鄭瀟然,白吉明,李建輝,王　翔,錢　浩,王新杰,李建華

(河北省承德市中心醫(yī)院暨承德醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,河北 承德 067000)

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激發(fā)型CD28單抗參與誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺M(fèi)DA-MB-231、MCF-7細(xì)胞的殺傷作用研究

鄭瀟然,白吉明,李建輝,王翔,錢浩,王新杰,李建華

(河北省承德市中心醫(yī)院暨承德醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,河北 承德 067000)

目的觀察激發(fā)型CD28單抗參與誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的增殖能力、表型特征及對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株的殺傷作用。方法制備鼠抗人激發(fā)型CD28單抗，采用激發(fā)型CD28單抗參與CIK的誘導(dǎo)，觀察CIK細(xì)胞的增殖能力及表型特征；采用CCK-8法檢測(cè)激發(fā)型CD28單抗參與誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株的殺傷率，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果激發(fā)型CD28單抗能明顯促進(jìn)CIK細(xì)胞的體外增殖且能明顯上調(diào)具有腫瘤殺傷活性的T細(xì)胞比例；CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷率均高于對(duì)照組(P均<0.05)，且殺傷率隨效靶比升高，并確定20∶1為最終效靶比；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK，可提高乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7的凋亡率及壞死率(P均<0.05)。結(jié)論激發(fā)型CD28單抗參與誘導(dǎo)的CIK能明顯提高CIK的增殖能力及上調(diào)具有腫瘤殺傷活性的T細(xì)胞比例，增強(qiáng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷能力，可能為乳腺癌的免疫治療提供新思路。

激發(fā)型CD28單抗；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；乳腺癌

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，治療方法主要有手術(shù)治療、化療、放療及內(nèi)分泌治療等。近年來，乳腺癌的免疫治療成為研究熱點(diǎn)，且國(guó)內(nèi)外有許多關(guān)于乳腺癌免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究并取得了顯著進(jìn)展[1-3]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)因其具有較高的體外增殖活性及細(xì)胞毒活性，為腫瘤的免疫治療提供了新思路。目前，已有諸多研究將CIK應(yīng)用于肝癌[4]、腎癌[5]、胃癌[6]、惡性淋巴瘤[7]等惡性腫瘤的免疫治療中并取得一定進(jìn)展，但許多研究也發(fā)現(xiàn)CIK治療惡性腫瘤的臨床反應(yīng)率不高，且部分治療無效[8]。因此，如何提高CIK免疫治療抗腫瘤的敏感性，獲得足夠數(shù)量、高效的CIK以滿足臨床需要成為當(dāng)前研究的難點(diǎn)和關(guān)鍵。CD28是在人T細(xì)胞及部分NK細(xì)胞表面表達(dá)的重要分子，具有激發(fā)T細(xì)胞增殖與發(fā)揮免疫效應(yīng)的作用。激發(fā)型的CD28抗體能與細(xì)胞表面的CD28分子相結(jié)合，直接傳導(dǎo)細(xì)胞的活化信號(hào)，起到促進(jìn)細(xì)胞增殖及發(fā)揮免疫效應(yīng)作用。所以，本研究通過自行制備激發(fā)型CD28單抗，并聯(lián)合不同細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，以分析CIK細(xì)胞經(jīng)激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)后的增殖能力、表型特征及對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞的殺傷作用，為尋找安全、高效的CIK擴(kuò)增方案提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1主要儀器和試劑細(xì)胞培養(yǎng)板(Coabar，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning，美國(guó))，流式細(xì)胞儀(Beckman，美國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(SANYO，日本)，Model680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)，ProteinA親和層析純化儀(BioRad，美國(guó))。胎牛血清和小牛血清(Gibco，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)，Gibco)，RPMI-1640 (美國(guó)，Gibco)，抗性篩選藥物G418(Invitrogen，美國(guó))，PE標(biāo)記的鼠抗人CD28單克隆抗體(Novus，美國(guó))，Pristane(Sigma，美國(guó))，基因重組人IL-2、基因重組人INF-γ(Sigma，美國(guó))，淋巴細(xì)胞分離液(南京凱基生物制品公司，中國(guó))，激發(fā)型CD28單抗(自行制備)，激發(fā)型CD3抗體(Becton Dickinson 公司，美國(guó))，CD4-FITC、CD8-FITC、CD56-PE(Beckmen Coulter，美國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG熒光抗體(Beckmen Coulter，美國(guó))，CCK-8試劑盒(dojindo，日本)；Annexin-V-FITC/PI 試劑盒(Pharmigen，美國(guó))。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)標(biāo)本BALB/c小鼠，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；穩(wěn)定分泌鼠抗人激發(fā)型CD28單抗的雜交瘤細(xì)胞株18G8(IgG2a，κ型)，購于上海中科院細(xì)胞所；轉(zhuǎn)人CD28基因的細(xì)胞株CD28T，購于上海中科院細(xì)胞庫；人惡性B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi，購于美國(guó)ATCC公司；乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1激發(fā)型CD28單抗的制備參照文獻(xiàn)[9]方法制備。采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法產(chǎn)生單克隆抗體，取8周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射Pristane 0.5 mL/只；于注射1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×107/只，同時(shí)另一側(cè)腹腔再注射Pristane 0.2 mL/只，并輕柔按摩小鼠腹部，使雜交瘤細(xì)胞分散于小鼠腹腔中。于7～10 d后收獲小鼠腹水，小鼠腹水陽性形成率約為85%，每只小鼠腹水收獲量約為2 mL，并離心取上清液。采用ProteinA免疫親和層析法純化腹水，得到抗體蛋白約為1.0 mg/mL腹水，并采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)，備用。

1.3.2激發(fā)型CD28單抗參與CIK誘導(dǎo)方法從志愿者抗凝全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC )，并接種于激發(fā)型鼠抗人CD3單抗包被24孔板，同時(shí)加入細(xì)胞因子，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為2組：對(duì)照組加anti-CD3+IL-2+IFN-γ，實(shí)驗(yàn)組加anti-CD3+anti-CD28+IL-2+IFN-γ，其中CD3單抗1 μg/mL、細(xì)胞因子IL-2 0.1萬IU/mL、激發(fā)型CD28單抗0.5 μg/mL、IFN-γ 100 ng/mL。于誘導(dǎo)7 d后收集的CIK細(xì)胞即為效應(yīng)細(xì)胞，一部分效應(yīng)細(xì)胞備用研究對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，另一部分效應(yīng)細(xì)胞分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組單克隆抗體CD4-FITC、CD8-FITC、CD56-PE(對(duì)照組標(biāo)記Ig G1-FITC、IgG1-PE)及帶有2種熒光的單克隆抗體CD4-FITC/CD25-PE、CD8-FITC/CD25-PE、CD4-FITC/FasL-PE、CD8-FITC/Fas L-PE(對(duì)照組標(biāo)記Ig G1-FITC、Ig G1-PE)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞上CD4+、CD8+、CD56+及CD4+CD25+、CD8+CD25+、CD4+FasL+、CD8+FasL+的表達(dá)情況。

1.3.3激發(fā)型CD28單抗參與的CIK對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞殺傷作用檢測(cè)參照文獻(xiàn)[10]方法，采用CCK-8法檢測(cè)。將上述實(shí)驗(yàn)制備的效應(yīng)細(xì)胞即激發(fā)的CIK細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7以5∶1，10∶1，20∶1的效靶比加入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(只加入靶細(xì)胞)與空白對(duì)照組(只加入培養(yǎng)基)，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后，吸棄CIK，并加入CCK-8，完全溶解后, 用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)490 nm處讀取吸光度值(OD值)，以確定最終確定效靶比，實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)置6個(gè)平行孔，并進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞殺傷率(%)=(CIK組OD值-陰性對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.4Annexin V/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照CCK-8確定的最終效靶比，將CIK與靶細(xì)胞接種入24孔板，培養(yǎng)72后，收集細(xì)胞，采用Annexin V/PI染色法對(duì)MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞進(jìn)行染色，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率及壞死率，每組設(shè)3個(gè)平行樣，并進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)　　果

2.1激發(fā)型CD28對(duì)CIK增殖能力及活化細(xì)胞模型分子表達(dá)的影響培養(yǎng)7 d后,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CIK的細(xì)胞總量分別為(8.1±2.7)×106/孔和(2.3±1.4)×106/孔，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.303，P=0.001)。采用流式細(xì)胞術(shù)單標(biāo)法分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組CIK細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD56+T細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，見表1；采用流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)法分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組CIK細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞、CD8+CD25+T細(xì)胞、CD4+FasL+T細(xì)胞、CD8+FasL+T細(xì)胞的比例均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，見表2。

表1　激發(fā)型CD28對(duì)CIK增殖能力的影響

表2　激發(fā)型CD28對(duì)CIK細(xì)胞表型特征的影響

2.2激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷作用CCK8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷率均高于對(duì)照組(P均<0.05)，且殺傷率隨效靶比升高，但效靶比為40∶1時(shí)，殺傷率上升已不明顯，所以綜合殺傷效果和經(jīng)濟(jì)因素考慮確定20∶1為最終效靶比，見表3；按CCK-8實(shí)驗(yàn)確定的20∶1的效靶比進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7的凋亡率及壞死率均高于對(duì)照組(P均<0.05)，見表4。

3　討　　論

表3　激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7殺傷作用

表4　激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7凋亡的影響

CIK是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后產(chǎn)生的一群異質(zhì)細(xì)胞，具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗癌活性及NK細(xì)胞非組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)限制性殺傷腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)[11-12]。目前，CIK已經(jīng)突破淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)、抗CD3單克隆抗體(mAb)激活的殺傷細(xì)胞(CD3AK)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)等擴(kuò)散速度慢、毒力低、來源難等局限，成為腫瘤免疫治療的首選方案[13-14]。CIK在健康人和腫瘤患者外周血中的數(shù)量較低，需在體外經(jīng)多重細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)后大量擴(kuò)增；在腫瘤患者中，CIK數(shù)量更低，需擴(kuò)增后再回輸才能達(dá)到抗腫瘤的目的[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，數(shù)量明顯增加，而且T細(xì)胞亞型的比例也發(fā)生改變：具有腫瘤殺傷活性的T細(xì)胞比例明顯升高，抑制性T細(xì)胞比例則明顯降低[16]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激發(fā)型CD28單抗能明顯促進(jìn)CIK細(xì)胞的體外增殖。CIK細(xì)胞中細(xì)胞表型的比例變化是評(píng)價(jià)CIK細(xì)胞抗腫瘤療效和質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究免疫熒光單標(biāo)法發(fā)現(xiàn)，激發(fā)型CD28單抗參與誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD56+T細(xì)胞均明顯升高，而CD4主要表達(dá)于輔助T細(xì)胞(T helper cells，Th)，CD8主要表達(dá)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)，CD56主要表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)，說明激發(fā)型CD28單抗能夠明顯提高Th、CTL、NK的比例，使經(jīng)誘導(dǎo)CIK殺傷活性增強(qiáng)。通過免疫熒光雙標(biāo)法發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組CIK細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞、CD8+CD25+T細(xì)胞、CD4+FasL+T細(xì)胞、CD8+FasL+T細(xì)胞的比例均明顯升高，CD25主要分布于活化的T細(xì)胞表面，是T 細(xì)胞活化的標(biāo)志，而FasL只表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞即CTL細(xì)胞，通過與靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)表面Fas結(jié)合，通過Fas觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)部的凋亡程序，使靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)發(fā)生程序性細(xì)胞死亡即凋亡或壞死。因此說明激發(fā)型CD28單抗能夠提高CIK對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。本研究還發(fā)現(xiàn)，CIK經(jīng)體外誘導(dǎo)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7均有殺傷作用，這與文獻(xiàn)[17-18]的研究結(jié)果一致；同時(shí)研究中還發(fā)現(xiàn)，激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)的CIK對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷率更高，且MDA-MB-231、MCF-7凋亡率及壞死率也明顯升高，說明激發(fā)型CD28單抗誘導(dǎo)增強(qiáng)了CIK的殺傷活性，這與本研究中激發(fā)型CD28單抗改變CIK細(xì)胞表型的變化相一致。本研究中也發(fā)現(xiàn)激發(fā)型CD28單抗明顯上調(diào)了CIK中FasL分子的表達(dá)，但具體乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7的凋亡率增加與FasL是否有關(guān)還需要進(jìn)一步對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白進(jìn)行研究。

綜上所述，CIK治療乳腺腫瘤具有廣闊的應(yīng)用前景，且激發(fā)型CD28單抗參與誘導(dǎo)的CIK能明顯提高CIK的增殖能力及上調(diào)具有腫瘤殺傷活性的T細(xì)胞比例，增強(qiáng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷能力，可能為乳腺癌的免疫治療提供新思路。

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Study on the killing effect to MDA-MB-231 and MCF-7 breast cancer cells of CIK induced by agonist monoclonal antibody against human CD28

ZHENG Xiaoran, BAI Jiming, LI Jianhui, WANG Xiang, QIAN Hao, WANG Xinjie, LI Jianhua

(The Second Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei, China)

Objective It is to observe the proliferation ability, cell phenotype characteristics and killing effect to human breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 of CIK induced by agonist monoclonal antibody against human CD28.Methods Mouse anti-human CD28 mAb was prepared and used to involve in inducing CIK, and the proliferation ability and cell phenotype characteristics of CIK were tested; the killing rate and apoptosis rate to breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 were detected by CCK-8 assay and flow cytometer.Results Agonist monoclonal antibody against human CD28 obviously promoted the CIK cells proliferation in vitro and increased the proportion of T cells with tumor killing activity.CCK8 testing found that, the killing rate of CIK induced by agonist monoclonal antibody against human CD28 to breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 were higher than control group (all P<0.05), and in a dose-dependent manner, and the effect-target of 20 to 1 was determined for the final effect; Flow cytometry showed that, the apoptosis rate and necrosis rate of breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 were increased with the addition of CIK involved by agonist monoclonal antibody against human CD28 in the induction (all P<0.05).Conclusion CIK involved by agonist monoclonal antibody against human CD28 in the induction can significantly improve the proliferation ability of CIK and the proportion of T cells with tumor killing activity, and enhance the ability to kill breast cancer cells, and may provide new ideas of immune therapy to breast cancer.

agonist monoclonal antibody against human CD28; cytokine-induced killer; breast cancer

鄭瀟然，女，研究生，研究方向?yàn)槿橄侔┥镏委煛?/p>

李建華,E-mail:lj_hua1963@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.27.010

R-33

A

1008-8849(2016)27-2995-04

2016-04-25