白雪，馮浩，張柳，楊志博，寧宏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽 110001）

·論著·

PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達的影響

白雪，馮浩，張柳，楊志博，寧宏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽 110001）

目的探討PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達的影響。方法采用不同濃度PP242處理培養(yǎng)傳代的永生系人晶狀體上皮細胞系SRA01/04。采用MTT法檢測處理24、48 h后的細胞生長抑制率，采用實時定量RT-PCR和免疫印跡法檢測不同濃度PP242處理48 h后Bcl-2mRNA和蛋白表達水平的變化情況。結(jié)果100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242對人晶狀體上皮細胞SRA01/04作用24、48 h后，細胞生長抑制率24 h組分別為7.55%、9.43%、16.98%、22.64%、26.42%、30.19%，48 h組分別為11.11%、23.81%、36.51%、42.86%、49.21%、63.49%，與對照組（0 nmol/L）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示：在相同作用時間內(nèi)，隨著PP242藥物濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐步下降，與對照組（0 nmol/L）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：在相同作用時間內(nèi)，隨著PP242藥物濃度的增加，Bcl-2mRNA表達水平亦逐步下降；mRNA相對表達量分別為0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，與對照組（0 nmol/L）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論PP242能夠抑制體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞的生長，呈濃度和時間依賴性。人晶狀體上皮細胞中存在Bcl-2的表達，PP242可下調(diào)其表達。

PP242；人晶狀體上皮細胞；Bcl-2

白內(nèi)障摘除術(shù)后或晶狀體外傷后，殘留的皮質(zhì)或赤道部晶狀體上皮細胞增生、向后囊膜移行并化生，形成混濁，稱為后發(fā)性白內(nèi)障（posterior capsule opacification，PCO）。多種生長因子、細胞外基質(zhì)以及細胞凋亡是目前已知的PCO主要分子生物學(xué)基礎(chǔ)，因此，目前基礎(chǔ)研究的重點是如何抑制晶狀體上皮細胞增殖并誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞凋亡。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin，mTOR）信號通路與多種細胞的生長、增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)，被認為是調(diào)節(jié)細胞周期進程和凋亡的信號匯聚點［1］。PP242是一種新型的mTOR抑制劑，具有抑制乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細胞的生長及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用［2］。本研究擬應(yīng)用不同濃度PP242對體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞系SRA01/04進行處理，觀察PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡基因Bcl-2表達的影響，探討PP242對PCO的發(fā)生發(fā)展的作用。

1　材料與方法

1.1材料

人晶狀體上皮細胞系SRA01/04細胞株（北京中國科學(xué)院腫瘤研究所）；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；PP242（美國LC公司）；MTT試劑（中國碧云天生物公司）；兔抗人β-actin單克隆抗體和辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG二抗（美國Santa Cruz公司）；兔抗人Bcl-2抗體（美國Abcam公司）。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測SRA01/04細胞生長抑制情況：將對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后，將200 μL細胞懸液（約含10 000個細胞）接種到96孔板各孔。細胞貼壁生長后，棄原培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。實驗孔分別用含100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242培養(yǎng)液處理細胞24 h和48 h，設(shè)對照孔（細胞和無血清培養(yǎng)液）和調(diào)零孔（無血清培養(yǎng)液），將實驗孔、對照孔及調(diào)零孔設(shè)5個平行孔。每孔加50 μL MTT，室溫孵育4 h。用酶標(biāo)儀測波長490 nm的吸光度值（OD值），重復(fù)實驗3次。計算細胞生長抑制率（inhibitory rate，IR）=1-（OD實驗孔/ OD對照孔）×100%。

1.2.2細胞培養(yǎng)和分組：應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)SRA01/04細胞。選取對數(shù)生長期細胞傳代。細胞貼壁生長至亞匯合狀態(tài)時，更換無血清培養(yǎng)液12 h。將細胞分為對照組和實驗組。用含0 nmol/L PP242的培養(yǎng)液培養(yǎng)對照組細胞48 h；分別用含250、500、750、1 000 nmol/L PP242培養(yǎng)液培養(yǎng)實驗組細胞48 h。

1.2.3Western blot檢測Bcl-2蛋白表達情況：向各實驗組細胞內(nèi)加入裂解液裂解細胞，4℃、13 000 r/min離心15 min，取上清測蛋白濃度。進行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加兔抗人Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次。加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL發(fā)光，照相。

1.2.4實時定量RT-PCR檢測Bcl-2mRNA表達情況：提取細胞總RNA并檢測濃度。取2 μL RNA （500 ng/μL），逆轉(zhuǎn)錄cDNA。取2 μL cDNA模板，3個復(fù)孔，2步法實時定量RT-PCR擴增目的基因。βactin上游引物序列5′-GTGGACATCCGCAAAGA C-3′，下游引物序列5′-AAAGGG TGTAACGCAACT AA-3′；Bcl-2上游引物序列5′-GGATTGTGGC CTTCTTTGAG-3′，下游引物序列5′-TACCCA GCCTCCGTTATCCT-3′。根據(jù)β-actin與Bcl-2 mRNA表達量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及實驗組Ct值，計算各實驗組β-actin和Bcl-2 mRNA的相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1PP242對SRA01/04細胞生長的抑制情況（表1）

用不同濃度PP242處理SRA01/04細胞24 h、48h后，MTT法檢測細胞生長情況，結(jié)果顯示各組OD值均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；相同作用時間內(nèi)，隨著PP242濃度升高，OD值逐漸降低，表明對細胞生長的抑制率逐漸升高。相同藥物濃度下，隨著PP242處理細胞時間的增加，細胞的生長抑制率也逐漸提高。

表1　PP242對SRA01/04細胞生長的抑制情況（n=30,）Tab.1　The influence of PP242 on the proliferation of SRA01/04（n=30,）

表1　PP242對SRA01/04細胞生長的抑制情況（n=30,）Tab.1　The influence of PP242 on the proliferation of SRA01/04（n=30,）

Group　24 h　48 h OD value　IR（%）　OD value　IR（%）Control　0.53±0.19　0　0.63±0.23　0 PP242 100 nmol/L　0.49±0.17　7.55　0.56±0.37　11.11 250 nmol/L　0.48±0.15　9.43　0.48±0.61　23.81 500 nmol/L　0.44±0.17　16.98　0.40±0.13　36.51 750 nmol/L　0.41±0.06　22.64　0.36±0.57　42.86 1 000 nml/L　0.39±0.30　26.42　0.32±0.13　49.21 1 500 nmol/L　0.37±0.22　30.19　0.23±0.24　63.49

2.2PP242處理后SRA01/04細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達情況

Western blot結(jié)果顯示：SRA01/04細胞內(nèi)有Bcl-2蛋白表達，且PP242濃度越高，Bcl-2蛋白表達水平越低（圖1）。各實驗組與對照組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　Western blot法檢測PP242處理后SRA01/04細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達情況Fig.1　Exp ression o f Bcl-2 protein in SRA01/04 treated w ith different concentrations o f PP242 de term ined by Western blot

2.3PP242處理后SRA01/04細胞內(nèi)Bcl-2mRNA的表達情況

實時定量RT-PCR結(jié)果顯示：各實驗組（250，500，750，1 000 nmol/L）細胞內(nèi)Bcl-2 mRNA的相對表達量為0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。且隨著PP242濃度增加，細胞中Bcl-2 mRNA表達水平逐漸降低。

3　討論

PCO是白內(nèi)障摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥。研究［3］表明，成人白內(nèi)障摘除術(shù)后PCO發(fā)生率為30%～50%，兒童則為100%。隨著現(xiàn)代白內(nèi)障手術(shù)技術(shù)日臻完美，人工晶狀體設(shè)計及材質(zhì)不斷更新，PCO發(fā)生率有所下降。目前后囊膜截開術(shù)是治療PCO的行之有效的方法。但由于多數(shù)兒童患者自主配合能力較差，無法進行手術(shù)治療，而且可能會出現(xiàn)黃斑水腫甚至視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥［4］。因此，PCO的藥物防治方法成為目前基礎(chǔ)研究的熱點。與腫瘤細胞相似，晶狀體上皮細胞凋亡能夠受到多種炎性因子及生長因子的抑制，因此，越來越多的研究將抗腫瘤藥物用于PCO的防治。磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B/mammal target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）通路是細胞生長凋亡過程中的經(jīng)典的信號通路，激活mTOR通路可誘發(fā)腫瘤的生長。研究［6］表明，晶狀體上皮細胞的功能狀態(tài)與mTOR活性密切相關(guān)，激活mTOR通路可以抑制晶狀體上皮細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。雷帕霉素是經(jīng)典的PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑，可抑制腫瘤細胞生長，加速細胞凋亡，但其抑制作用具有一定的局限性，只對mTORC1有作用［7］。PP242是一種新型的mTOR抑制劑，通過阻斷細胞中負反饋、激活A(yù)KT途徑，對mTOR通路中mTORC1和mTORC2這2種復(fù)合物均有較強的抑制作用，因而，PP242在誘導(dǎo)細胞的凋亡方面比雷帕霉素效果更強［8］。本研究結(jié)果顯示，PP242對人晶狀體上皮細胞的增殖有較強的抑制作用，且在相同作用時間內(nèi)對細胞生長的抑制率具有濃度依賴性；在相同藥物濃度下，對細胞生長的抑制率具有時間依賴性。同時，本研究結(jié)果還顯示低濃度的PP242即可抑制人晶狀體上皮細胞的增殖，高濃度的PP242可產(chǎn)生細胞毒性，引起細胞死亡。而較短時間（12 h）內(nèi)，PP242對人晶狀體上皮細胞增殖的抑制作用并不顯著，較長時間（48 h）內(nèi)，則抑制作用明顯。

細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程，其中Bcl-2家族起關(guān)鍵性作用。Bcl-2是AKT下游效應(yīng)分子中公認的抑制凋亡的原癌基因［9］，Bcl-2蛋白主要分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白2類。Bcl-2是Bcl-2家族蛋白中的抗凋亡蛋白，平時被隔離在線粒體等細胞器內(nèi)，能夠抑制細胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子等促凋亡因子的釋放，具有抑制細胞凋亡的功能。而當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，Bcl-2失活，線粒體等細胞器受到破壞，釋放出大量的促凋亡因子［10］。本研究結(jié)果表明，正常人晶狀體上皮細胞中存在Bcl-2蛋白的表達，隨著PP242濃度的增加，人晶狀體細胞中Bcl-2蛋白的表達逐漸減弱；實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，正常人晶狀體上皮細胞中Bcl-2mRNA的表達量較高，隨著PP242濃度增高，Bcl-2的表達逐漸減弱。因此，PP242使人晶狀體上皮細胞中抗凋亡基因Bcl-2的表達水平降低，從而減弱了Bcl-2對人晶狀體上皮細胞凋亡的抑制作用。

綜上所述，PP242能夠抑制人晶狀體上皮細胞的增殖，并可能通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達而增加細胞凋亡。然而，在本研究中僅觀察到PP242下調(diào)Bcl-2表達的現(xiàn)象，而PP242抑制人晶狀體上皮細胞增殖、誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞凋亡的分子機制仍有待進一步研究。

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（編輯王又冬）

EffectsofPP242on theExpression of ApoptosisProtein Bcl-2 in Human LensEpithelialCells

BAIXue，F(xiàn)ENGHao，ZHANGLiu，YANGZhi-bo，NINGHong
（DepartmentofOphthalmology，The FirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveToexplore theeffectsofPP242 on theexpression ofapoptosisprotein Bcl-2 in human lensepithelialcells（HLECs）.MethodsImmortal HLECs SRA01/04 were cultured and treated with different concentrations of PP242.The cell growth was examined by MTT assay at 24 h and 48 h after PP242 treatment.Real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blot were adopted to detect the mRNA and protein expression of Bcl-2 respectively.Results The cultured HLECs SRA01/04 were collected and treated with different concentrations（100，250，500，750，1 000，1 500 nmol/L）of PP242.After treatment for 24 h and 48 h，the inhibitory rate in each well was determined by MTTassay.Theinhibition ratewasasbelow，24h：7.55%，9.43%，16.98%，22.64%，26.42%，30.19%；48h：11.11%，23.81%，36.51%，42.86%，49.21%，63.49%.Compared with the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group（0 nmol/L），the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased with the increasing concentrations of PP242（P＜0.05），while the expression of Bcl-2mRNA was inhibited by PP242 based on the results of RT-PCR.Compared with the control group（0 nmol/L），the RT-PCR results of Bcl-2 mRNA were 0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，respectively（P＜0.05）.ConclusionPP242 could inhibit cell proliferation of HLECs in vitro with a concentration and time depended manner.Bcl-2 protein is expressed in HLECs，which could be down regulated by PP242 treatment.

PP242；human lens epithelial cells；Bcl-2

R776.1

A

0258-4646（2016）04-0324-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.009

遼寧省社會發(fā)展攻關(guān)計劃（2013225303）

白雪（1986-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

寧宏，E-mail：xiaoxiao1998@21cn.com

2015-12-21

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