馬可，王慧，王清華，雒舒雅，肖慶桓

（中國醫(yī)科大學藥學院離子通道藥理研究室，沈陽 110122）

鈣激活氯通道密度調(diào)節(jié)Anoctam in 1電流作用的研究

馬可，王慧，王清華，雒舒雅，肖慶桓

（中國醫(yī)科大學藥學院離子通道藥理研究室，沈陽 110122）

目的研究鈣激活氯通道（CaCCs）密度對CaCCs蛋白—Anoctamin 1（Ano1）電流特性的調(diào)節(jié)作用，探討高表達Ano1促進腫瘤發(fā)生的機制。方法瞬時轉(zhuǎn)染Ano1質(zhì)粒到HEK293細胞，高密度CaCCs通過表達Ano1 24 h獲得，低密度CaCCs通過表達Ano1 6 h獲得。膜片鉗方法檢測鈣離子激活的Ano1的全細胞電流。激活電流曲線以指數(shù)曲線擬合。結(jié)果Ano1質(zhì)粒表達6 h的電流密度顯著低于表達24 h的電流密度（P＜0.05）。在低CaCCs密度時，Ano1的激活電流曲線最適于用單指數(shù)擬合，τslow為（292.71±38.11）ms。在高CaCCs密度時，Ano1的激活電流曲線最適于用兩指數(shù)擬合，τfast為（47.78±4.58）ms；τslow為（385.74± 71.44）ms。高CaCCs密度下的Ano1電流比低CaCCs密度下的Ano1電流多了一個快速激活成分（τfast），而高CaCCs密度與低CaCCs密度比較Ano1的τslow差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論CaCCs的密度可調(diào)節(jié)Ano1激活的動力學變化；高表達Ano1可促進CaCCs的激活。

Anoctam in 1；鈣激活氯通道；通道密度；激活動力學；腫瘤

鈣激活氯通道（calcium-activated chloride channels，CaCCs）Anoctamin 1（Ano1，TNEN16A）是Anoctamin家族10個成員之一，參與上皮細胞分泌、神經(jīng)及心肌細胞興奮性、平滑肌收縮、嗅覺和光感傳導、疼痛等多種重要生理功能［1］。早在2008年Ano1被確定為鈣激活氯離子通道蛋白之前，Ano1也被稱為ORAOV2、DOG1、TAOS2和DLJ0261，在食管鱗狀上皮癌、胃腸道間質(zhì)瘤、頭頸鱗狀細胞癌等多種癌癥中高表達［2］。近年來又有研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Ano1在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］、胰腺導管腺癌［5］、胃癌［6］等腫瘤中也高表達。11q13區(qū)段擴增被認為是腫瘤過高表達Ano1的機制［7］。另外，抑制組蛋白去乙酰化酶能降低乳腺癌細胞Ano1表達，表明組蛋白去乙?；竿ㄟ^表觀遺傳調(diào)控方式促進乳腺癌中Ano1的高表達［8］。在ER陰性乳腺癌中，PR陽性的腫瘤中Ano1表達量比在PR陰性的高，表明ER和PR信號通路可能參與調(diào)控Ano1在乳腺癌中的表達［3］。

研究報道，在頭頸鱗狀細胞癌細胞系中，Ano1可以通過激活ERK1/2通路調(diào)節(jié)其下游clinD1表達水平升高［9］；在乳腺癌細胞系中，Ano1可以通過激活表皮生長因子受體通路和鈣調(diào)蛋白激酶通路促進細胞增殖［10］；提示Ano1氯通道可能對促進腫瘤細胞增殖起到重要作用。但是，Ano1過表達導致的過高通道密度是否會調(diào)節(jié)Ano1電流特性目前尚不清楚。

本研究擬通過瞬時轉(zhuǎn)染Ano1質(zhì)粒到HEK293細胞，觀察表達時間不同而獲得含有不同Ano1密度的HEK293細胞，應(yīng)用膜片鉗方法檢測Ano1密度對其電流特性的影響。探討CaCCs密度對Ano1電流特性的調(diào)節(jié)作用及高表達Ano1促進腫瘤發(fā)生的機制。

1　材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK-293細胞購于美國菌種保藏中心，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在含10%胎牛血清、0.5%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待細胞70%～80%時棄培養(yǎng)液。參照Fugen-6試劑說明操作，在HEK293細胞中瞬時轉(zhuǎn)染Ano1質(zhì)粒（1 μg）。細胞中同時轉(zhuǎn)染1 μg EGFP用于熒光檢測。細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h和24 h后進行膜片鉗實驗。

1.2膜片鉗記錄鈣激活氯電流

轉(zhuǎn)染Ano1后的HEK293細胞在熒光顯微鏡下進行全細胞膜片鉗實驗，電極電阻為2～4 M?。應(yīng)用Clampfit9，通過AxoPatch 200B膜片鉗放大器和Digidata1322A采集數(shù)據(jù)（MD，美國）?！盁o鈣”電極內(nèi)液含146 mmol/L CsCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L EGTA，10 mmol/L蔗糖，8 mmol/L HEPES，應(yīng)用NMDG調(diào)節(jié)至pH 7.3?！案哜}”電極內(nèi)液用5 mmol/L Ca2+-EGTA替代EGTA，其游離鈣離子濃度約為25 μmol/L。1 μmol/L鈣離子濃度的電極內(nèi)液通過由“無鈣”和“高鈣”電極內(nèi)液按照1∶9的比例配制而成，游離鈣離子濃度用Fure-2和Fura 6F（Invitrogen）驗證。細胞外液含140 mmol/L NaCl，4 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L葡萄糖和10 mmol/L HEPES（pH 7.3）。所有液體滲透壓均用蔗糖調(diào)至305 mOsm。細胞電壓鉗制在0 mV，刺激電壓為-100 mV～+100 mV，步階電壓20 mV，刺激時間為700 ms。

圖1　轉(zhuǎn)染Ano1質(zhì)粒6 h及24 h后的HEK293細胞Ano1電流密度Fig.1　Channe l current density of Ano1 in HEK293 cells after transient transfection w ith Ano1 p lasm id for 6 h and 24 h

1.3數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Origin 7軟件進行分析數(shù)據(jù)和圖像制作。激活電流曲線由單指數(shù)或兩個指數(shù)擬合而成。應(yīng)用t檢驗比較組間差異，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

2.1不同轉(zhuǎn)染時間對Ano1電流密度的影響

應(yīng)用膜片鉗檢測瞬轉(zhuǎn)Ano1質(zhì)粒后表達Ano1蛋白6 h和24 h的HEK293細胞的鈣激活氯電流結(jié)果顯示，在1 mmol/L鈣離子條件下，HEK細胞記錄到鈣激活的氯電流，電流呈現(xiàn)強烈的外向整流和時間依賴性激活的特性（圖1），符合鈣離子激活Ano1的電流特性［11］。在+100 mV的條件下，Ano1質(zhì)粒表達6 h的電流密度為（103.68±28.62）pA/pF；Ano1質(zhì)粒表達24 h的電流密度為（482.12±65.70）pA/pF，2者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2通道密度對Ano1電流激活動力學的影響

結(jié)果顯示，在低通道密度時，Ano1電流激活只有緩慢激活成分（τslow），Ano1的激活電流曲線最適于用單指數(shù)擬合，τslow為（292.71±38.11）ms；在高通道密度時，Ano1電流激活包括快速激活成分（τfast）和緩慢激活成分（τslow），Ano1的激活電流曲線最適于用兩指數(shù)擬合，τfast為（47.78±4.58）ms；τslow為（385.74±71.44）ms。高通道密度Ano1的τslow與低通道密度比較沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

3　討論

盡管Ano1高表達促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制還不清楚，但有研究［10］結(jié)果證明，高表達Ano1可以激活ERK1/2通路、EGFR通路及CAMK等多種信號通路。另外，Ano1的氯通道功能有促進腫瘤細胞增殖的作用［12］。高表達Ano1是否對Ano1的氯通道有調(diào)節(jié)作用還未見報道。

Mazzanti等［13］報道L型電壓依賴性鈣通道的電流特性受通道密度調(diào)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)Ano1質(zhì)粒表達24 h的電流密度比表達6 h的電流密度顯著增加，表明Ano1質(zhì)粒表達24 h導致了通道密度增高。高通道密度下的Ano1電流激活包括兩個組成成分：快速激活成分（τfast）和緩慢激活成分（τslow）。低通道密度下的Ano1電流激活只有緩慢激活成分。前期研究［14］表明快速激活成分和電壓依賴性激活Ano1相關(guān)，而緩慢激活成分和鈣離子依賴性激活Ano1相關(guān)；通透的陰離子可以調(diào)控電壓依賴性門控Ano1通道［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，高密度Ano1可能通過調(diào)節(jié)電壓依賴性激活Ano1，而不影響鈣離子依賴性激活Ano1；高密度通道調(diào)節(jié)電壓依賴性激活Ano1，即在高通道密度的條件下，通透的陰離子增加，而高通透的陰離子可能作為電壓感受器，促進電壓依賴性激活Ano1。

由于Ano1快速通透氯離子可以更快調(diào)控細胞的膜電位［11］，進而可能參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為［10］，本研究發(fā)現(xiàn)高表達Ano1能夠加速Ano1激活，說明高表達Ano1可能促進通道處于激活狀態(tài)。本研究可能為進一步闡明高表達Ano1促進腫瘤發(fā)生發(fā)展提供了一個新的思路。

［1］Criss H，Yu K，Xiao QH，et al.Anoctamin/TMEM16 family members are Ca2+-activated Cl-channels［J］.J Physiol，2009，587（10）：2127-2139.

［2］West RB，Corless CL，Chen X，et al.The novel marker，DOG1，is expressed ubiquitously in gastrointestinal stromal tumors irrespective of KIT or PDGFRA mutation status［J］.Am J Pathol，2004，165 （1）：107-113.

［3］Wu H，Guan S，Sun M，et al.Ano1/TMEM16A overexpression is associated with good prognosis in PR-positive or HER2-negative breast cancer patients following tamoxifen treatment［J］.PLos One，2015，10（5）：e0126128.

［4］Liu W，Lu M，Liu B，et al.Inhibition of Ca（2+）-activated Cl（-）channel ANO1/TMEM16A expression suppresses tumor growth and invasiveness in human prostate carcinoma［J］.Cancer Letters，2012，326（1）：41-51.

［5］Sauter DRP，Novak I，Pedersen SF，et al.ANO1（TMEM16A）in pancreatic ductal adenocarcinoma（PDAC）［J］.Pflügers Arch Eur J Physiol，2014，467（7）：1-14.

［6］Liu F，Cao Q H，Lu D J，et al.TMEM16A overexpression contributes to tumor invasion and poor prognosis of human gastric cancer through TGF-β signaling［J］.Oncotarget，2015，6（13）：11585-11599.

［7］Podchanart W，Luisa W，Koehl GE，et al.Role of anoctamins in cancer and apoptosis［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2014，369（1638）：1524-1530.

［8］Sayo M，Satomi N，Katsuhiko M，et al.Downregulation of Ca2+-activated Cl-channel TMEM16A by the inhibition of histone deacetylase in TMEM16A-expressing cancer cells［J］.J Pharmacol Exp Therapeutics，2014，351（3）：510-518.

［9］Umamaheswar D，Shiwarski DJ，Dong X，et al.TMEM16A induces MAPK and contributes directly to tumorigenesis and cancer progression［J］.Cancer Res，2012，72（13）：3270-3281.

［10］Adrian B，Anke B，Heike B，et al.Calcium-activated chloride channel ANO1 promotes breast cancer progression by activating EGFR and CAMK signaling［J］.Proceed Nat Acad Sci USA，2013，110 （11）：E1026-E1034.

［11］Xiao QH，Yu K，Patricia PC，et al.Voltage-and calcium-dependent gating of TMEM16A/Ano1 chloride channels are physically coupled by the first intracellular loop［J］.Proceed Nat Acad Sci USA，2011，108（21）：8891-8896.

［12］Shiwarski DJ，Chunbo S，Anke B，et al.To"grow"or"go"：TMEM16A expression as a switch between tumor growth and metastasis in SCCHN［J］.ClinCancer Res，2014，20（17）：4673-4688.

［13］Mazzanti M，Defelice LJ，Liu YM.Gating of L-type Ca2+channels in embryonic chick ventricle cells：dependence on voltage，current and channel density［J］.J Physiol，1991，443（3）：307-334.

［14］Xiao QH，Cui YY.Acidic amino acids in the first intracellular loop contribute to voltage-and calcium-dependent gating of anoctamin1/ TMEM16A［J］.PLos One，2014，9（6）：e99376-e99376.

（編輯武玉欣）

EffectofCa2+-activated ChlorideChannelDensity on Gating Propertiesof Anoctam in 1

MAKe，WANGHui，WANGQing-hua，LUOShu-ya，XIAOQing-huan
（Departmentof Ion ChannelPharmacology，SchoolofPharmacy，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo investigate theeffectofchanneldensityon thegatingpropertiesofAnoctamin1（Ano1，TMEM16A）Ca2+-activated chloride channel.MethodsAno1 expression plasmids were transiently transfected into HEK293 cells.High density and low density of Ano1 was obtained after expressing the protein for 24 h and 6 h，respectively.Electrophysiological recordings were performed in the whole-cell patch clamp configuration.The activation kinetics of current traces was fitted by exponentials.Results The current density was significantly higher in cells expressing Ano1 for24 h than thoseexpressingAno1 for6 h（P＜0.05）.Theactivation ofAno1 currentin cellswith low densitywaswellfitbyasingleexponentialwithτslowof292.71±38.11ms.Theactivation ofAno1 currentin cellswith high densitywaswellfitby twoexponentialswithτfastof47.78±4.58 ms and τslowof 385.74±71.44 ms.ANO1 current in cells with high density has a rapid active component（τfast）more than low density.There was no significantlydifferentoftheτslowbetween cellswithhigh densityand low densityofAno1（P＞0.05）.ConclusionOur findingssuggested thatchanneldensity regulatesthegatingofAno1.High channeldensity promotesactivationofAno1.

Anoctamin1；Ca2+-activated chloride channel；channel density；activation kinetics；tumor

R966

A

0258-4646（2016）04-0298-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.003

國家自然科學基金（31371145；81572613）

馬可（1989-），女，助教，碩士.

肖慶桓，E-mail：qinghuanxiao12345@163.com

2015-10-16

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