姚紅濤， 鄭 璞

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

Methylopila sp.YHT-1鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)吡咯喹啉醌

姚紅濤， 鄭 璞*

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

以甲醇為唯一碳源，從土壤中篩選分離出一株分泌吡咯喹啉醌（PQQ）菌株YHT-1。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，鑒定為Methylopila sp.菌。經(jīng)搖瓶發(fā)酵初步優(yōu)化后，YHT-1在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵4 d，PQQ產(chǎn)量達(dá)113.6 mg/L。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)DEAE陰離子交換初步純化、低溫結(jié)晶，得到PQQ粗品，并經(jīng)HPLC和紫外光譜分析，證實(shí)為PQQ。

吡咯喹啉醌；Methylopila sp.；篩選；鑒定；發(fā)酵

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），化學(xué)名稱為4，5-二氫-4，5-二氧化-1-氫吡咯（2，3f）醌-2，7，9一三羧酸，別名Methaxatin，是一種新型輔酶。1979年Salisbury等人首次從甲基營(yíng)養(yǎng)菌中分離，并確定其為在細(xì)菌細(xì)胞中作為膜結(jié)合脫氫酶的氧化還原輔因子［1］。目前，在許多不同生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)存在PQQ，它具有參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，防止活細(xì)胞被體內(nèi)或體外的氧損傷，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)極端環(huán)境的耐受性，增加不溶性磷酸鹽的可利用性等多種生理功能，新近一些研究發(fā)現(xiàn)PQQ具有異常高的氧化還原循環(huán)能力，在抗神經(jīng)細(xì)胞衰老和抗癌等方面有很大應(yīng)用潛力［2］。同時(shí)，2008年，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)了以PQQ為主要成分的促進(jìn)認(rèn)知功能食品。因此，PQQ作為藥物或功能食品具有很好的應(yīng)用前景［3］。

PQQ的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法和發(fā)酵法［4］，化學(xué)法合成步驟多、副產(chǎn)物多且難以去除［5］，在2007年公開的美國(guó)專利中［6］，一種新的PQQ合成方法仍需要9步反應(yīng)。目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)PQQ受到越來越多的關(guān)注，生物合成PQQ的微生物多為革蘭氏陰性菌，其中以甲基營(yíng)養(yǎng)菌的合成水平最高，已報(bào)道的有生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、甲烷單胞菌屬（Methanomonas）、甲基菌屬（Methylobacillus）、甲基單 胞 菌 屬 （Methylomonas）、 嗜 甲 基 菌 屬（Methylophilus）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）等［7］。一般野生菌產(chǎn)PQQ在2～3 mg/L［8］，國(guó)內(nèi)外發(fā)酵法產(chǎn)PQQ的報(bào)道多數(shù)產(chǎn)量在每升幾毫克到幾十毫克［9-10］之間。Urakami等人優(yōu)化培養(yǎng)基成分后，利用生絲微菌TK0441在30 L發(fā)酵罐中發(fā)酵14 d，PQQ產(chǎn)量接近1 mg/mL［11］；在國(guó)內(nèi)，尹芳等在10 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)生絲微菌TH205，11 d后PQQ質(zhì)量濃度達(dá)26.6 mg/L［4］；熊向華等人在3 L發(fā)酵罐中利用食甲基菌MP688發(fā)酵6 d產(chǎn)量達(dá)到125 mg/L［5］；徐文等篩選到一株芽孢桿菌083114，可產(chǎn)PQQ 64.34 mg/L［12］。

作者從土壤中篩選到一株能利用甲醇產(chǎn)吡咯喹啉醌的菌株YHT-1，進(jìn)行了菌種鑒定、初步發(fā)酵條件優(yōu)化和發(fā)酵產(chǎn)物鑒定，確定 YHT-1屬于Methylopila屬（1998年由Doronina等［13］發(fā)現(xiàn)）菌株，發(fā)酵液分離純化后得到PQQ粗品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Methylopila sp.YHT-1由本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)CCTCC NO：M 2014016。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）K培養(yǎng)基［13］：硫酸銨 2.0 g/L，磷酸二氫鉀 2.0 g/L，氯化鈉 0.5 g/L，七水硫酸鎂 0.125 g/L，七水硫酸亞鐵0.002 g/L，甲醇4 g/L，pH 7.2，固體培養(yǎng)基加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂粉。

2）B培養(yǎng)基［14］：硫酸銨 3.0 g/L，磷酸二氫鉀 1.4 g/L，磷酸氫二鈉 3.0 g/L，硫酸鎂 0.2 g/L，檸檬酸鐵30 mg/L，氯化鈣 30 mg/L，氯化錳 5.0 mg/L，硫酸鋅5.0 mg/L，硫酸銅0.5 mg/L，甲醇6 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉。

3）種子培養(yǎng)基：氯化銨1 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸鎂 0.4 g/L，磷酸二氫鉀 1.4 g/L，磷酸氫二鈉 3 g/ L，甲醇7 g/L；pH 7.5。

4）發(fā)酵培養(yǎng)基：氯化銨5 g/L，酵母膏1 g/L，硫酸鎂2.1 g/L，磷酸二氫鉀 1.4 g/L，磷酸氫二鈉 3 g/ L，氯化錳 5 mg/L，葉酸 0.1 mg/L，甲醇 12 g/L；pH 7.0。

1.1.3 主要儀器和試劑 酶標(biāo)儀：BIOTEK公司產(chǎn)品；3k15冷凍離心機(jī)：Sigma公司產(chǎn)品；AKTA avant蛋白純化儀：GE公司產(chǎn)品；HPLC：HITACHI公司產(chǎn)品；色譜柱，Waters SunFireTMC18反向柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：Waters公司產(chǎn)品；PQQ標(biāo)準(zhǔn)品：武漢諾輝醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品。

1.2 菌株的分離

從無錫錫南農(nóng)藥廠附近采集土樣并制成適當(dāng)濃度的稀釋液，涂布于K培養(yǎng)基篩選平板，30℃靜置培養(yǎng)3～5 d，分別挑取不同形態(tài)的單菌落接種于裝有B培養(yǎng)基的試管，30℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)3～5 d，離心取發(fā)酵上清液。利用NBT－Gly化學(xué)法［14］快速檢測(cè)PQQ含量，再經(jīng)復(fù)篩并結(jié)合HPLC分析，最終確定一株P(guān)QQ產(chǎn)量較高的菌株YHT-1。

1.3 菌種鑒定

將菌株YHT-1在K培養(yǎng)基平板上劃線，置于30℃好氧培養(yǎng)2～3 d獲得單菌落，菌體形態(tài)特征利用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。底物利用實(shí)驗(yàn)主要參考 《Bergey's Manual○Rof Systematic Bacteriology》［15］和Doronina等［13，16-18］方法。至于16S rRNA序列分析，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取YHT-1的DNA，利用細(xì)菌通用引物27F：5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'；1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增該菌株的16S rDNA序列，PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，然后94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10 min。將PCR產(chǎn)物委托上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，用軟件ClustalX 1.81和MEGA 5.05進(jìn)行同源性比較，并利用鄰接法（Neighbor-Joining）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 利用YHT-1發(fā)酵產(chǎn)吡咯喹啉醌

將菌株YHT-1接種于B培養(yǎng)基斜面，30℃活化培養(yǎng)2 d，然后接種于種子培養(yǎng)基，35℃、200 r/ min培養(yǎng)20 h，按體積分?jǐn)?shù)4%接種到三角瓶或裝有2 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，35℃發(fā)酵3～5 d。發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為300 r/min，通氣量為120 L/h，發(fā)酵過程用氨水控制pH在5.5左右。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物的純化和提取

將發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min，再用微孔濾膜（如孔徑0.45 μm）過濾上清液，之后以2 mL/ min的流量通過20 mL的DEAE陰離子交換柱，用5倍柱體積的20 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液洗滌平衡，再以含有l(wèi) mol/L NaCl的檸檬酸鈉緩沖液梯度洗脫，洗脫體積為10倍柱體積。將初步純化后的濃縮液調(diào)pH為2.75，4℃結(jié)晶。

1.6 產(chǎn)物分析方法

1.6.1 HPLC條件 流動(dòng)相：12.5 mmol/L v（磷酸二氫鉀溶液）∶v（甲醇）=85∶15；進(jìn)樣量20 μL；流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃。

1.6.2 紫外吸收光譜 利用BIOTEK酶標(biāo)儀測(cè)定純化產(chǎn)物在200～400 nm的紫外光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離和鑒定

從多個(gè)土樣中篩選到30株菌株可產(chǎn)PQQ，再經(jīng)搖瓶復(fù)篩，HPLC測(cè)定得到菌株YHT-1產(chǎn)PQQ較高，可達(dá)30 mg/L。

YHT-1的菌落在K培養(yǎng)基平板上為乳白色，粘稠的，邊緣整齊，直徑1～2 mm。菌體細(xì)胞為（橢）球狀或桿狀（0.5～0.7 μm×0.9～1.4 μm）（圖1），革蘭氏陰性，不產(chǎn)芽孢，有莢膜，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。該菌株在以甲醇和甲胺為碳源的培養(yǎng)基中能夠良好生長(zhǎng)，微利用D-葡萄糖、醋酸鹽、丙酮酸鹽。在以銨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基以及LB培養(yǎng)基中均能良好生長(zhǎng)，甚至在不添加任何氮源的液體培養(yǎng)基中也能微生長(zhǎng)。YHT-1對(duì)鏈霉素和卡那霉素是敏感的，對(duì)氨芐西林具有抗性。過氧化氫酶和脲酶試驗(yàn)呈陽性，硝酸鹽還原、氧化酶試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生、硫化氫的產(chǎn)生、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、M-R和V-P試驗(yàn)均呈陰性。YHT-1與Methylopila jiangsuensis strain JZL-4、Methylopila sp. MUSA兩菌株相比，在革蘭氏染色、過氧化氫酶、產(chǎn)H2S、MR、VP、碳源利用（如甲醇、甲胺、二氯甲烷等）、氨芐西林抗性等方面完全相同，其它方面三者各不相同。

按照1.3方法得到1 391 bp長(zhǎng)度的核苷酸序列，在GenBank（GenBank KJ017968）上進(jìn)行BLAST分析，選取16S rRNA基因序列相似性較高的菌株及典型PQQ產(chǎn)生菌構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 （圖2）。菌株YHT-1與 Methylopila jiangsuensis strain JZL-4和Methylopila sp.MUSA兩株菌具有最高的相似性，均達(dá)99.5%，與同屬的另兩株菌Methylopila capsulata strain IM1和Methylopila helvetica strain DM9（T）的相似性分別為96%、87%。綜合菌落及菌體形態(tài)特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析，鑒定YHT-1為Methylopila sp.菌株。該菌屬于1998年由Doronina等［13］發(fā)現(xiàn)，目前，只有第二版的《Bergey's Manual○Rof Systematic Bacteriology》［15］（2005，Springer）Part C部分對(duì)該菌屬有所描述，其它分類專著未收錄該屬相關(guān)資料。該屬目前已有4個(gè)模式種，YHT-1與其主要的生理生化特征相符，最顯著的特征是YHT-1沒有鞭毛。

圖1 菌株YHT-1的掃描電鏡圖 （SEM：Quanta-200；25000×）Fig.1 Cell morphology of strain YHT-1（SEM：Quanta-200；25000×；bar，0.5μm）

2.2 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)PQQ的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基以甲醇為唯一碳源，分別以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨作為氮源，空白為不加任何氮源，發(fā)酵產(chǎn)PQQ。由圖3可以看出，當(dāng)?shù)礊榻湍父鄷r(shí)PQQ產(chǎn)量最高；無機(jī)氮源中以氯化銨為氮源時(shí)PQQ產(chǎn)量最高，其次是硝酸銨和硫酸銨。其中有機(jī)氮源牛肉膏和酵母膏更有利于菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.3 初始甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)PQQ的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中甲醇的添加體積分?jǐn)?shù)為0.3%～3%，間隔0.3%。發(fā)酵3 d后結(jié)果見圖4，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.9%～2.4%時(shí)均適宜該菌株發(fā)酵產(chǎn)生PQQ，最適的初始甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.5%；同時(shí)可以看出菌株在較廣甲醇體積分?jǐn)?shù)范圍可以較好生長(zhǎng)。

圖2 以16S rRNA基因序列為基礎(chǔ)的菌株Methylopila sp.YHT-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Methylopila sp.YHT-1 based on 16S rRNA sequences

圖3 不同氮源對(duì)PQQ產(chǎn)量和生物量的影響Fig.3 Effectofdifferentnitrogen sourceson the production of PQQ and biomass

2.4 鎂元素對(duì)發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸鎂的添加質(zhì)量濃度為0～3.0 g/L，間隔0.3 g/L。發(fā)酵3 d結(jié)果見圖5，不加硫酸鎂幾乎不會(huì)合成PQQ，添加過多的話也會(huì)抑制其合成，適宜添加質(zhì)量濃度范圍是0.3～2.4 g/L，最適為2.1 g/L；適當(dāng)增大硫酸鎂質(zhì)量濃度會(huì)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)pH維持也有一定作用。

圖4 不同初始甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)PQQ產(chǎn)量和生物量的影響Fig.4 Effect of different initial concentrations of methanol

圖5 不同硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)PQQ產(chǎn)量和生物量的影響Fig.5 Effect of different initial concentrations of MgSO4

2.5 初始pH值對(duì)產(chǎn)PQQ產(chǎn)量和生物量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH值分別調(diào)為 6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0，30℃發(fā)酵5 d。由圖6可以看出，菌株YHT-1具有較廣泛的生長(zhǎng)pH，最適為7.5；最利于PQQ合成的初始pH為7.0，大于7.5時(shí)其合成量迅速下降。

圖6 不同初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)PQQ的影響Fig.6 Effect of initial pH on the production of PQQ

2.6 不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)PQQ的影響

分別在25、30、35、37℃溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵5 d，結(jié)果見圖7。在35℃下，菌體更快更多的產(chǎn)生PQQ，最高質(zhì)量濃度達(dá)49 mg/L，此溫度下細(xì)胞生長(zhǎng)也最快；在25℃條件下，72 h以后PQQ的合成速率突然變快，原因可能是PQQ在較低溫度下更容易得到積累。

圖7 不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)PQQ產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of temperature on the production of PQQ

2.7 YHT-1在3 L發(fā)酵產(chǎn)吡咯喹啉醌曲線

經(jīng)搖瓶發(fā)酵條件初步優(yōu)化后，利用菌株YHT-1 在3 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵過程中，用氨水控制pH在5.5左右。結(jié)果見圖8，好氧發(fā)酵4 d，前期PQQ合成和菌體生長(zhǎng)基本保持同步調(diào)，但到發(fā)酵后期細(xì)胞停止生長(zhǎng)時(shí)仍在繼續(xù)產(chǎn)生PQQ，終質(zhì)量濃度可達(dá)113.6 mg/L，菌體濃度（A600 nm）在72 h之后便維持在14左右。由PQQ合成曲線看出，若延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，其濃度可能還會(huì)增加。

圖8 發(fā)酵過程PQQ質(zhì)量濃度變化及菌體生長(zhǎng)曲線Fig.8 Time Courses of PQQ concentration and OD600during the fermentation in a 3-L fermentor

2.8 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分析

按照1.5方法，最后得到呈棕紅色的PQQ粉末。將其溶解于蒸餾水，HPLC分析，產(chǎn)物和標(biāo)品的保留時(shí)間同為3.3 min；進(jìn)而測(cè)定紫外吸收光譜（圖9），產(chǎn)品和標(biāo)樣的峰形一致：在249 nm和326 nm處左右都有特征吸收峰，兩種分析方法都證實(shí)兩者為同一物質(zhì)。因而，純化產(chǎn)物即為吡咯喹啉醌，菌株YHT-1為PQQ產(chǎn)生菌。

圖9 PQQ粗品的紫外吸收光譜（上：PQQ標(biāo)樣；下：產(chǎn)物）Fig.9 UV spectra of PQQ product and standard sample

3 結(jié)語

吡咯喹啉醌是20世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)的繼吡啶核苷酸（NAD、NADP）和核黃素（FMN、FAD）的第三類輔酶，30多年的研究中，發(fā)現(xiàn)它具有多種重要生理功能，其研究?jī)r(jià)值已毋庸置疑。但關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)PQQ的報(bào)道還是偏少，主要限制因素是發(fā)酵產(chǎn)量偏低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，化學(xué)合成法又與當(dāng)今綠色環(huán)保的觀念相悖?；诖?，作者從土壤中篩選PQQ高產(chǎn)菌株，篩選到的 YHT-1被鑒定為Methylopila sp.新菌株，作者首次報(bào)道了Methylopila sp.中存在能向胞外分泌PQQ的菌株，不僅為Methylopila屬新菌種的發(fā)現(xiàn)及該屬分類提供一些參考數(shù)據(jù)，同時(shí)經(jīng)初步優(yōu)化搖瓶條件后，YHT-1發(fā)酵產(chǎn)PQQ質(zhì)量濃度有所提高，在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵4 d，產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)113 mg/L，屬于較高產(chǎn)量。通過優(yōu)化發(fā)酵工藝和采用誘變或基因工程手段改良菌種將有望進(jìn)一步提高其產(chǎn)量。

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Production of Pyrroloquinoline Quinone by Methylopila sp.YHT-1

YAO Hongtao， ZHENG Pu*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A pyrroloquinoline quinone-producing strain YHT-1 was isolated from the soil using methanol as a single carbon source in the screening medium.Based on morphological，physiological and biochemical characteristics，as well as 16S rRNA sequences，YHT-1 was classified as a novel strain of the genus Methyolpila.After the preliminary optimization of fermentation conditions，it could produce 113.6 mg/L PQQ in a 3 L fermenter after 4 days fermentation.Separation and purification of PQQ by the anion-exchange chromatography on DEAE Sepharose F.F.，the crude crystal was identified as PQQ according to HPLC and UV spectral analyses.

pyrroloquinoline quinone，Methylopila sp.，screening，identification，fermentation

Q 93

A

1673—1689（2016）07—0778—06

2014-06-18

鄭 璞（1966—），女，浙江金華人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程研究。

E-mail：zhengpu@jiangnan.edu.cn