韓光，李璐，趙平

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

·論著·

高壓氧誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠自噬的作用

韓光，李璐，趙平

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

目的探討高壓氧能否誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生抗神經(jīng)病理性疼痛作用，從一個(gè)全新的角度驗(yàn)證高壓氧鎮(zhèn)痛的有效性。方法選取60只雄性SD大鼠，隨機(jī)均分為4組：對(duì)照組（C組）、假手術(shù)組（S組）、坐骨神經(jīng)慢性縮窄組（CCI組）和高壓氧組（HBO組）。在大鼠術(shù)后7 d取脊髓標(biāo)本，采用Western blot方法檢測(cè)微管相關(guān)輕鏈蛋白1輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）及泛素結(jié)合蛋白P62表達(dá)，在電鏡下觀察各組大鼠脊髓線粒體自噬的變化情況。結(jié)果Western blot顯示CCI組、HBO組大鼠脊髓中LC3Ⅱ及P62含量較C組、S組增加（P＜0.05），而C組與S組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。HBO組LC3Ⅱ表達(dá)較CCI組增加（P＜0.05），而CCI組P62表達(dá)比HBO組顯著增加（P＜0.05）。電鏡下，與C組、S組比較，CCI組、HBO組脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬明顯增高（P＜0.05），且C組與S組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論高壓氧能誘導(dǎo)自噬，從而產(chǎn)生抗神經(jīng)病理性疼痛作用。

高壓氧；慢性結(jié)扎；坐骨神經(jīng)；p62；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；線粒體；自噬

自噬是真核細(xì)胞進(jìn)化過程中一種保守的細(xì)胞行為，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面占有極其重要的地位。近年來，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤及多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變（腦缺血、脊髓外傷等）自噬細(xì)胞產(chǎn)生增多，并對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。然而目前自噬對(duì)神經(jīng)性病理性疼痛作用報(bào)道很少。最近有研究［1］發(fā)現(xiàn)自噬可能與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)，認(rèn)為疼痛的發(fā)生、發(fā)展均由于自噬調(diào)節(jié)失衡所致。然而自噬究竟在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著什么作用，高壓氧能否誘導(dǎo)其產(chǎn)生尚不清楚，本研究擬通過觀察脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬來探討高壓氧抗神經(jīng)病理性疼痛的作用。

1　材料與方法

1.1一般資料

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量280～350 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)均分成4組：對(duì)照組（C組，不進(jìn)行操作）、假手術(shù)組（S組，暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎）、坐骨神經(jīng)慢性縮窄組（CCI組，單側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎）、高壓氧組［HBO組，慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI），術(shù)后連續(xù)進(jìn)行高壓氧治療5 d］。

1.2方法

1.2.1CCI模型的制備：大鼠腹腔麻醉后，在右側(cè)股骨后分離坐骨神經(jīng)，用絲線做3個(gè)松弛結(jié)扎，使神經(jīng)外膜稍有壓力。成功標(biāo)準(zhǔn)：右后腿肌肉出現(xiàn)短陣收縮。縫合皮膚后回籠觀察。S組大鼠僅暴露但不結(jié)扎。

1.2.2大鼠的高壓氧處理：HBO組大鼠連續(xù)5 d進(jìn)入高壓氧艙內(nèi)行高壓氧治療，進(jìn)艙后艙內(nèi)的氧濃度為90%以上，壓力為0.25 MPa，以勻速增加或減少壓力。其他組大鼠也放在艙內(nèi)，除高壓氧的壓力、O2濃度不同（壓力為標(biāo)準(zhǔn)常壓，氧濃度為正常21%）外，其他條件均相同。

1.2.3取材：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉，行升主動(dòng)脈插管，灌注0.9%的生理鹽水，使流出液為清涼無色液體，保留大鼠L4～L6脊髓，一部分放在-80℃冰箱保存，剩下的浸泡在4%多聚甲醛中待用。

1.2.4Western blot方法測(cè)定組織中微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3Ⅱ（microtubulerassociated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）及泛素結(jié)合蛋白P62表達(dá)：用SDSPAGE凝膠試劑盒和ECL發(fā)光法試劑盒制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、顯色，成像拍照，所有條帶用Image J分析結(jié)果，記錄每條蛋白電泳帶的光密度值。LC3Ⅱ及P62與內(nèi)參之比計(jì)為各自蛋白表達(dá)量。

1.2.5電子顯微鏡觀察自噬體含量：新鮮標(biāo)本用4%多聚甲醛固定4 h，常規(guī)固定、脫水、浸蠟、包埋制作石蠟切片，制作半薄切片。再甲苯胺藍(lán)染色，制作超薄切片。飽和的醋酸鈾-檸檬酸鉛將切片行雙重染色，自然干燥。透射電鏡下觀察組織超微結(jié)構(gòu)，各組每只大鼠取10個(gè)視野，記錄自噬體的數(shù)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.14組大鼠脊髓LC3Ⅱ及P62的蛋白表達(dá)比較

結(jié)果顯示：CCI、HBO組的大鼠脊髓LC3Ⅱ及P62的表達(dá)含量較C組、S組增加（P＜0.05），而C組與S組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。HBO組的

LC3Ⅱ表達(dá)較CCI組增加（P＜0.05），而CCI組的P62表達(dá)比HBO組增加（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.24組大鼠電鏡下脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞自噬情況比較

電子顯微鏡下觀察大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，C組、S組、CCI組、HBO組自噬體數(shù)目分別為0.008、0.009、0.045、0.059/μm2。與C組、S組比較，CCI組、HBO組的線粒體自噬體數(shù)目明顯增高（P＜0.05），而C組與S組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2。

3　討論

神經(jīng)病理性疼痛本身是一種慢性缺血缺氧損傷，細(xì)胞遭受低氧刺激時(shí)，線粒體電子傳遞鏈中最終受體的氧分子供應(yīng)不足，對(duì)細(xì)胞大分子和細(xì)胞器造成損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂或細(xì)胞死亡。氧化應(yīng)激反應(yīng)是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病的重要機(jī)制，在這一過程中，細(xì)胞自噬參與多種炎性介質(zhì)基因編碼，促進(jìn)疼痛相關(guān)細(xì)胞的增殖，對(duì)疼痛發(fā)揮著重要的作用［2］。自噬在維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、代謝和細(xì)胞功能的自身穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用。在生理狀態(tài)下它處于較低水平，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激刺激（如創(chuàng)傷、缺血缺氧等）自噬會(huì)被激活［3，4］。LC3是細(xì)胞中酵母基因的同源物，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)LC3隨之增加，亞型LC3Ⅱ含量與自噬體數(shù)量成正比，因此LC3Ⅱ成為檢測(cè)自噬體的一個(gè)特異性標(biāo)記物［5，6］。另外，由于P62通過與LC3結(jié)合轉(zhuǎn)入自噬體，被自噬溶酶體降解，P62的蓄積增高常提示自噬受到抑制［7］。

表1　4組大鼠脊髓LC3ⅡP62蛋白表達(dá)比較Tab.1　Com parison of LC3Ⅱ and P62 protein expression inspinal cord o f rats in each g roup

圖1　4組大鼠LC3Ⅱ及P62的蛋白表達(dá)比較Fig.1　The protein exp ression of LC3Ⅱand P62 in each groupdeterm ined by Western blot

圖2　電鏡下各組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)×5 000Fig.2　The m orphology of m icroglia in each group under electron m ic roscopy

高壓氧作為一種有效無創(chuàng)的治療手段增加脊髓的氧分壓，提高抗氧化酶活性，緩解疼痛并減少不良反應(yīng)［8］。Yan等［9］已將高壓氧廣泛應(yīng)用于脊髓缺血耐受等領(lǐng)域。前期研究［10］已通過疼痛行為學(xué)評(píng)分證明了高壓氧對(duì)神經(jīng)病理性疼痛治療的有效性，并證實(shí)它可減少坐骨神經(jīng)慢性縮窄大鼠脊髓中iNOS、nNOS及小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。由于高壓氧能有效清除氧自由基，對(duì)抗氧化應(yīng)激的不良反應(yīng)，因此推測(cè)高壓氧可能誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，和CCI組比較，HBO組大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)增高，而P62的表達(dá)較低，說明HBO組脊髓自噬處于活躍的較高水平，可能是高壓氧的一種保護(hù)性效應(yīng)。盡管CCI組自噬不像HBO組那樣處于很高水平，但也誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，可能是脊髓本身受損后的一種應(yīng)激反應(yīng)。有文獻(xiàn)［11］報(bào)道自噬將作為一種衡量治療神經(jīng)病理性疼痛方法有效性的一種方式或手段。本結(jié)果顯示自噬主要表達(dá)在CCI組及HBO組，且HBO組表達(dá)得更明顯。此結(jié)果從自噬角度再次證明高壓氧抗神經(jīng)病理性疼痛的有效性，也為高壓氧抗神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制研究開辟了一個(gè)新思路。但此結(jié)果僅是術(shù)后第7天的對(duì)比，很難看出高壓氧對(duì)自噬影響的變化趨勢(shì)，在后續(xù)研究中還應(yīng)就不同時(shí)間進(jìn)行比較。

綜上所述，在神經(jīng)病理性疼痛的過程中可以產(chǎn)生自噬，隨著疼痛的發(fā)展，高壓氧可以增強(qiáng)這種保護(hù)性自噬，并成功誘導(dǎo)自噬體延續(xù)。但具體如何作用于自噬體及其機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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（編輯武玉欣）

HyperbaricOxygen Induced Autophagy in Neuropathic Rats

HANGuang，LILu，ZHAOPing
（DepartmentofAnesthesiology，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate whether hyperbaric oxygen（HBO）affected neuropathic pain through autophagy and verify the HBO effect. M ethods A totalof60maleSD ratswereselected for thestudyand randomlydivided into4groups：controlgroup（Cgroup），sham operationgroup （S group），chronic constriction group（CCI group）and hyperbaric oxygen group（HBO group）.LC3Ⅱand P62 were determined by Western blot method and the autophagy was detected by electron microscopy on the 7th day.ResultsCCI and HBO groups were significantly higher than C and S group in Western blot（P＜0.05）.There was no difference between group C and group S（P＞0.05）.The expression of LC3Ⅱin HBO group was significantly higher than that in CCI group（P＜0.05）.And the expression of P62 in CCI group was significantly higher than that in HBO group（P＜0.05）.The autophagy in CCI and HBO group were significantly increased comparing to the C and S groups（P＜0.05）.However，the difference betweengroup Cand Swasnotsignificant（P＞0.05）.ConclusionHyperbaric oxygen therapy can induceautophagy foranti-neuropathic pain.

hyperbaric oxygen；chronic constriction injury；the sciatic nerve；P62；microtubulerassociated protein 1 light chain 3；mitochondria；autophagy

R614

A

0258-4646（2016）04-0349-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.015

沈陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F15-199-1-35）

韓光（1978-），女，副教授，碩士.

趙平，E-mail：zhaop@sj-hospital.org

2015-10-12

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