均明顯高于空白血清組(P均<0.05)，且隨作用時間呈遞增趨勢。各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達量均明顯高于空白血清組(P均<0.05)；中、高劑量中藥血清組和胎牛血清組各蛋白表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但此3組各蛋白表達量均高于低劑量中藥血清組(P均<0.05)，且高劑量中藥血清組各蛋白表達量均明顯高于中劑量中藥血清組(P均<0.05)。結論分子生物學技術研究提示桂枝加葛根湯和獨活寄生湯可能通過促進頸/腰椎椎間盤細胞的生長及相關蛋白的表達水平達到防治頸/腰椎病的目的，而且其效應過程可能存在一條重要的信號通路即CaM-CaMK-CREB通路。

桂枝加葛根湯；獨活寄生湯；頸椎病；腰椎病；信號通路

近年來，隨著城市生活節(jié)奏的加快、電子產(chǎn)品的普及，辦公人員幾乎都需要在電腦前長時間伏案、久坐工作，即便是工作之余，大部分人仍然離不開手機，使得頸腰椎病成為目前臨床常見病、多發(fā)病[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，我國目前頸椎病的發(fā)病率為17.3%，人一生中患頸椎病的概率為60%～90%，是導致45歲以下成人喪失勞動能力的最常見原因之一[3]。據(jù)統(tǒng)計，60%～80%的美國成年人在生活中有過腰痛的病因，由此也造成了巨大的醫(yī)療負擔，每年用于腰痛的花費是各類腫瘤總花費的3倍以上[4]。因此，尋求“簡便驗廉”的方法更好地防治頸腰椎疾病具有重要的社會經(jīng)濟效益，成為目前國內(nèi)外重點研究的課題。臨床治療方面中藥方劑具有“簡便驗廉”的優(yōu)點，諸多臨床研究表明桂枝加葛根湯對頸椎病、獨活寄生湯對腰椎病具有明顯的治療效果[5-10], 但以上研究大都局限于臨床病例觀察，其具體的起效機制尚未見深入報道研究。故筆者進行了相關的機制研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1　實驗資料

1.1藥物、試劑與儀器

1.1.1中藥藥物桂枝加葛根湯由葛根、芍藥、生姜、甘草、大棗、桂枝組成；獨活寄生湯由獨活、桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風、川芎、人參、甘草、當歸、芍藥、干地黃組成。

1.1.2主要試劑胎牛血清(杭州四季青生物公司)；DMEM培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶(美國Gibco公司)；胰蛋白酶、EDTA(美國Amresco公司)；RIPA裂解液(強)(北京碧云天公司)；甲苯胺藍染料(上海江萊生物科技有限公司，CAS:6586-4-5)；BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天公司)；DMSO(美國Sigma公司)；PMSF(北京碧云天公司)；Tris、甘氨酸(美國NOVON公司)；丙烯酰胺(上海博亞公司)；預染蛋白Marker(美國Invitrogen公司,SeeBlue Jia2)；Tween20(美國Amresco公司)；兔抗CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ及CREB單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋公司ZB-2301)；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋公司ZB-2305)；Mouse Anti-beta Actin Monoclonal antibody(北京中杉金橋公司TA-09)；ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Cell Signaling公司)；顯影定影液(美國Kodak公司)；NC膜(美國Biosciense公司)；細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒(北京碧云天公司)；其余試劑購買已經(jīng)配好的成品。

1.1.3主要儀器設備生物凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司SW-CJ-IF)，倒置顯微鏡(德國Leica公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，電熱式壓力消毒器(上海PHS-25)，離心沉淀器(上海手術器械廠80-2 CENTRIFUGE) ，恒溫水浴鍋(深圳HH-4)，550型酶標儀(美國BIO-RAD公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠DYY-6B)，電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD 公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司Gel Doc XR)。

1.2動物①健康清潔級SD大鼠160只，雌雄各半，體質量(200±10)g，用于制備中藥血清及空白血清；②健康1個月齡清潔級SD大鼠2只，雌雄不拘，體質量100 g左右，用于提取頸/腰椎間盤細胞。以上動物均來源于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號SCXX(滬)]，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心(醫(yī)動字23-016號)。

1.3方法實驗分為頸椎和腰椎2部分，頸椎實驗所用中藥為桂枝加葛根湯，腰椎實驗所用中藥為獨活寄生湯，2部分實驗方法相同。

1.3.1中藥藥物制備由福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院藥物制劑中心嚴格按《傷寒論》《備急千金要方》原方劑量比例制備。

1.3.2中藥血清及空白血清的制備[11-13]將制備好的中藥藥物按體表面積折算成動物的等效劑量，大鼠生藥量為11.6 g/kg。每項實驗各取SD大鼠80只以計算機隨機分組法分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和空白組各20只。低劑量組以等效劑量的0.5倍(每只1 mL)、中劑量組以等效劑量(每只2 mL)、高劑量組以2倍劑量(每只4 mL)灌胃,空白組以2 mL生理鹽水代之。均連續(xù)灌胃4 d，每天2次，于末次灌胃2 h后乙醚吸入麻醉，于腹主動脈及心臟采血，分離血清,-20 ℃保存，備用。

1.3.3大鼠頸/腰椎間盤細胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及鑒定參考文獻[14-18]，反復實驗研究出簡單易行、重復性強的方法，具體方法見文獻[19-20]。

1.3.3.1大鼠頸/腰椎間盤纖維環(huán)細胞原代培養(yǎng)大鼠麻醉后脫頸處死， 75%乙醇浸泡5 min，置于第一超凈臺內(nèi)，于托盤內(nèi)沿后正中線剪開皮膚，用75%的乙醇擦拭；更換手套和手術器械后沿棘突用剪刀剪開兩旁肌肉，沿椎弓根剪斷肋骨，將整條脊柱取出，盡量剝離椎間盤前緣所附著的肌肉，用磷酸鹽緩沖液PBS(含青鏈霉素)沖洗3遍以上至無明顯血跡。用眼科剪分離出椎間盤，放入盛有PBS無菌培養(yǎng)皿中漂洗3遍，用尖刀將髓核去除干凈，再用眼科剪將纖維環(huán)剪成1 mm3的小塊，再用磷酸鹽緩沖液PBS漂洗2遍，800 r/min×2 min離心，收集沉淀，用2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化15 min，DMEM終止消化。1 000 r/min×5 min離心，去上清，沉淀用無血清培養(yǎng)液清洗2次后加入1 g/L Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化。待組織大部分消化(約需4 h)，用DMEM培養(yǎng)液終止消化，200目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集懸液，1 000 r/min×5 min離心得細胞團，棄上清液，加入DMEM(內(nèi)含15%的胎牛血清)液稀釋，以細胞2×104/cm2接種到100 mL塑料培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；如果有剩余組織，可以往組織塊中加入1 g/L Ⅱ型膠原酶過夜消化，步驟同上。逐日倒置顯微鏡觀察，每隔3 d換液1次。

1.3.3.2大鼠頸/腰椎間盤纖維環(huán)細胞傳代培養(yǎng)當細胞生長至近培養(yǎng)瓶底面積的90%時(原代細胞培養(yǎng)12～16 d)進行傳代，棄培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS洗滌細胞2次，棄掉液體，沿瓶壁均勻滴入0.25%的胰蛋白酶(含0.01%的EDTA)，輕晃動培養(yǎng)瓶，鏡下觀察消化情況，見細胞皺縮、間隙加大、個別細胞變圓漂浮時立即用含血清的培養(yǎng)液3 mL終止消化，再用滴管輕輕吹打細胞數(shù)次制成細胞懸液，1 000 r/min×5 min離心棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含15%的胎牛血清)混懸細胞后按1∶2接種。細胞傳代培養(yǎng)1代后可換成10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3.3纖維環(huán)細胞甲苯胺藍染色將第3代傳代纖維環(huán)細胞接種在放有預處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進行細胞爬片，待細胞長成單層時進行甲苯胺藍染色。中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.3.3.4纖維環(huán)細胞Ⅰ，Ⅱ型膠原的免疫細胞化學染色將第3代傳代纖維環(huán)細胞，以2×104/cm2接種在放有預處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進行細胞爬片，待細胞長成單層時，進行Ⅰ，Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.3.4MTT比色法測定大鼠頸/腰椎間盤細胞生長曲線參考張慧鋒等[21]關于細胞活性檢測方法優(yōu)化研究中的方法，結合本實驗實際情況主要分為4個步驟：①計算細胞量，調(diào)整濃度。預設5組，5個復孔，每孔4 000個細胞，每孔加入100 μL。將二代培養(yǎng)細胞消化下來后計算培養(yǎng)基中的細胞總數(shù)，根據(jù)已知每孔濃度400個/100 μL =4×104個/mL,計算出所需往培養(yǎng)瓶中加入的DMEM培養(yǎng)液，使得最終濃度為4×104個/mL，再取出其中5×5×100 μL×7=17.5 mL，分別加入96孔板中。②培養(yǎng)細胞。先用上述含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h，使細胞貼壁再棄除培養(yǎng)液，5孔分別加入空白血清、低劑量中藥血清、中劑量中藥血清、高劑量中藥血清和胎牛血清各10 μL，每2 d換液1次。③呈色。之后的每天取出其中一板，先直接往每孔加入MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄所有液體，加入150 μL DMSO，振蕩10 min。④比色。置于492 nm波長的酶標儀上檢測吸光度值(即比色值)。

1.3.5Western blotting檢測相關蛋白表達水平

1.3.5.1實驗步驟參考李莎莎等[22]關于Western blotting檢測方法。取蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，按照濕轉法將電泳產(chǎn)物放在NC膜上轉膜2 h，TBST液清洗3次，將NC膜放入封閉液中室溫下?lián)u床2 h，置于4 ℃冰箱過夜，一抗孵育用TBS稀釋(1∶500)室溫下孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min；二抗孵育用TBST稀釋(1∶3 000)室溫下孵育2 h,TBS清洗2次，每次5 min。最后用購買的AB試劑盒顯色，膠片成像收集圖像。

1.3.5.2蛋白條帶分析采用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)采集膠片圖像，運用Image-Pro Jia 6.0軟件計算條帶的OD值，并進行半定量分析。

2　結　　果

2.1各組大鼠頸/腰椎間盤細胞生長情況比色值比較干預后第1天，5組間頸/腰椎間盤細胞生長情況比色值比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；干預后的第2—7天，各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細胞生長情況比色值均明顯高于空白血清組(P均<0.05)，且隨作用時間呈遞增趨勢。見表1。

表1　各組大鼠頸/腰椎間盤細胞生長情況比色值比較±s)

注：①與空白血清組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠頸/腰椎間盤細胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達情況比較各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達量均明顯高于空白血清組(P均<0.05)；中、高劑量中藥血清組和胎牛血清組各蛋白表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但此3組各蛋白表達量均高于低劑量中藥血清組(P均<0.05)，且高劑量中藥血清組各蛋白表達量均明顯高于中劑量中藥血清組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠頸/腰椎間盤細胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達情況比較

注：①與空白血清組比較，P<0.05；②與低劑量中藥血清組比較，P<0.05；③與中劑量中藥血清組比較，P<0.05。

3　討　　論

桂枝加葛根湯原方出自張仲景《傷寒論》，主治太陽中風兼太陽經(jīng)氣不舒證。頸椎病主癥為頸項僵硬、頸肩疼痛，頸項背部又為太陽經(jīng)脈循行部位，頸背拘急轉動不能自如，多為風寒外束、經(jīng)氣不舒、津液阻滯不能敷布,以致經(jīng)脈失于濡養(yǎng)。方中桂枝為君，助衛(wèi)陽，通經(jīng)絡，解肌發(fā)表而祛在表之風邪。白芍益陰斂營，固斂外泄之營陰，桂芍等量合用，內(nèi)調(diào)營衛(wèi)、陰陽，外可解肌發(fā)表；葛根解肌祛風而幫助桂枝湯發(fā)表解肌、宣通經(jīng)氣，解經(jīng)脈氣血之郁滯，生津液以緩經(jīng)脈之拘急，共為臣藥。生姜辛溫，既助桂枝辛散表邪，又兼和胃止嘔；大棗甘平，既能益氣補中，又可資脾生津。姜棗相配，是為補脾和胃、調(diào)和營衛(wèi)的常用組合，共為佐藥。炙甘草調(diào)和藥性，合桂枝辛甘化陽以實衛(wèi)，合芍藥酸甘化陰以和營，功兼佐使之用。上藥共奏解肌祛風、調(diào)和營衛(wèi)、升津舒經(jīng)之功。

獨活寄生湯方原出孫思邈《備急千金要方》。方中重用獨活為君，辛苦微溫，善治伏風，除久痹，且性善下行，以祛下焦與筋骨間的風寒濕邪。臣以細辛、防風、秦艽、桂心、細辛入少陰腎經(jīng)，秦艽祛風濕、舒筋絡而利關節(jié)，桂心溫經(jīng)散寒，通利血脈，防風祛一身之風而勝濕；佐入桑寄生、杜仲、牛膝以補益肝腎而強筋健骨，當歸、川芎、地黃、白芍養(yǎng)血和血，人參、茯苓、甘草健脾益氣?？v觀全方，以祛風寒濕邪為主，輔以補肝腎、益氣血之品，邪正兼顧，祛邪不傷正，扶正不留邪。

血清藥理學是指將中藥或中藥復方經(jīng)口給動物灌服一定時間后采集動物血液,分離血清，用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種半體內(nèi)實驗方法。該方法對中藥離體實驗有重大意義，主要針對中藥及其復方復雜多樣的化學成分特點，用含藥血清代替煎劑或粗提物進行體外實驗，克服了中藥粗制劑直接進行體外實驗的缺點,其結果的可信度高。

本實驗通過MTT比色法檢測中藥血清對大鼠椎間盤細胞生長的影響，結果發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量中藥血清和胎牛血清均能明顯促進大鼠椎間盤細胞生長，這種作用跟時間、劑量息息相關，隨著中藥劑量的增加，中藥血清促進細胞生長能力增強。但同時由于MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞絕對數(shù)，說服力度不夠，如何更精確地測定其真實細胞數(shù)有待進一步深入探討。本實驗Western blotting方法檢測結果發(fā)現(xiàn)，各劑量中藥血清均能提高大鼠椎間盤細胞CaM、CaMK Ⅱ、CaMK Ⅳ和CREB蛋白表達量，但在等效劑量(相當于本實驗的中劑量)以下中藥血清在提高相關蛋白表達能力方面與胎牛血清比較差異有統(tǒng)計學意義，等效劑量以上的中藥血清在提高相關蛋白表達水平方面與胎牛血清組比較差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，分子生物學技術研究提示桂枝加葛根湯和獨活寄生湯可能通過促進頸/腰椎椎間盤細胞的生長及相關蛋白的表達水平達到防治頸/腰椎病的目的，而且其效應過程可能存在一條重要的信號通路即CaM-CaMK-CREB通路，為臨床傳統(tǒng)中藥方劑防治頸腰椎病提供了理論支持。但由于實驗條件的限制，本課題設計中并未加入相關蛋白抑制劑，Western blotting檢測結果只能說明應用中藥血清作用于大鼠椎間盤細胞可明顯改變CaM、CaMK、CREB表達，但臨床上防治頸/腰椎病的效應過程是否確實存在著一條重要的信號通路即CaM-CaMK-CREB尚有待進一步研究，而且是否存在其他信號通路影響也將是需要進一步深入探討的重要問題。

[1]翟楠楠,陳永強. 腰背肌鍛煉對非手術治療腰椎間盤突出癥影響的研究進展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2014,23(34):3874-3876

[2]王擁軍,施杞，賈連順. 中西醫(yī)結合治療頸椎病臨床療效觀察[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2015,34(8):81-82

[3]王詩忠,陳水金,龔德貴，等. 分期綜合療法治療頸椎間盤突出癥療效觀察[J]. 中國康復理論與實踐,2005,11(10):859-860

[4]Deyo RA,Weinstein JN. Lowbackpain[J]. N Engl J Med,2001,344(5):363-370

[5]白義認,孫香林,王雷. 獨活寄生湯加味治療腰椎間盤突出癥130例[J]. 現(xiàn)代中醫(yī)藥,2010，30(3)：34-35

[6]張其江. 桂枝葛根湯加味治療椎-基底動脈型頸椎病160例[J]. 實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2006,20(5):516

[7]徐成，王詩忠，陳水金，等. 桂枝加葛根湯結合頸椎牽引治療神經(jīng)根型頸椎病68例隨機對照臨床研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2009，36(12)：2095-2097

[8]唐玉萍. 中醫(yī)骨傷手法結合獨活寄生湯加減治療腰椎間盤突出癥60例[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2012，21(32):3598-3599

[9]李本覺,賀文容. 獨活寄生湯加味治療腰椎間盤突出癥64例[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2009,18(27)：3319-3320

[10]鎮(zhèn)樹清，鎮(zhèn)水清，鎮(zhèn)萬雄，等. 獨活寄生湯加味治療腰椎間盤突出癥126例[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2009,18(2):175-176

[11]邢作英，王永霞，高原，等. 血清藥理學研究概要[J]. 世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2015,17(1):219-222

[12]董鳳彩. 中藥含藥血清的臨床應用效果[J]. 中國臨床研究,2015,17(7):23-25

[13]鐘灼琴，李長輝，張坤木，等. 獨活寄生湯對大鼠腰椎間盤細胞活性及Csm-CaMK-CREB信號通路的影響[J]. 云南中醫(yī)學院學報，2015，38(2)：11-14

[14]周泉,王擁軍,施杞. 椎間盤纖維環(huán)細胞的培養(yǎng)[J]. 脊柱外科雜志,2003,1(4):226-229

[15]潘勇,周躍,李長青,等. 組織工程椎間盤纖維環(huán)種子細胞的培養(yǎng)和鑒定[J]. 四川醫(yī)學,2009,4(30):450-452

[16]郭志良,周躍,滕海軍,等. 大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞的培養(yǎng)和鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009,13(2):300-304

[17]林旺,王萬明. 纖維環(huán)細胞的培養(yǎng)技術及生長因子調(diào)控[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009,13(15):2955-2959

[18]范東偉，陳偉強. 周期性張應力對人腰椎間盤纖維環(huán)細胞合成和分解的影響[J]. 天津醫(yī)藥，2014,42(3):241-244

[19]張坤木,陳少清,宋紅梅,等. 大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞的培養(yǎng)及鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2011,15(11):1973-1976

[20]Kunmu Zhang,Changhui Li,Shizhong Wang,et al . A study of the influence of Guizhi plus Gegen Decoction on the mechanism of signal transductions occurring in cervical intervertebral disc cells of adult rats[J]. Biomedical Research,2014，25(4):620-625

[21]張慧鋒,張鐸,王倩,等. 血管緊張素II對血管內(nèi)皮細胞活性氧和線粒體功能的影響[J]. 吉林醫(yī)學院學報,2015,36(4):241-243

[22]李莎莎,吳福榮,何傲林,等. 曲尼司特對TGF-β1誘導的NBK-52E細胞E-cadherin表達的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2011,20(28):3533-3534

Study on the mechanism of prevention and treatment for cervical or lumbar disease with Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction by molecular biology

ZHANG Kunmu1, LI Changhui1,SONG Hongmei1,CHEN Yan1,CHEN Qianjing1,ZHONG Zhuoqin2

(1.The Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350003,Fujian,China；2.Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350003,Fujian,China)

Objective It is to study the mechanism of prevention and treatment for cervical or lumbar disease with Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction by molecular biology. Methods Lumbar/cervical cells in rats were treated respectively with low, medium, high dosage of serum which contained Guizhi+Gegen decoction,Duhuo Jisheng decoction and blank serum. Then the growth of the cells and the expression of correlated protein of CaM, CaMK, CREB in every group were detected by MTT colorimetric method and Western blotting technology. Results On the first day of intervention, there was no significant difference in the colorimetric value of growth of lumbar/cervical cells among the five groups(P>0.05); On the second day to the seventh day, the values in every Chinese medicine group and fetal calf serum group were significantly higher than that in blank serum group (P<0.05), and the effects were more significant with the time increase. The expression of correlated protein of CaM, CaMK, CREB in every Chinese medicine group and fetal calf serum group was obviously higher than that in blank serum group (P<0.05), there was no significant difference in the expression among medium, high dosage of Chinese medicine serum group and fetal calf serum group(P>0.05), but the expression was higher than that in low dosage group (P<0.05), and the expression in high dosage group was higher than that in medium dosage group (P<0.05). Conclusion By molecular biology technology research showed that Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction can promote the growth of the cervical, lumbar intervertebral disc cells and related protein expression level to achieve the purpose of prevention and treatment of neck, lumbar disease, and its effect to process there may be an important signaling pathways, that is CaM- CaMK-CREB pathway.

Guizhi+Gegen decoction; Duhuo Jisheng decoction; cervical spondylosis；lumbar disease; signaling pathways

張坤木，男，主治醫(yī)師，碩士，從事脊柱病及其相關性疾病的基礎與臨床研究。

鐘灼琴，E-mail:277873495@qq.com

福建省衛(wèi)生廳青年課題(2013-1-39)；福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥課題(wzkf201304；wzln201302)；福建省自然科學基金資助項目(2013J01320)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.25.001

R-332

A

1008-8849(2016)25-2737-05

2016-04-20