許尚虞　楊　濤　林中嘯　蔡　銘　盛漢松　張　弩溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江溫州　325027

Gli1在髓母細胞瘤中的表達及其靶向抑制的研究

許尚虞楊濤林中嘯蔡銘盛漢松張弩
溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江溫州325027

目的 研究Gli1在髓母細胞瘤（MB）中的表達和作用。方法 用不同濃度（正常對照組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組）的Gli1特異性抑制劑GANT61作用Daoy細胞，采用細胞增殖法檢測Daoy細胞在GANT61作用下的增殖活性的變化；Real-time PCR法和Western blot法分別檢測不同組Daoy細胞中Gli1和Bcl-2 mRNA表達量和蛋白表達量的差異。結(jié)果 GANT61作用細胞后，細胞間隙增大，異常突起增多，細胞增殖活性明顯下降，與對照組相比，GANT61作用組的Daoy細胞增殖數(shù)顯著降低（P＜0.05），并且隨著濃度的增加，增殖數(shù)顯著降低（P＜0.05），提示具有濃度依賴性；不同濃度GANT61組的Gli1和Bcl-2 mRNA表達量均較對照組明顯下降（P＜0.05），下降程度隨著GNAT61濃度的增加而增加（P＜0.05）；不同濃度GANT61組的Gli1和Bcl-2蛋白表達水平較對照組明顯下降（P＜0.05），下降程度隨著GANT61濃度的增加而增加（P＜0.05）。結(jié)論GANT61能通過抑制Gli1的表達，進而下調(diào)下游靶基因Bcl-2的表達，從而明顯抑制MB細胞的增殖活性，達到促進MB細胞凋亡的作用。

髓母細胞瘤；GANT61；Gli1；Bcl-2蛋白；凋亡

［Abstract］Objective To investigate the expression and potential effect of Gli1 in medulloblastoma（MB）cell.Methods Daoy cells were grouped according to the concentration，the control group，which was stimulated by culture medium；three GANT61 stimulated groups：10 μmol/L group，20 μmol/L group and 40 μmol/L group，which were stimulated by GANT61，a specific antagonist of Gli1.The inhibitory effect of GANT61 on cell proliferation was determined by cell proliferation bioassay.The expression of Gli1 and Bcl-2 were detected by Real-time PCR and Western blot.Results After stimulated by GANT61，there were obvious pathologic changes in Daoy cells such as the increased cell gap and the abnormal cell processes.Compared with the control group，the cell proliferation activity in the GANT61 stimulated groups was suppressed by GANT61（P＜0.05）.Moreover，the cell proliferation activity was suppressed by GANT61 in a concentration-dependent manner（P＜0.05）.The expressions of Gli1 and Bcl-2 mRNA in the GANT61 stimulated groups were significantly decreased when compared with the control group（P＜0.05），and the expression decreased with a concentration-dependent manner（P＜0.05）.The expressions of Gli1 and Bcl-2 protein in the GANT61 stimulated groups were also suppressed by GANT61（P＜0.05），the inhibitory effects were increased with the increasing GANT61 concentration（P＜0.05）.Conclusion GANT61 can suppress the MB cells proliferation and promote apoptosis，which results from the inhibitory effect on Gli1 and its downstream target gene Bcl-2.

［Key words］Medulloblastoma；GANT61；Gli1；Bcl-2；Apoptosis

髓母細胞瘤（medulloblastoma，MB）是一種兒童較為常見的胚胎源性腫瘤，目前多項研究表明MB的形成和發(fā)展與Sonic hedgehog（SHH）信號通路的異常激活有密切關(guān)系。作為SHH信號通路下游中Gli1轉(zhuǎn)錄因子的抑制劑，GANT61能夠結(jié)合Gli1的DNA，通過抑制Gli1鋅指蛋白活性，進而對Gli1下游中的多種基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，達到抑制MB細胞的增殖和促進MB細胞凋亡的作用。本研究使用GANT61作用細胞，觀察細胞形態(tài)的變化，RT-PCR法和Western blot法檢測Doay細胞中Gli1和Bcl-2 mRNA表達量及蛋白表達水平的差異，探討髓母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中Gli1的表達及其靶向抑制劑的作用及意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系人髓母細胞株Daoy細胞，購自American Type Culture Collection。

1.1.2主要試劑GANT61（英國Abcam公司），1640培養(yǎng)基 （美國Gibco公司），RT-PCR引物 （日本Takara公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT（日本Takara公司），RT-PCR試劑盒SYBR?RPremix EX TaqTM（日本Takara公司），Gli1兔多克隆抗體 （英國 Abcam公司），Bcl-2鼠單克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.1.3儀器及設備超凈工作臺（安泰空氣技術(shù)公司），恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱 （美國Thermo Forma公司），三目倒置生物顯微鏡 （美國Thermo Forma公司），NanoDrop2000超微量分光光度計（常州中捷公司），CFX96 touch real-time PCR檢測系統(tǒng) （美國Thermo scientific公司），基因擴增儀（北京乾明公司），自動酶標儀（美國Bio-rad公司）。

1.2方法

1.2.1Daoy細胞培養(yǎng)將細胞置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用含10%FBS、1%雙抗的1640培養(yǎng)基。根據(jù)細胞的生長情況、培養(yǎng)基顏色及酸堿度進行換液，細胞生長到70%～80%時進行1∶2或者1∶4傳代培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組細胞在常氧條件下培養(yǎng)24 h后按進行分組。正常對照組：培養(yǎng)液中加0.1%DMSO，為使實驗條件一致，保持各組的DMSO終濃度為0.1%；10、20、40 μmol/L GANT61組：分別加入10、20、40 μmol/L GANT61。

1.2.3細胞增殖法檢測細胞增殖數(shù)、細胞形態(tài)取對數(shù)生長期的Daoy細胞，制成細胞懸液，在6孔板內(nèi)分別予每孔1000個細胞密度接種，培養(yǎng)24 h后按分組加入不同濃度藥物繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后結(jié)晶紫染色于倒置顯微鏡下觀察，拍照并計數(shù)每個視野的細胞增殖數(shù)，計數(shù)5個視野取平均值。

1.2.4Real-time PCR檢測細胞Gli1和Bcl-2 mRNA表達Trizol法提取總RNA，用NanoDrop2000測量RNA濃度，行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系見說明書。引物設計見表1。反應條件：37℃30 min，75℃10 min，4℃冷卻，共1個循環(huán)。將引物行PCR反應，反應體系總量20 μL：cDNA模板2.0 μL，上下引物各0.4 μL，2×Taq PCR Master MIX 10 μL，最后加入雙蒸水補足至20 μL。反應條件：97℃15 s；95℃ 5 s，65℃30 s，72℃1 min，40個循環(huán)；72℃10 min。采用2-ΔΔCT方法計算目的基因mRNA的相對表達量，△△CT計算公式：△△CT=（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）實驗組-（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）對照組。

表1　目的基因和內(nèi)參引物序列

1.2.5Western Blot檢測Gli1和Bcl-2蛋白表達細胞用4℃PBS洗2次，在4℃裂解30 min，離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，用10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)到NC膜上，分別加入1∶1000 Gli1、Bcl-2單抗 2 h后用PBS和 TBST洗各2次，1∶1000辣根過氧化物酶標記的二抗IgG孵育1 h，TBST洗 2次，將膜置于 ChemiDocTMMp Imaging System內(nèi)操作Image Lab 4.1軟件自動曝光。使用Quantity one 4.6.2分析軟件分析圖片，讀取每個條帶灰度值，并計算。

1.3統(tǒng)計學方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1髓母細胞瘤Daoy細胞增殖形態(tài)觀察

顯微鏡下示正常對照組中，Daoy細胞貼壁后呈片狀聚集增殖，形態(tài)規(guī)則，基本呈球形，細胞間隙緊密（圖1a）。Daoy細胞在GANT61作用后，細胞增殖數(shù)目減少，異常突起增多（箭頭所示），隨著GANT61濃度升高，細胞增殖數(shù)愈發(fā)減少，甚至少于接種細胞數(shù)，間隙不斷增大（圖1b～d）。

圖1　顯微鏡下正常Daoy細胞和GANT61作用后細胞增殖形態(tài)觀察（40×）

各組細胞增殖數(shù)比較顯示，GANT61能夠抑制Daoy細胞的增殖（P＜0.05），并且隨著GANT61濃度增加，細胞增殖數(shù)較前一濃度組下降（P＜0.05），提示具有濃度依賴性（圖2）。

圖2　不同濃度GANT61對Daoy細胞增殖數(shù)的影響（n=3）

2.2各組Gli1和Bcl-2 mRNA表達情況

本實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度GANT61組Gli1和Bcl-2 mRNA表達明顯低于正常對照組（P＜0.05），GANT61能夠顯著抑制Gli1和Bcl-2 mRNA表達，且具有明顯的濃度依賴性（P＜0.05）。見圖3、表1。

圖3　Real-time PCR檢測Daoy細胞內(nèi)Gli1和Bcl-2 mRNA表達

表1　不同濃度GANT61作用下Daoy細胞內(nèi)Gli1和Bcl-2 mRNA表達情況（x±s，n=3）

2.3各組Gli1和Bcl-2蛋白表達情況

本實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度GANT61組Gli1和Bcl-2蛋白表達量明顯低于正常對照組（P＜0.05），且具有明顯的濃度依賴性（P＜0.05）。見圖4、表2。

圖4　GANT61作用下Daoy細胞內(nèi)Gli1和Bcl-2蛋白表達水平

表2　GANT61作用下Daoy細胞內(nèi)Gli1和Bcl-2蛋白表達情況（x±s，n=3）

3　討論

MB是一種兒童較為常見的胚胎源性腫瘤，目前臨床上的治療方法主要是手術(shù)為主放化療為輔，但是治療效果仍然不夠令人滿意［1-2］。目前多項研究表明，MB的形成和發(fā)展與SHH信號通路的異常激活有密切關(guān)系［3-4］。在MB中，由于存在Gli1的高表達，可導致相應的Bcl-2啟動子依賴因子活躍，從而促使了Bcl-2高表達，而高表達的Bcl-2能通過限制細胞色素C、改變線粒體膜通透性等方式來限制Caspase的活化，達到促進細胞增殖、對抗凋亡的作用［5-6］。

GANT61作為SHH信號通路下游中Gli轉(zhuǎn)錄因子的抑制劑，它能夠結(jié)合Gli1的DNA，抑制Gli1鋅指蛋白活性，拮抗Gli1等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性［7］，從而對Gli1下游中包括Bcl-2、Cyclin D1和Ptched1等在內(nèi)的多種基因進行轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控［8-9］，達到阻斷SHH通路信號和促進MB細胞凋亡的作用。在SHH通路中，Gli1存在于細胞核和細胞漿中，是通路中的轉(zhuǎn)錄激動因子。研究表明，人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中廣泛存在Gli1的高度活化，當Gli1異?；罨瘯r，常與腫瘤的增殖分化、細胞凋亡、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移以及預后不良密切相關(guān)［10-11］。目前研究認為，Gli1的持續(xù)異常激活是腫瘤細胞增殖生長的重要條件，能促使下游目的基因的持續(xù)激活而導致腫瘤，如MB、基底細胞癌、橫紋肌肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等的形成［12-14］。本實驗結(jié)果也證實GANT61能夠抑制Doay細胞Gli1 mRNA和蛋白的表達，抑制Doay細胞的增殖，同時具有濃度依賴性。

細胞凋亡的發(fā)生受到細胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，這些凋亡調(diào)節(jié)蛋白分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類，細胞凋亡的發(fā)生是這兩類相互拮抗的蛋白之間平衡喪失的結(jié)果［15-16］。Bcl-2基因是位于Gli1下游的一種抑制細胞凋亡的原癌基因，其轉(zhuǎn)錄表達受上游的Gli1調(diào)控，是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中較為關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子［17-18］。根據(jù)Bcl蛋白家族功能和結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為抑制細胞凋亡和促進細胞凋亡兩大類蛋白。Bcl-2是抗凋亡的典型代表，為線粒體膜的整合蛋白，主要存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上［19］，表達水平較高時，其能夠通過穩(wěn)定線粒體膜阻止細胞色素C的釋放，限制Caspase的活化，從而對線粒體凋亡途徑起負調(diào)控作用［20］。在本實驗中，GANT61抑制劑作用于MB，能引起B(yǎng)cl-2 mRNA和蛋白表達水平明顯下降，促進MB細胞的凋亡。

綜上所述，本研究細胞增殖實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)GANT61能夠明顯抑制MB細胞增殖生長，降低Gli1和Bcl-2基因及蛋白表達。推斷在MB中，GANT61作為SHH通路中Gli1的特異性抑制劑，可拮抗Gli1的轉(zhuǎn)錄表達，抑制下游Bcl-2基因表達，下調(diào)Bcl-2蛋白，從而促使MB細胞凋亡。

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Expression of Gli1 in medulloblastoma and its targeted inhibition

XU ShangyuYANG TaoLIN ZhongxiaoCAI MingSHENG HansongZHANG Nu
Department of Neurosurgery，the Second Affiliated Hospital&Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang Province，Wenzhou325027，China

R739.4

A

1674-4721（2016）08（b）-0008-04

2016-05-12本文編輯：程銘）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012RCA043）。

許尚虞（1981.12-），男，碩士；研究方向：神經(jīng)腫瘤、腦血管病、重型顱腦損傷診治。

張弩（1966.10-），男，博士，主任醫(yī)師，溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院神經(jīng)外科主任；研究方向：神經(jīng)腫瘤、腦血管病、重型顱腦損傷診治。