葉綏艷，劉曉鶯，樊海燕

(陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 719000)

?

CD8+記憶T細(xì)胞表達(dá)水平及對(duì)結(jié)核患者與潛在感染者的診斷價(jià)值

葉綏艷，劉曉鶯，樊海燕

(陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 719000)

目的探討CD8+記憶T細(xì)胞在結(jié)核患者與潛在感染者血清中的表達(dá)水平及其診斷價(jià)值。方法選取30例活動(dòng)性肺結(jié)核患者作為結(jié)核(TB)組，選取40例潛在感染者作為潛在感染(LTBI)組；另選取同期來(lái)進(jìn)行體檢的健康人作為對(duì)照組。取3組受檢者外周血，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+記憶T細(xì)胞的表達(dá)水平，并分析其與IFN-γ釋放水平及HRCT評(píng)分的關(guān)系。結(jié)果LTBI組和TB組患者CD8+TCM、CD8+TEMRA細(xì)胞亞群表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，CD8+TEM表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)；且LTBI組與TB組CD8+T細(xì)胞各亞群表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，IFN-γ釋放水平與CD8+TCM細(xì)胞亞群表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.319 8,P=0.022 7)；而CD8+記憶T細(xì)胞表達(dá)水平與HRCT評(píng)分呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.273 4，P=0.014 0)。結(jié)論CD8+記憶T細(xì)胞表達(dá)水平的檢測(cè)有助于結(jié)核病的診斷、鑒別診斷、病情程度判斷及治療效果評(píng)估，值得在臨床上廣泛應(yīng)用。

CD8+記憶T細(xì)胞；結(jié)核；潛伏感染；診斷價(jià)值

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染病，在世界范圍內(nèi)的病死率較高，目前，臨床上尚未完全明確其發(fā)病機(jī)制，但發(fā)現(xiàn)控制和治療結(jié)核病的關(guān)鍵是快速診療[1]。近年來(lái)研究證實(shí)，CD4+T和CD8+T細(xì)胞是抗結(jié)核保護(hù)性免疫主要依賴的細(xì)胞，在結(jié)核免疫保護(hù)中均發(fā)揮十分重要的作用[2]。記憶T細(xì)胞能再次識(shí)別相同抗原而產(chǎn)生二次免疫反應(yīng)，對(duì)特異性抗原具有很強(qiáng)的記憶能力，是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)病原菌再次感染的預(yù)防基礎(chǔ)，故記憶T細(xì)胞的誘導(dǎo)對(duì)高效疫苗的產(chǎn)生十分關(guān)鍵[3]。目前，臨床上尚較少有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原特異性記憶T細(xì)胞亞群的抗結(jié)核免疫作用研究[4]。本研究對(duì)活動(dòng)期結(jié)核病患者和潛伏感染者血清中CD8+記憶T細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析，旨在探討其在結(jié)核病診斷中的價(jià)值，為結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的了解及防治措施的研發(fā)提供一定的參考依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料選取2013年1月—2014年1月我院收治的30例結(jié)核病患者作為T(mén)B組，經(jīng)痰涂片抗酸桿菌或結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性確診為肺結(jié)核，以《2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)肺結(jié)核診斷和治療指南標(biāo)準(zhǔn)》[5]為診斷依據(jù)，男16例，女14例；年齡21～64(38.3±3.5)歲。另收集同期收治PPD皮試和結(jié)核分枝桿菌抗原特異性IFN-Y ELISPOT檢測(cè)陽(yáng)性的40例潛伏感染者作為L(zhǎng)TBI組，患者的臨床癥狀不明顯，男22例，女18例；年齡20～62(37.9±3.4)歲。2組均排除感染HIV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)者，合并心、肝、腎等重要臟器疾病者，合并糖尿病、惡性腫瘤及免疫缺陷疾病者，以及近期(4個(gè)月內(nèi))使用過(guò)免疫抑制劑或激素治療者。另選擇同期我院門(mén)診體檢健康者40例作為對(duì)照組，PPD皮試和結(jié)核分枝桿菌抗原特異性IFN-Y ELISPOT檢測(cè)均陰性，男20例，女20例；年齡19～64(38.6±4.1)歲。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書(shū)。3組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+記憶T細(xì)胞亞群在PBMCs中的表達(dá)水平。根據(jù)CD45RA和CCR7表達(dá)情況將CD8+記憶T細(xì)胞分為CD45RA-CCR7+中央記憶T細(xì)胞(TCM)、CD45RA-CCR7-效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM)和CD45RA+CCR7-效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEMRA)。3組入組后于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下各抽取5 mL靜脈血，將其置于盛有EDTANa2的抗凝管中，采取Ficoll梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。分離完成后，在每孔內(nèi)加入PBMCs細(xì)胞懸液200 μL，再依次加入含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基、PMA、ionomycin各750 μL、50 ng/mL、1 μg/mL，并充分混勻，然后再孵育1 h。孵育完成后加入濃度為10 μg/mL的Brefeldin A，繼續(xù)孵育5 h。孵育完成后，采用含2%胎牛血清的PBS緩沖液對(duì)PBMCs進(jìn)行沖洗，結(jié)束后依次加入CD8-PC5單克隆抗體、CCR7-PC7抗體、CD45RA-FITC單克隆抗體各3 μL、2.5 μL、7.5 μL，在4 ℃避光的條件下進(jìn)行標(biāo)記，約30 min。30 min后采用含2%胎牛血清的PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，再加入500 μL 2%胎牛血清的PBS緩沖液，使細(xì)胞懸浮于其中，置于4 ℃避光條件下保存，應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的同型對(duì)照?？贵w標(biāo)記后，采用流式細(xì)胞儀(BeckmancoulterPC500)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)經(jīng)CellQuest軟件分析，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率。分析CD8+記憶T細(xì)胞亞群與IFN-γ釋放水平、HRCT評(píng)分的相關(guān)性，IFN-γ水平采用ELISPOT法檢測(cè)，HRCT評(píng)分是專業(yè)人員根據(jù)CT檢查對(duì)CT征象進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分范圍為0～168分。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，采用單因素方差分析Newman-Keuls多重比較試驗(yàn)進(jìn)行3組間的差異比較，采用直線相關(guān)性分析法進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.13組CD8+記憶T細(xì)胞亞群的表達(dá)情況比較與對(duì)照組相比，LTBI、TB組患者CD8+TCM、CD8+TEMRA細(xì)胞亞群表達(dá)水平呈顯著增加(P均<0.05)，而CD8+TEM細(xì)胞亞群表達(dá)水平顯著降低(P均<0.05)；且TB組患者的CD8+TCM、CD8+TEMRA細(xì)胞亞群表達(dá)水平高于LTBI組(P均<0.05)，CD8+TEM表達(dá)水平低于LTBI組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　3組CD8+記憶T細(xì)胞亞群表達(dá)情況比較

2.2CD8+記憶T細(xì)胞亞群與非特異性抗原刺激后PBMCs中IFN-γ釋放水平的相關(guān)性經(jīng)直線相關(guān)性分析可知，ELISPOT法檢測(cè)的IFN-γ釋放水平與CD8+TCM表達(dá)水平之間呈正相關(guān)(r=0.319 8,P=0.022 7)，見(jiàn)圖1。而與CD8+TEM表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性。

圖1　CD8+TCM細(xì)胞亞群表達(dá)水平與IFN-γ釋放水平的相關(guān)性

2.3TB患者CD8+記憶T細(xì)胞表達(dá)水平與HRCT評(píng)分的相關(guān)性經(jīng)直線相關(guān)性分析可知，CD8+記憶T細(xì)胞表達(dá)水平與HRCT評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.273 4，P=0.014 0)。見(jiàn)圖2。

圖2　CD8+記憶T細(xì)胞表達(dá)水平與HRCT評(píng)分的相關(guān)性

3　討　　論

帶菌免疫是結(jié)核細(xì)胞免疫的主要特點(diǎn)，一旦消除結(jié)核菌，特異性細(xì)胞免疫也會(huì)隨之消失，這是由于結(jié)核菌初次感染后機(jī)體可產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞，從而發(fā)揮抗結(jié)核免疫保護(hù)作用[5]。目前，臨床抗結(jié)核免疫功能檢測(cè)中最常見(jiàn)的是CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，這兩種記憶性T細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮的作用至關(guān)重要[6]。既往CD4+T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等介導(dǎo)抗結(jié)核免疫保護(hù)的作用已被大量學(xué)者的研究所證實(shí)，被認(rèn)為是抗結(jié)核保護(hù)性免疫的重要記憶和功能細(xì)胞[7-9]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞也能發(fā)揮很好的抗結(jié)核免疫保護(hù)作用。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在不依賴CD4+T細(xì)胞的情況下，尤其是結(jié)核分枝桿菌感染的后期階段，CD8+T細(xì)胞可通過(guò)激活產(chǎn)生細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫作用。Betts等[11]研究也得出了類似的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)在抗病毒感染中CD8+T細(xì)胞發(fā)揮了有效的細(xì)胞應(yīng)答作用。

本研究在非特異性抗原刺激CD8+T細(xì)胞的同時(shí)對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行了抗體標(biāo)記，將CD8+記憶T細(xì)胞分為T(mén)CM、TEM、TEMRA3種亞型,后兩種均為效應(yīng)記憶T細(xì)胞[12]。多數(shù)學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，TCM、TEM細(xì)胞是活動(dòng)性結(jié)核患者體內(nèi)發(fā)揮免疫保護(hù)作用的重要CD8+T細(xì)胞亞群[13-14]。Streitz等[15]報(bào)道，在結(jié)核病患者中，CD8+T細(xì)胞亞群TCM表達(dá)水平高于潛伏感染者，且疫苗研究結(jié)果顯示疫苗誘導(dǎo)結(jié)核病患者產(chǎn)生的抗原特異性記憶性細(xì)胞多數(shù)為T(mén)CM，提示CD8+TCM細(xì)胞介導(dǎo)免疫保護(hù)。本研究結(jié)果顯示，TB組患者CD8+TCM、CD8+TEMRA細(xì)胞亞群表達(dá)水平均高于LTBI、健康人，CD8+TEM細(xì)胞亞群表達(dá)水平低于LTBI組及健康人，且LTBI與健康人各細(xì)胞亞群表達(dá)水平也存在較大差異，說(shuō)明結(jié)核病、潛伏感染者及健康人不同人群CD8+T細(xì)胞表型的表達(dá)水平存在較大差異。這與結(jié)核病患者免疫力下降、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答能力減弱密切相關(guān)，抗原特異性TEMR能直接溶解巨噬細(xì)胞而抑制結(jié)核菌增殖，故其高水平表達(dá)有利于抗結(jié)核免疫；TEM細(xì)胞表達(dá)水平的降低與結(jié)核桿菌感染后的破壞密切相關(guān)，細(xì)胞數(shù)量及功能均會(huì)受到影響，因而抗結(jié)核作用降低?？煽紤]將CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平作為結(jié)核病診斷及與潛伏感染鑒別診斷的指標(biāo)。

本研究還對(duì)CD8+T細(xì)胞亞群表達(dá)水平與IFN-γ釋放水平的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，IFN-γ水平與CD8+TCM表達(dá)水平呈現(xiàn)出正相關(guān)性，而與CD8+TEM表達(dá)水平未呈現(xiàn)出相關(guān)性，IFN-γ釋放隨CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平的增加而增多，進(jìn)一步提示IFN-γ可能主要由TCM細(xì)胞產(chǎn)生，兩者表達(dá)水平的同時(shí)升高預(yù)示抗結(jié)核免疫感染中結(jié)核菌抗原誘導(dǎo)的TCM可發(fā)揮重要作用，尤其是二次感染中。本研究針對(duì)患者肺部病理學(xué)損傷程度進(jìn)行了HRCT評(píng)分，并分析與CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)性，表明在CD8+T細(xì)胞可作為免疫學(xué)指標(biāo)用于TB病情嚴(yán)重程度的診斷。

綜上所述，結(jié)核病與潛伏感染者CD8+記憶T細(xì)胞亞群表達(dá)存在較大差異，為兩者的臨床鑒別診斷提供了新的方法, 值得進(jìn)一步研究。

[1]鄢仁晴,方寧,趙建軍,等.肺結(jié)核患者外周血CD4+和CD8+記憶性T細(xì)胞亞群、IL-17、IL-27表達(dá)的初步探討[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2012,28(10):930-935

[2]廖春信,方毅敏,詹曉霞,等.肺結(jié)核患者外周血CD4+CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2014,17(10):781-786

[3]朱宇珍,鄭學(xué)寶,張明霞,等.肺結(jié)核患者外周血記憶性T細(xì)胞及B細(xì)胞亞群的檢測(cè)分析[J].臨床肺科雜志,2011,16(5):667-669

[4]李蕾.抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫機(jī)制研究[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(2):266-268

[5]沈興華,陳興年.肺結(jié)核患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的臨床分析[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,9(19):1477

[6]張少俊,肖和平.復(fù)治肺結(jié)核與初治結(jié)核病患者外周血T細(xì)胞亞群等的變化及其意義[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(12):884-887

[7]蔣靜,王仙園,鄧少麗,等.結(jié)核患者抗原特異性CD8+記憶T細(xì)胞的檢測(cè)分析[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(9):905-907

[8]劉琳,胡克.胸腔積液結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核性胸腔積液中的診斷價(jià)值[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(2):324-326

[9]劉先發(fā),黃才斌,張明霞,等.結(jié)核患者多功能CD8T細(xì)胞的表達(dá)水平及臨床意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014,16(5):716-718

[10]Hassan H,Sakaguchi S,Tenno M，et al.Cd8 enhancer E8_Iand Runx factors regulate CD8α expression in activated CD8+T cells[J].P NATL ACAD SCI USA,2011,108(45):18330-18335

[11]Trian T,Busche A,Abram M，et al.Superior induction and maintenance of protective CD8 T cells in mice infected with mouse cytomegalovirus vector expressing RAE-1[J].P Natl Acad Sci USA,2013,110(41):16550-16555

[12]Hedrich CM,Rauen T,Crispin JC，et al.CAMP-responsive element modulator α (CREMα) trans-represses the transmembrane glycoprotein CD8 and contributes to the generation of CD3+CD4-CD8-T cells in health and disease[J].J Biol Chem,2013,288(44):31880-31887

[13]栗群英,吳麗娟,陳莉,等.結(jié)核病患者T細(xì)胞亞群檢測(cè)臨床意義分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(19):2346-2347

[14]Unger WWJ,Van Beelen AJ,Bruijns SC，et al.Glycan-modified liposomes boost CD4+and CD8+T-cell responses by targeting DC-SIGN on dendritic cells[J].J Control Release,2012,160(1):88-95

[15]Miyagawa F,Zhang H,Terunuma A，et al.Interferon regulatory factor 8 integrates T-cell receptor and cytokine-signaling pathways and drives effector differentiation of CD8 T cells[J].Proc Natl Acad Sci U.S.A.，2012,109(30):12123-12128

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.27.033

R521

B

1008-8849(2016)27-3055-03

2016-04-10