馮　璐，戚大偉

(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040)

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基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌鑒定方法的研究

馮璐，戚大偉*

(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040)

木材腐朽菌侵染木材而造成的木材腐朽現(xiàn)象會對木材的質(zhì)量有著很大的影響，為了鑒定木材腐朽的病原菌，基于PCR技術(shù)設(shè)計了一種快速鑒定木材腐朽病原菌的方法。首先從腐朽木材上分離純化得到兩種病原菌，之后對兩種病原菌進(jìn)行實驗室培養(yǎng)，通過觀察其培養(yǎng)特性對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。隨后設(shè)計了7組引物，對兩種病原菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并通過BLAST對比鑒定出這兩種木材腐朽病原菌。研究結(jié)果表明，木材腐朽菌A為彩絨革蓋菌，木材腐朽菌B屬于多孔菌屬真菌。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，而基于PCR技術(shù)的的鑒定方法更為簡便快捷且精確，證明了該方法的可行性。

木材腐朽病原菌；PCR；引物設(shè)計；分子水平鑒定

0　引　言

木材在人類生產(chǎn)生活的各個方面有著非常重要的作用，但是隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展木材資源已經(jīng)供不應(yīng)求，保證木材的質(zhì)量顯得尤為重要。在影響木材質(zhì)量的眾多因素中，由木材腐朽菌侵染木材而引起的木材腐朽現(xiàn)象十分常見。木材腐朽發(fā)生頻率高并且影響范圍廣，對木材質(zhì)量造成不可逆的破壞，每年由木材腐朽引起的木材資源流失數(shù)目龐大，對人們的生產(chǎn)和生活也帶來了嚴(yán)重的影響。為了合理使用木材資源，減小由木材腐朽菌造成的大面積木材腐朽，人們對木材腐朽和木材腐朽菌作了深入的研究[1]。目前鑒定木材腐朽菌的方法主要有兩種，一種是傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，即通過觀察菌落宏觀培養(yǎng)特性和微觀培養(yǎng)特性的特征來對菌種進(jìn)行鑒定和分類；另一種是近年來發(fā)展起來的分子水平的鑒定方法[2]，該方法依賴于PCR技術(shù)，通過擴(kuò)增未知菌種的DNA序列，測序后與基因庫內(nèi)已知菌種進(jìn)行比對來鑒定木材腐朽菌。PCR在物種鑒定上的應(yīng)用集中在醫(yī)學(xué)病原菌的鑒定、農(nóng)副產(chǎn)品的鑒定上，而將PCR技術(shù)運用到木材腐朽的病原菌上的研究才剛剛開始[3-9]。

1　木材腐朽菌形態(tài)學(xué)鑒定

1.1木材腐朽菌的采集和篩選

菌種來源：菌種采集于東北林業(yè)大學(xué)林場，從人工水曲柳林病株上采集新鮮子實體，并在實驗室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

用75%的酒精對新鮮的子實體進(jìn)行消毒后在無菌環(huán)境下將其切割成0.2 cm3的組織塊，用70%酒精對組織塊表面進(jìn)行消毒，之后放入0.1%升汞消毒液中浸泡2 min，立即用無菌水沖洗3次，然后用鑷子接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，將斜面培養(yǎng)基放置于25℃生物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并每天觀察菌種的生長狀況，當(dāng)菌絲布滿斜面時即完成菌種的分離[10-11]。經(jīng)過分離獲得了A、B兩種木材腐朽菌。

1.2木材腐朽菌的生物學(xué)特性

1.2.1溫度

選取5種不同溫度對兩種真菌進(jìn)行培養(yǎng)，分別為15、20、25、30、35℃[12]，每組設(shè)置5個重復(fù)，控制其他培養(yǎng)基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min)，之后將已接種的各組培養(yǎng)皿置于不同溫度的生物培養(yǎng)箱中自然光條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄A、B兩菌種的生長情況，記錄第7天時每組菌落的平均直徑。

1.2.2pH值

選取5種不同酸堿度的PDA培養(yǎng)基對兩種真菌進(jìn)行培養(yǎng)，分別為pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH自然(經(jīng)測pH=6.8)[13]，每組設(shè)置5個重復(fù)，控制其他培養(yǎng)基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min)，之后將已接種的各組培養(yǎng)皿放置于25℃生物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄A、B兩木材腐朽菌菌種的生長情況，記錄第7天時每組菌落的平均直徑。

1.2.3光照強(qiáng)度

分別將生物培養(yǎng)箱的光照強(qiáng)度設(shè)置為0、1 000、2 000、3 000 lux[12]，每組設(shè)置5個重復(fù)，控制其他培養(yǎng)基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，溫度25℃，pH自然，121℃滅菌20 min)，之后將接種的培養(yǎng)基置于不同溫度的生物培養(yǎng)箱中自然光條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄A、B兩菌種的生長情況，記錄第7天時每組菌落的平均直徑。

1.3木材腐朽菌的形態(tài)學(xué)特性

1.3.1菌落特征

當(dāng)菌絲生長至接近培養(yǎng)皿邊緣10 mm時打開培養(yǎng)皿上蓋[7]，將培養(yǎng)皿至于水平臺上，用普通數(shù)碼相機(jī)拍攝菌落此時的生長狀況。

1.3.2菌絲特征

制作菌絲體玻片，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2　基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)鑒定

2.1PCR引物的設(shè)計

引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR擴(kuò)增的成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。用特異性引物擴(kuò)增ITS區(qū)段這種方法允許所擴(kuò)增ITS區(qū)段的測序結(jié)果存在一定的誤差，由于木材腐朽菌ITS區(qū)段的長度一般都在400bp以上，所以少量誤差并不會影響最終鑒定結(jié)果[14-17]。在對ITS區(qū)段的DNA序列進(jìn)行分析時，即使DNA序列數(shù)據(jù)庫中沒有被鑒定菌株所屬物種的DNA序列，通過BLAST軟件搜索出的物種也應(yīng)是數(shù)據(jù)庫中與被鑒定物種最近緣的物種，結(jié)合經(jīng)典鑒定方法也可以對菌種做出正確的鑒定。

本文共設(shè)計了7對引物對供試材料的rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這7對引物分別是：Fung / ITS4，ITS1 / ITS4，NS1 / NS4，OPAA11 / OPAA18，OPD18 / OPD15，OPAA17 / OPO15，OPAA11 / OPD18。

各引物序列如下：

2.2反應(yīng)條件的設(shè)計與優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系(20 μl)如下：

注：不足20 μl的體積用dd H2O補(bǔ)足。每次反應(yīng)均以無菌去離子水替代模板DNA作為空白對照[18]。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)時間大概兩小時，熱循環(huán)參數(shù)設(shè)定如下：

3　結(jié)果與分析

3.1形態(tài)學(xué)鑒定

3.1.1生物學(xué)特征

木材腐朽菌A的適宜生長溫度為20～25℃，最適生長溫度為25℃。15～25℃時，菌種的生長速率隨著溫度的升高而增高，25℃是達(dá)到最高，之后生長速率急速降低。木材腐朽菌B生長速率與木材腐朽菌A基本相同。不同溫度下兩種木材腐朽菌的生長速率如圖1和圖2所示。

圖1　不同溫度下菌落A的生長速率Fig.1 The growth rate of colony A under different temperature

圖2　不同溫度下菌落B的生長速率圖Fig.2 The growth rate of colony B under different temperature

兩種木材腐朽菌的最適生長pH值均為7左右，但由于PDA培養(yǎng)基自然狀態(tài)下(不用酸堿調(diào)節(jié)pH的情況下)pH約為6.8，此時兩菌種的生長速率和pH=7時的生長速率非常接近，為了方便操作、節(jié)省資源，可以選擇pH自然狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)。不同溫度下兩種木材腐朽菌的生長速率如圖3和圖4所示。

圖3　不同pH下菌落A的生長速率Fig.3 The growth rate of colony A under different pH

圖4　不同pH下菌落B的生長速率Fig.4 The growth rate of colony B under different pH

兩種木材腐朽菌對光照不敏感，在不同的光照條件下生長速率基本相同，說明光照強(qiáng)度對兩種木材腐朽菌的生長基本沒有影響。

3.1.2形態(tài)學(xué)特征

對兩種木材腐朽菌進(jìn)行實驗室培養(yǎng)，通過數(shù)碼照相機(jī)照相后結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5　木材腐朽菌A的菌落生長狀況Fig.5 The colony’s growth condition of wood-decaying fungi A

菌種A：生長速率快，1～2周覆蓋平板；菌落邊緣為鋸齒狀；菌絲體緊貼于瓊脂培養(yǎng)基表面生長；菌絲短而纖細(xì)，疏松地排列在培養(yǎng)基表面，形成一個絨毛狀菌落；菌落保持白色或奶油色；表面較平滑；在6周前反面部分變褐；生長新區(qū)的邊緣菌絲為升起的羊毛狀；培養(yǎng)皿對光觀察，不能分清單個菌絲的尖端。

圖6　木材腐朽菌B的菌落生長狀況Fig.6 The colony’s growth condition of wood-decaying fungi B

菌種B：生長速率快，2周覆蓋平板；菌落邊緣為鋸齒狀；菌絲體在培養(yǎng)基內(nèi)部生長，在表面之下；菌絲緊密扭結(jié)，形成一個白色外皮殼，較硬且不易剝落；菌落保持白色；在6周前反面部分變褐；生長新區(qū)的邊緣菌絲平伏在培養(yǎng)基表面；培養(yǎng)皿對光觀察，能夠分清單個菌絲的尖端。

挑取兩種木材腐朽菌做成臨時裝片，分別置于光學(xué)顯微鏡下觀察，得到結(jié)果如圖7和圖8所示。

圖7　光學(xué)顯微鏡下木材腐朽菌A的菌絲照片F(xiàn)ig.7 The mycelium photos of wood-decaying fungi A under optical microscope

菌種A：生長新區(qū)的菌絲無色，節(jié)狀分隔；氣生菌絲像生長新區(qū)的菌絲，具有垂直分枝；纖維菌絲較多，壁厚，時常分枝，彎曲和交織在一起；分生節(jié)有孢子。

菌種B：生長新區(qū)的菌絲無色，多分枝，有內(nèi)含物，節(jié)狀分隔很多，柔軟；氣生菌絲像生長新區(qū)的菌絲；纖維菌絲多，顏色深，分枝較明顯，中空或有內(nèi)含物；擔(dān)孢子透明，均勻，圓柱形。

經(jīng)過試驗觀察菌種A、B的宏觀和微觀特征，包括菌種的最適生長環(huán)境，菌落的顏色、質(zhì)地、生長速率、邊緣特征，顯微鏡下各個階層菌絲的形狀、生長狀況等，可以大致判斷出兩種木材腐朽菌所屬的科屬情況。真菌A屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、栓菌屬；木材腐朽菌B屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、多孔菌屬。

3.2分子生物學(xué)鑒定

對兩種木材腐朽菌7對引物擴(kuò)增后得到的DNA序列分別登陸GeneBank，在DNA序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源DNA序列的搜索工作，并進(jìn)行BLAST對比，根據(jù)BLAST搜索和比較的結(jié)果，判斷菌絲體菌種的物種或與其近緣的物種[19-20]。

登錄GenBank，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列相似性檢索，引物1擴(kuò)增序列對比得到與菌種A相似率為96%的為Trametes versicolor(L.)Lloyd.彩絨革蓋菌，引物2擴(kuò)增序列檢測到與被試樣品序列相似性為85%以上的菌種3種，引物3、5、6、7擴(kuò)增產(chǎn)物并未在genebank上找到與其相似性達(dá)到50%以上的已知序列，引物4擴(kuò)增序列檢測到與被試樣品相似率為83%以上的4種菌。而之前經(jīng)典形態(tài)學(xué)鑒定方法對該菌種的子實體照片、菌落照片、菌絲照片的鑒定結(jié)果是木材腐朽菌A為采絨革蓋菌。

在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列相似性檢索，未檢測到木材腐朽菌B這個種，但與菌種B相似率在85%以上的同源物種序列共有9個，將這9個序列同測得的菌種B序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從圖中可以看出，10個序列形成3個大的聚類組，木材腐朽菌B與多孔菌屬其他種同屬于一個聚類組，每個分支間的自舉支持率都很高(>87%)，序列差異小，親緣關(guān)系近。菌種B與另兩個聚類組的自舉支持率都很低(<50%)，序列差異大，說明其親緣關(guān)系遠(yuǎn)。由此可以確定木材腐朽菌B屬于多孔菌屬真菌，如圖9所示。

圖9　用ITS序列構(gòu)建的木材腐朽菌B系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Wood-decaying fungi B phylogenetic tree constructed of ITS sequence

4　結(jié)　論

本文用PCR方法快速鑒定了兩種木材腐朽菌，并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，通過對比分析兩種鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種鑒定方法得到的結(jié)果一致。但對木材腐朽菌A進(jìn)行鑒定時，分子水平的鑒定精確到了種的水平，而傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法只能判定該菌種是臥孔菌屬，并不能判定它是哪種菌種。因此在基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌快速鑒定方法更加精確。

然而，基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌快速鑒定方法也存在一定的局限性，由于ITS序列的高度保守性，種間關(guān)系相近的種的ITS序列之間的差異非常微小，所以這種分子鑒定方法不適合于屬內(nèi)種及種群間的鑒定[14-15]，只有把傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法和基于PCR技術(shù)的鑒定方法想結(jié)合，才能得到更加可靠地鑒定結(jié)果。

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Study on Identification of Wood-decayingFungi Based on PCR Technique

Feng Lu，Qi Dawei*

(College of Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040)

Wood decay caused by wood-decaying fungi will affect the wood quality.In order to investigate the pathogens resulted in wood decay，a new method was designed to rapidly identify wood-decaying fungi based on PCR(Polymerase chain reaction)technique.Two pathogens separated and depurated from decayed wood were cultivated in the laboratory，and then wood-decaying fungi was identified by morphological identification method.Seven groups of primer were designed to refine and amplify the PCR conditions.Two wood-decaying pathogens were compared and identified with BLAST.Results showed that wood-decaying fungi A wasTrametesversicolor(L.)Lloydwood-decaying fungi and fungi B belonged toPolyporaceaePolyporus.The results obtained by molecular identification were consistent with that by morphological identification.It is proven that the identification method based on molecular is feasible due to its rapid and accurate characteristics.

wood-decaying fungi；PCR；primer design；molecular identifications

2016-05-20

國家自然科學(xué)基金(31570712)

馮璐，碩士研究生。研究方向：生物物理。

戚大偉，博士，教授。研究方向:生物物理。

馮璐，戚大偉.基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌鑒定方法的研究[J].森林工程，2016，32(5)：35-39.

S 782.3

A

1001-005X(2016)05-0035-05

E-mal：qidw9806@126.com