杜　昆　楊繼宏　黃淑紅.華北石油管理局總醫(yī)院泌尿外科，河北任丘　06550；.山東大學醫(yī)學院，山東濟南　500

叉頭框C2蛋白在腎細胞癌組織中的表達及臨床意義

杜昆1楊繼宏1黃淑紅2
1.華北石油管理局總醫(yī)院泌尿外科，河北任丘062550；2.山東大學醫(yī)學院，山東濟南250012

目的 研究叉頭框C2蛋白 （FOXC2）在腎細胞癌組織及癌旁組織中的表達差異及臨床意義。方法 收集2013年3月～2016年1月華北石油管理局總醫(yī)院40例腎細胞癌患者術后腎細胞癌組織及癌旁組織，采用qRTPCR、免疫組織化學染色及Western blot方法檢測各組織中FOXC2的表達水平，分析FOXC2的表達與腎細胞癌臨床病理的關系。 結果 qRT-PCR結果顯示，F(xiàn)OXC2 mRNA在腎細胞癌組織中表達較癌旁組織明顯降低 （P＜0.05）；免疫組化結果和Western blot結果顯示，腎細胞癌組織中FOXC2蛋白表達較癌旁組織明顯下調(diào) （P＜0.05）。FOXC2在腎細胞癌組織中的低表達與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、有無包膜、病理分期無關（P＞0.05），但與腎細胞癌的病理分型有關（P＜0.05）。結論 FOXC2在腎細胞癌組織中異常低表達，可能與腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展相關，可以作為腎細胞癌潛在的分子靶點進行研究。

腎細胞癌；叉頭框C2；基因表達；表達下調(diào)

［Abstract］Objective To analyze the difference of the expression of FOXC2 between renal cell carcinoma and its adjacent tissues and its clinical significance.Methods Forty renal cell carcinoma tissues and adjacent tissues of patients with renal cell carcinoma from May 2013 to January 2015 from in General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau were collected.The expression of FOXC2 mRNA was detected by qRT-PCR，F(xiàn)OXC2 protein was detected by immunohistochemistry and Western blot in renal cell carcinoma tissues and adjacent tissues.The relationship between the expression of FOXC2 and clinical pathology of patients with renal cell carcinoma were analyzed.Results Results of qRT-PCR showed that，the expression of FOXC2 mRNA in renal cell carcinoma tissues was significantly lower than that of the adjacent tissues（P＜0.05）；results of immunohistochemistry and Western blot showed that，the expression of FOXC2 protein was down-regulated，compared with that of the adjacent tissues（P＜0.05）.The low expression of FOXC2 in renal cell carcinoma tissue was not related to gender，age，tumor size，pathological stages and envelope（P＞0.05），but related to pathological types（P＜0.05）.Conclusion The abnormal low expression of FOXC2 may be related to renal cell carcinoma，and can be used as a potential molecular target for renal cell carcinoma.

［Key words］Renal cell carcinoma；FOXC2；Gene expression；Down-regulated

腎細胞癌（Renal cell caecinoma，RCC）是成年腎臟疾病中最常見的惡性腫瘤，近年來國內(nèi)外發(fā)病率在不斷上升［1］。研究發(fā)現(xiàn)叉頭框C2（Forkhead box C2，F(xiàn)OXC2）蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。研究證明FOXC2在乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用［2］。但目前尚未有FOXC2蛋白與腎細胞癌的相關研究，本文通過分析腎細胞癌中FOXC2的表達，進一步探討FOXC2與腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲是否相關。

1　對象與方法

1.1對象

1.1.1組織標本組織標本均來源于 2013年3月～2016年1月華北石油管理局總醫(yī)院住院的手術患者，經(jīng)術后病理檢查診斷為腎細胞癌，收集腎細胞癌標本40例及其癌旁組織40例作為對照。所有病例術前均未進行放、化療，均有詳細的臨床資料及手術記錄。標本用10%中性甲醛進行固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，保存切片。

1.1.2主要試劑鼠抗人FOXC2單克隆抗體購自Abcam公司；鼠抗人β-tubulin單克隆抗體購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以各組cDNA為模板，進行qRT-PCR。FOXC2上游引物：5'-GCAGTTACTGGACCCTGGAC-3'，下游引物：5'-CTTCTTCTCGGCCTCCTTGG-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，下游引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。反應體系：模板2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，引物0.8 μL+0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸30 s，72℃后延伸7 min，共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt分析法進行數(shù)據(jù)分析。實驗獨立重復3次。

1.2.2免疫組織化學染色所有石蠟標本60℃烘烤2 h，采用EnVision二步法進行免疫組化染色，染色步驟按試劑盒說明書進行。以PBS作為陰性對照，同時設空白對照，已知陽性片作陽性對照。

1.2.3Western blot檢測取新鮮組織提取蛋白，BCA法測濃度。取50 μg蛋白進行電泳，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗（1∶1000），4℃孵育過夜，加二抗（1∶5000），孵育1 h，ECL化學發(fā)光法顯色。采用Image J分析圖像，以FOXC2/β-tubulin灰度比值表示FOXC2蛋白相對表達水平。

1.2.4結果半定量分析在光學顯微鏡40×10視野下，每個樣本選取5個視野，采用Barnes法統(tǒng)計分析，按以下標準進行計分：顯色細胞的比例：0（0%）；1（1%～10%）；2（＞10%～50%）；3（＞50%～80%）；4（＞80%）。其中0表示為陰性；1～3為弱陽性；4為強陽性。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1FOXC2 mRNA相對表達量的檢測

qRT-PCR結果顯示：FOXC2在腎細胞癌中相對表達量為（0.0974±0.0316），癌旁組織中相對表達量為（0.3582±0.0128），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　FOXC2 mRNA在腎細胞癌及癌旁組織中的相對表達量

2.2FOXC2蛋白的免疫組化檢測

免疫組化染色結果顯示：FOXC2蛋白在腎細胞癌細胞中陽性表達率為70%（28/40），不同的病理分型中陽性表達率不同，在嫌色性腎細胞癌和Bellini集合管癌組織中陽性表達率為100%，而在腎母細胞瘤中僅為20%，見表1。腎腫瘤細胞著色較淺（圖2A～G），而癌旁組織細胞著色較深（圖2H～I），提示FOXC2在腎細胞癌中表達下調(diào)。

圖2　FOXC2在腎細胞癌和癌旁組織中的表達（免疫組織化，100×）

表1　不同腎臟組織中FOXC2蛋白的表達情況

2.3Western blot檢測FOXC2在腎細胞癌及癌旁組織中的表達

每種病理亞型選取2例樣本對FOXC2的蛋白表達進行Western blot分析，結果顯示，F(xiàn)OXC2蛋白在癌旁組織中表達較高（0.5724±0.0144），在腎細胞癌組織中表達較低（0.2300±0.0671），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與免疫組化結果一致，見圖3。提示FOXC2在腎細胞癌組織中表達下調(diào)。

圖3　FOXC2在腎細胞癌及癌旁組織中表達的Western blot分析

2.4FOXC2的表達水平與腎細胞癌臨床病理參數(shù)的關系

40例腎細胞癌腫瘤組織中FOXC2表達下調(diào)率為50%（20/40）。經(jīng)統(tǒng)計學分析，F(xiàn)OXC2的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、有無包膜無關（P＞0.05），但與病理分型有關（P＜0.05）。見表2。

3　討論

FOXC2屬于FOXC亞族，是forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員之一。FOXC2參與調(diào)控血管、淋巴管的生成［3］，調(diào)控骨骼和主動脈弓的發(fā)育，與多種代謝性疾病密切相關［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2與腫瘤的浸潤和遠處轉(zhuǎn)移密切相關，在卵巢癌和膠質(zhì)母細胞瘤中過表達的FOXC2促進了卵巢癌細胞的侵襲［5］、膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖和侵襲［6］；FOXC2的陽性表達與子宮頸癌細胞增殖和侵襲能力有關［7-8］；FOXC2的表達還與鼻咽癌、原發(fā)性肝細胞癌、結直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關［9-12］。

目前普遍認為，F(xiàn)OXC2主要是通過參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程及腫瘤血管的生成過程，調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移［13］。FOXC2可以促進腫瘤細胞發(fā)生EMT，對EMT起著關鍵的調(diào)節(jié)作用［14-15］，在胃癌中，F(xiàn)OXC2通過促進EMT的發(fā)生影響其發(fā)展及轉(zhuǎn)移［16］。研究表明，F(xiàn)OXC2的突變導致血管內(nèi)皮生長因子受體-A（vascular endotheliar growth factor-A，VEGF-A）表達下調(diào)［17］，VEGR-A的表達下調(diào)通過對Raf/MEK/Erk、PI3K/Akt等信號通路的調(diào)控限制腫瘤的血管生成，引起血管內(nèi)皮細胞凋亡；在結直腸癌中，F(xiàn)OXC2基因是通過激活MAPK和Akt途徑促進細胞增殖［12］。FOXC2可以通過調(diào)節(jié)血小板衍生生長因子-β的水平來調(diào)控PDGF信號通路，進而調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成及生存［17］。除此之外，F(xiàn)OXC2還可以調(diào)控腫瘤相關成纖維細胞的數(shù)量來影響腫瘤血管的生成。有研究表明，腎缺血/再灌注損傷后的低氧條件能誘導FOXC2表達上調(diào)，在腫瘤中能誘導血管生成［18］。已知75%～85%的腎細胞癌是高度血管化的腫瘤，腎細胞癌發(fā)展轉(zhuǎn)移與很多促進血管生成的生長因子受體過度表達或活化有很大的關系［19］。但目前尚無FOXC2蛋白在腎細胞癌中發(fā)揮作用的相關報道。

表2　FOXC2的表達與腎細胞癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系

本研究表明FOXC2在腎細胞癌腫瘤中陽性表達，與癌旁組織相比表達明顯下調(diào)（P＜0.05）；FOXC2蛋白的下調(diào)表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期及有無包膜無關，但與病理分型相關（P＜0.05）。因此，F(xiàn)OXC2蛋白在腎細胞癌中表達下調(diào)，可能參與了腎細胞瘤的發(fā)生發(fā)展。大多數(shù)研究表明，F(xiàn)OXC2在其他腫瘤中大多為上調(diào)表達，但在腎細胞癌中出現(xiàn)了下調(diào)表達的情況。因此，F(xiàn)OXC2蛋白在腎細胞癌中可能除了以上的機制外還存在新的調(diào)控機制，還需要繼續(xù)深入地研究。

綜上所述，腎細胞癌腫瘤中FOXC2基因出現(xiàn)異常低表達的情況，F(xiàn)OXC2基因可能參與了腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展，為腎細胞癌的分子診療提供了新的思路。

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Expression of FOXC2 and its clinical significance in renal cell carcinoma tissues

DU Kun1YANG Jihong1HUANG Shuhong2
1.Department of Urology Surgery，General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau，Hebei Province，Renqiu062550，China；2.Medical Academy of Shandong University，Shandong Province，Ji'nan250012，China

R737.11

A

1673-7210（2016）08（b）-0118-04

2016-05-04本文編輯：任念）