薛興陽，吳華振，付騰飛，藍永權，羅志明，周華平，趙　健，孟　江

(1.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095; 2.廣東省廣州市南沙中心醫(yī)院，廣東 廣州 511457；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

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魚腥草生物堿抑制人大細胞肺癌細胞生長研究

薛興陽1，吳華振1，付騰飛2，藍永權1，羅志明1，周華平1，趙健1，孟江3

(1.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095; 2.廣東省廣州市南沙中心醫(yī)院，廣東 廣州 511457；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

目的研究魚腥草生物堿對人大細胞肺癌細胞株H460生長的抑制作用。方法用20倍95%乙醇回流提取，大孔樹脂分離純化魚腥草生物堿；MTS實驗觀察魚腥草生物堿對H460細胞體外增殖的作用，計算IC50；觀察魚腥草生物堿對H460細胞形態(tài)及細胞核的影響，流式細胞儀檢測魚腥草生物堿抑制H460細胞周期及誘導H460凋亡的情況。結果魚腥草生物堿可抑制H460細胞增殖，IC50為130.17 μg/mL。魚腥草生物堿可致H460細胞萎縮、死亡、細胞核碎裂及出現(xiàn)凋亡小體，能使H460細胞周期阻滯于G0/G1期，誘導H460凋亡。結論魚腥草生物堿能抑制H460細胞的生長，具有誘導其發(fā)生凋亡的作用。

魚腥草生物堿；人大細胞肺癌；生長抑制；凋亡

近些年來，肺癌發(fā)病率呈升高趨勢，對我國人群健康構成了很大威脅。雖然肺癌治療新方法層出不窮，但天然植物藥在肺癌治療中的地位仍不容忽視。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)以魚腥草為主藥的參慈膠囊對肺癌有明顯抑制作用[1]，魚腥草黃酮提取物能抑制SiHa腫瘤細胞生長并誘導其凋亡[2]。Chen等[3]研究表明，魚腥草乙醇提取物可誘導肺腺癌A549細胞G0/G1期阻滯和Fas/CD95依賴的凋亡。另外相關研究證實，天然植物中的生物堿具有明顯的抗腫瘤活性，其通過作用于細胞周期、誘導凋亡以及逆轉耐藥等發(fā)揮抗腫瘤作用，開發(fā)前景廣闊[4]。魚腥草有效成分主要有揮發(fā)油、黃酮和生物堿等，而關于魚腥草的生物堿(Houttuynia cordata alkaloids, HCA)抗肺癌作用目前鮮有研究報道。本研究在前期對HCA提取以及純化工藝的基礎上[5-6]，選取大細胞肺癌細胞株H460為研究對象，通過系列實驗研究HCA對H460肺癌細胞的體外增殖、細胞形態(tài)的影響，通過Hoechst染色、細胞周期檢測及Annexin V/PI雙染對HCA抑制細胞周期及誘導凋亡作用進行研究，以期明確魚腥草生物堿抗肺癌藥效。

1　研究資料

1.1材料魚腥草藥材購于廣州市清平藥材市場，經廣東藥科大學劉基柱教授鑒定為三白草科蕺菜。人大細胞肺癌細胞H460保存于廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。鹽酸小檗堿為實驗室自制(純度>98%)，HPD-100型大孔吸附樹脂購自河北滄州寶恩化工有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，MTS試劑購自Promega公司，細胞凋亡試劑盒購于聯(lián)科生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1HCA組分的提取及工作液的配置[5]取干魚腥草粉制成粗粉，加20倍量95%乙醇溶液回流提取，每次2 h，共2次，收集濾液。旋蒸回收乙醇，加0.5% HCl溶液調pH 2～3，過濾，濾液加1%NaOH溶液，使pH為5～7，靜置離心，除去沉淀，繼續(xù)加1%NaOH溶液使pH為9～11得HCA，減壓濃縮，得到浸膏。取適量HCA浸膏，用完全培養(yǎng)基配成1 mg/mL的工作液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，置于4 ℃保存。

1.2.2MTS實驗取對數(shù)生長期的H460細胞，用PBS洗滌2次，用胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640，通過計數(shù)調整細胞濃度為5×104個/mL，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調整HCA的濃度分別為0，5，10，20，40，80，160，320 μg/mL，每個孔加入100 μL藥液，每個濃度做5個復孔，置于培養(yǎng)箱中，48 h后棄上清，用PBS輕微洗滌1遍，加入100 μL培養(yǎng)基，避光加入MTS試劑10 μL/孔，37 ℃孵育4 h，使用酶標儀檢測490 nm波長處每個孔的光密度A490(重復3次)，計算每個藥物濃度的平均光密度值A490。通過下面公式計算相對抑制率，然后通過IC50計算器軟件計算各孔細胞的IC50。相對抑制率(%)=(1-試驗孔A490 /對照孔A490)×100%。

1.2.3細胞形態(tài)觀察根據(jù)MTS實驗求得的IC50值，分別設置0，1/2 IC50，IC50，2 IC504個濃度值加藥處理H460細胞，5%CO2孵育箱培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期接種H460細胞于6孔板內培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加藥(0，1/2 IC50，IC50)處理細胞，48 h后，消化細胞，離心，去上清，加1 mL PBS室溫重懸細胞，轉移細胞懸液到3 mL無水乙醇(-20 ℃)中，靜置2 h，離心，去乙醇，輕彈管壁，室溫加入2～5 mL PBS，水化15 min，離心去上清，加入1 mL試劑A，Vortex混勻5～10 s，室溫孵育30 min，上機檢測。

1.2.5Hoechst 33258染色取潔凈蓋玻片，置于70%乙醇中浸泡5 min，超凈臺內吹干，用細胞培養(yǎng)液洗滌1遍，將蓋玻片置于6孔板內，種入細胞培養(yǎng)。細胞密度約為70%時，加藥(加藥濃度取細胞IC50值附近，培養(yǎng)48 h)，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定10 min。然后去除固定液，用PBS洗2遍，每次3 min。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。棄染色液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液體，滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，避免氣泡，置于熒光顯微鏡下觀察。在350 nm左右的紫外光激發(fā)下，可檢測到呈藍色的細胞核，正常細胞經染色后細胞核呈圓形或類圓形，淺藍色，并可觀察到藍色顆粒，而對于發(fā)生凋亡的細胞，會形成一些大小不等，內含胞質、細胞器以及核碎片的凋亡小體(呈亮藍色)。

1.2.6Annexin V/PI雙染檢測凋亡接種對數(shù)期的H460細胞于6孔板中，每孔接種約2 mL，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含HCA(0，1/2 IC50，IC50)的新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用胰酶消化細胞，待細胞變圓加入培養(yǎng)基終止消化，收集(1～5)×105個細胞，1 000 r/min離心5 min，用預冷的PBS洗滌細胞2次，離心去PBS，加入500 μL Binding Buffer，重懸細胞，然后加入2.5 μL Annexin V和5 μL Propidium iodide，室溫避光孵育5 min，上機檢測。

2　結　　果

2.1HCA對H460細胞增殖的抑制作用使用SigmaPlot 12.5繪制柱狀圖，顯示HCA對H460細胞具有明顯的細胞毒作用，且抑制肺癌細胞增殖呈濃度依賴性，見圖1。使用IC50軟件計算得H460的IC50為130.17 μg/mL。

圖1　HCA對H460細胞體外增殖的抑制作用

2.2形態(tài)學觀察未加藥組細胞形態(tài)規(guī)則，鏡下明亮清晰，貼壁較為牢固，邊緣伸展充分，偶見少量空泡。加藥之后，低濃度下，細胞體積明顯變小，細胞開始萎縮，偽足開始消失，隨著藥物濃度逐漸增大，細胞形態(tài)進一步萎縮變小，部分細胞脫落死亡，細胞數(shù)量減少，同時可見細胞折光性降低，固縮黑斑數(shù)量增多。見圖2。

2.3HCA對H460細胞周期的影響H460細胞經HCA誘導后G0/G1期比例均有不同程度的升高，S期的細胞比例降低，G2/M期細胞比例無明顯變化規(guī)律。流式細胞儀檢測細胞周期變化見圖3和表1。

2.4Hoechst 33258染色觀察HCA對H460細胞核的影響未加HCA處理的細胞經染色后細胞核呈圓形或類圓形，淺藍色，并可觀察到藍色顆粒；經IC50濃度HCA處理48 h后，可以觀察到細胞核碎片以及呈致密濃染的凋亡小體。見圖4。

2.5流式細胞儀Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡情況Annexin V與PI匹配使用時，PI被排除在活細胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)之外，晚期凋亡和壞死細胞同時被FITC和PI染色呈現(xiàn)雙陽性(Annexin V+/PI+)。以FITC和PI熒光做雙參數(shù)點圖，分成4個象限，左下象限為活細胞，為Annexin V-/PI-；右上象限是凋亡晚期細胞或壞死細胞，為Annexin V+/PI+；而右下象限為早期凋亡細胞，顯現(xiàn)Annexin V+/PI-。結果顯示隨著HCA濃度升高，右下象限(早期凋亡細胞)和右上象限(晚期凋亡和壞死細胞)的細胞數(shù)呈增長趨勢，見圖5。

圖2　HCA對H460形態(tài)的影響(×100)

圖3　不同濃度HCA處理H460細胞后細胞周期分布圖

HCA濃度G0/G1期S期G2/M期0μg/mL60.92±1.5634.60±2.374.48±0.8370μg/mL64.18±2.85①29.05±1.59①5.97±0.45130μg/mL73.38±1.64①②20.75±1.31①②5.87±1.04

注：①與0 μg/mL 比較，P<0.05；②與70 μg/mL比較，P<0.05。

圖4　H460細胞處理48 h后Hoechst染色表現(xiàn)

3　討　　論

從天然植物中尋找抗腫瘤活性物質是當今抗腫瘤藥物研究的熱點，而生物堿類成分由于高效低毒、特異性較強等成為研究重點，其中的紫杉醇、喜樹堿以及長春堿類化合物作為抗腫瘤藥物已廣泛應用于臨床。有報道稱從魚腥草中提取的生物堿馬兜鈴酸內酰胺B、胡椒內酰胺A、馬兜鈴酸內酰胺A、頭花千金藤二酮B在體外對5種人腫瘤細胞株(A-549、SK-OV-3、SK-MEL-2、XF-498、HCT-15)具有一定的細胞毒性作用[7]，但未進一步研究其機制。本研究初步探討了HCA抑制人大細胞肺癌細胞株H460細胞增殖及誘導其細胞凋亡的作用。

圖5　Annexin V/PI雙染觀察HCA誘導H460凋亡散點圖

本研究發(fā)現(xiàn)，HCA對H460細胞的體外增殖具有明顯抑制作用，且有濃度依賴性；檢測HCA對細胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，經HCA誘導后H460細胞的G0/G1期比例升高，S期細胞比例降低，說明發(fā)生了G0/G1期阻滯，提示HCA對細胞產生的抑制作用為阻止增殖中的細胞進入S期，使得細胞在G0/G1期堆積。這和目前許多抗腫瘤藥物通過干擾細胞周期的正常進行來發(fā)揮其抗腫瘤作用結果一致[8]。

Hoechst33258是一類具有膜透性的DNA熒光染料，可以與DNA雙鏈中的小溝結合。本研究發(fā)現(xiàn)HCA處理后的H460細胞經Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下可以觀察到亮藍色的熒光，說明HCA的處理使細胞產生了凋亡小體。由于Hoechst33258染色結果一般只是證明細胞凋亡的佐證，故進一步設計流式細胞儀AnnexinV/PI雙染實驗來驗證HCA的誘導凋亡作用，結果發(fā)現(xiàn)，經HCA處理后，H460細胞出現(xiàn)了不同程度的凋亡，隨著HCA劑量增加，凋亡率也逐漸升高，提示HCA可通過啟動凋亡途徑來發(fā)揮對細胞的抑制作用。而細胞凋亡是在某些生理和病理情況下，細胞為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主性的有序的死亡[9]。目前研究表明，許多抗腫瘤藥物或者化療藥物是通過誘導腫瘤細胞的凋亡從而阻止腫瘤病情發(fā)展的[10-11]。

綜上所述，HCA對體外培養(yǎng)的大細胞肺癌細胞H460的增殖有抑制作用，其可能是通過抑制細胞周期及誘導細胞凋亡實現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)可以為HCA作為治療肺癌藥物的開發(fā)提供借鑒。但本研究為體外實驗，仍需進一步體內實驗研究證實。

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Study on antitumor activity of houttuynia cordata alkaloids on human large cell lung cancer

XUE Xingyang1, WU Huazhen1, FU Tengfei2, LAN Yongquan1, LUO Zhiming1, ZHOU Huaping1, ZHAO Jian1, MENG Jiang3

(1.Cancer Center of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510095, Guangdong,China; 2.Nansha Central Hospital of Guangzhou, Guangzhou 511457, Guangdong, China; 3.TCM School of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China)

Objective It is to observe the growth inhibition effect of Houttuynia cordata alkaloids on human large cell lung cancer cell line H460.Methods Houttuynia cordata alkaloids been reflux extracted by 20 times of 95% ethanol, separated and purificated by macroporous resin.The effects of Houttuynia cordata alkaloids on proliferation of H460 cells in vitro was observed by MTS experiments, and IC50was calculated.The effects of Houttuynia cordata alkaloids on H460 cell morphology and nuclear were observed under microscope, and the H460 cell cycle and apoptosis induced by Houttuynia cordata cordata alkaloids were detected by flow cytometer.Results The proliferation of H460 cells were inhibited by Houttuynia cordata alkaloids in vitro, IC50was 130.17μg /mL.The Houttuynia cordata alkaloids could induced H460 cells atrophy, death, occurring apoptotic bodies and nuclear fragmentation, and made cell cycle arrest in G0/G1phase, and induced H460 apoptosis.Conclusion Houttuynia cordata alkaloid can inhibit H460 growth and with the role of induce apoptosis.

Houttuynia cordata alkaloids; large cell lung cancer; growth inhibition; apoptosis

薛興陽，男，副主任醫(yī)師，博士，碩士研究生導師，主要從事肺癌臨床及基礎研究。

孟江，E-mail:jiangmeng666@126.com

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20141A011097)；廣州市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研課題(2010A32)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.27.003

R-33

A

1008-8849(2016)27-2972-04

2016-04-10