隋曉辰， 張 玨， 郭慶彬， 崔武衛(wèi)， 劉艷芳， 夏詠梅*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室/化學(xué)與材料工程學(xué)院，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無錫2140631；3.圭爾夫食品研究中心，加拿大農(nóng)業(yè)部-農(nóng)業(yè)食品部，安達略N1G5C9）

深層發(fā)酵靈芝胞內(nèi)多糖的組成與結(jié)構(gòu)分析

隋曉辰1， 張 玨2， 郭慶彬3， 崔武衛(wèi)3， 劉艷芳1， 夏詠梅*1

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室/化學(xué)與材料工程學(xué)院，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無錫2140631；3.圭爾夫食品研究中心，加拿大農(nóng)業(yè)部-農(nóng)業(yè)食品部，安達略N1G5C9）

測定了深層發(fā)酵靈芝胞內(nèi)多糖的分子量和單糖組成，首次詳細分析了深層發(fā)酵靈芝胞內(nèi)多糖的結(jié)構(gòu)特性，為深入研究深層發(fā)酵靈芝多糖的生物活性及其構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)單糖組成分析和光譜初步解析，靈芝胞內(nèi)多糖是由5種單糖組成，其摩爾比為葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶木糖=83.75∶4.76∶4.15∶2.04∶5.30；通過IR、GC-MS、HPAE-PAD、NMR等分析其是以α-（1→4）位鍵合吡喃葡萄糖主鏈為主，以T-Glcp為主要的殘基，同時存在半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖的分支殘基。

靈芝；深層發(fā)酵；單糖組成；結(jié)構(gòu)分析

多糖是由多個單糖分子縮合、失水以糖苷鍵結(jié)合而成的大分子化合物，廣泛存在于生命體的細胞中，承擔(dān)著能量存儲、運輸以及結(jié)構(gòu)支撐等作用。許多多糖已被認為是免疫調(diào)節(jié)劑［1］和抗氧化劑［2］，同時它們的體外抗腫瘤活性已成為近年來的研究熱點［3-10］。靈芝多糖由于其具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和提高免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，兩千多年來一直受到人們的高度關(guān)注。很多研究已經(jīng)報道了不同結(jié)構(gòu)和來源的靈芝多糖的抗癌和免疫調(diào)節(jié)活性，例如子實體［11-13］、孢子［14-16］、固態(tài)發(fā)酵的菌絲體［17-20］、液態(tài)發(fā)酵的菌絲體［21-22］等。

靈芝多糖的生物活性強弱與其溶解度、相對分子質(zhì)量、分子組成、分子構(gòu)型、支化度、黏度等密切相關(guān)［23］。但是由于多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)本身就很復(fù)雜、微觀不均一性等使多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)難以得出完全正確的結(jié)構(gòu)式。大多數(shù)靈芝多糖主要通過 （1→3）、（1→4）和/或（1→6）-α/β糖苷鍵連接的葡聚糖，主要的單糖組分為葡萄糖，甘露糖，半乳糖，木糖，果糖和阿拉伯糖，相對分子質(zhì)量從幾千到上百萬不等［24］。目前對靈芝多糖的生物活性研究報道較多，但對其多糖結(jié)構(gòu)作全面深入的分析研究報道并不多見。深層發(fā)酵的胞外靈芝多糖比胞內(nèi)靈芝多糖分子量低的多，然而目前沒有報道胞內(nèi)靈芝多糖的詳細結(jié)構(gòu)特征。作者將靈芝多糖甲基化、乙酰基化反應(yīng)，通過高效液相色譜（HPLC）、脈沖安培-高效陰離子交換色譜（HPAE-PAD）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）、核磁共振（NMR）等對胞內(nèi)靈芝多糖的結(jié)構(gòu)特性進行了全面的研究，為研究靈芝多糖的生物活性及其構(gòu)效關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 發(fā)酵靈芝多糖（GLPs）：實驗室自制；乙醇、硫酸、碳酸鈉、苯酚等：均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司。透析袋（截留相對分子質(zhì)量500）：購自華美生物工程公司上海分公司；葡聚糖標準品：購于中國食品藥品檢驗所；靈芝子實體多糖（GLP-Fr，總糖含量95.9%）：上海農(nóng)科院食用菌研究所提供。

1.1.2 儀器 Waters 600高效液相色譜儀，配置Waters 600四元泵，2410示差折光檢測器：美國Waters公司產(chǎn)品；Dionex ICS-5000脈沖安培-高效陰離子交換色譜（HPAE-PAD）：美國Dionex公司產(chǎn)品；Finnigan trace DSQII氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國熱電公司產(chǎn)品；SP-2330色譜柱；Bruker ARX500核磁共振儀：瑞士Bruker公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝多糖的提取 靈芝深層發(fā)酵液經(jīng)高速離心后取菌絲體固體沉淀，將菌絲體洗凈、烘干；用組織搗碎機破壁，在95℃熱水提取3.5 h，離心取上清液；上清液超濾分離，再減壓蒸餾濃縮。用savage試劑除蛋白，用體積分數(shù)95%的乙醇分級醇沉，收集乙醇體積分數(shù)為80%的醇沉組分，經(jīng)過冷凍干燥后，即為胞內(nèi)多糖（GLP-In）。胞外（GLP-Ex）的制備參照文獻［21，25］，稍作修改，其中GLP-Ex僅是低相對分子質(zhì)量的多糖，GLP-Ex1是用體積分數(shù)80%乙醇溶液沉淀透析后得到的胞外多糖，兩者都用透析袋透析。

1.2.2 靈芝多糖總糖含量的測定 用苯酚-硫酸法檢測靈芝多糖的總糖含量［26］。

1.2.3 靈芝多糖的單糖組分和相對分子質(zhì)量測定

多糖的水解：稱取2 mg靈芝多糖，加入1 mL三氟乙酸（2 mol/L），封管，110℃下水解4 h。用碳酸鈉中和水液，過濾，冷凍干燥。蒸干后的殘留物在60℃下真空干燥8 h，然后置干燥瓶中冷卻備用。

靈芝多糖的單糖組成使用脈沖安培-高效陰離子交換色譜檢測（HPAE-PAD），檢測條件：色譜柱CarboPac PA20（3 mm×150 mm），淋洗液為5 mmol/ L NaOH，柱溫30℃，流量0.5 mL/min。根據(jù)標準單糖、GLPs中單糖的保留時間和出峰面積及內(nèi)標峰面積確定GLPs的單糖組成種類及物質(zhì)的量比。

相對分子質(zhì)量測定采用HPLC凝膠過濾法。Water 600Controller，2410RefractiveIndex檢測器，Waters UltrahydrogelTMLinear 7.8 mm×300 mm柱；流動相為0.1 mol/L NaNO3；流量0.9mL/min，進樣量10 μL。

1.2.4 IR分析胞內(nèi)靈芝多糖 取3 mg樣品，用溴化鉀壓片，測定范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5 GC-MS分析胞內(nèi)靈芝多糖 靈芝多糖經(jīng)過甲基化反應(yīng)、水解、NaBH4還原、乙?；确磻?yīng)處理后供GC-MS分析。檢測條件為：SP-2330色譜柱（Supelco公司；30 m×0.25 mm液膜厚度0.2 μm），程序升溫，160～210℃保持2℃/min，210～240℃保持5℃/min，氦氣流量1 mL/min。

1.2.6 NMR分析胞內(nèi)靈芝多糖 靈芝多糖溶解于Me2SO-d6/D2O（30 mg/mL）中，用BrukerARX500核磁共振儀測試。Me2SO作為內(nèi)標 （δH=2.50×10-6for1H）。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)和單糖組分

靈芝多糖GLP-In、GLP-Ex和GLP-Ex1總糖質(zhì)量分數(shù)分別為93.9%，94.96%和93.55%。不同來源的靈芝多糖它們的結(jié)構(gòu)特點是不同的，它們的相對分子質(zhì)量從幾千到百萬之間不等（表1）。

表1 靈芝多糖的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布Table1 Molecular weights and distribution of the GLPs

利用脈沖安培-高效陰離子交換色譜檢測（HPAE-PAD）深層發(fā)酵靈芝多糖的單糖組成 （表2）。GLP-In由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖5種單糖組成；其摩爾比為，葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶木糖=83.75∶4.76∶4.15∶2.04∶5.30，因此GLP-In的單糖組成以葡萄糖為主。GLP-Ex則由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和巖藻糖等單糖組成，各單糖摩爾比為葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶木糖∶巖藻糖=91.76∶1.83∶1.85∶3.02∶1.54。GLP-Ex1的單糖組成和摩爾比為葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶木糖∶巖藻糖=71.77∶10.40∶2.95∶5.33∶8.68∶0.86。與GLP-Ex一樣，GLP-Ex1中葡萄糖摩爾比最高，因此它們都以葡萄糖為主，而GLP-Fr僅由葡萄糖組成。

表2 靈芝多糖的單糖組成aTable2 Monosaccharide compositions of GLPs

2.2 靈芝多糖GLP-In的結(jié)構(gòu)分析

Liu［11］報道了從靈芝子實體中提取的β-葡聚糖（GLP-Fr）。在眾多深層發(fā)酵的靈芝多糖中GLP-In屬于高分子量的多糖，并且它的組成和結(jié)構(gòu)可能和GLP-Fr相似，但可能具有不同的生物活性。目前尚未見報道深層發(fā)酵的胞內(nèi)靈芝多糖GLP-In結(jié)構(gòu)特征，作者將利用IR、GC-MS、NMR手段來表征其結(jié)構(gòu)。

2.2.1 IR分析 胞內(nèi)靈芝多糖的紅外光譜見圖1。 3 400 cm-1處的寬峰為O-H伸縮振動峰，2 900 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為C-H的伸縮振動峰；1 643 cm-1處為O-H彎曲振動峰；1 369 cm-1處出現(xiàn)C-H變角振動峰；1 243 cm-1處吸收峰為C-O伸縮振動峰；1 153 cm-1處是C-O-C伸縮振動峰；1 024和1 079 cm-1處吸收峰為 O-H變角振動峰；1 153 cm-1為C-O-C伸縮振動峰。以上這些均為糖類的特征吸收峰。762 cm-1處為 D-吡喃葡糖糖的特征峰；929和857 cm-1處出現(xiàn)α-吡喃環(huán)糖苷鍵特征吸收峰，這表明GLP-In糖鏈由α-型糖苷鍵連接。

圖1 GLP-In的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of GLP-In

2.2.2 GC-MS分析 GLP-In經(jīng)甲基化并水解后的GC-MS的主要離子峰如下（表3）。

表3 胞內(nèi)靈芝多糖GLP-In的主要連接方式Table3 Main linkage patterns of the submerge-cultured intracellular GLP

表3表明，在GLP-In的骨架結(jié)構(gòu)主要的3個葡萄糖基連接型態(tài)為：T-Glcp（20.94%），4-Glcp （35.83%）和4，6-Glcp（10.87%），這和單糖組分的數(shù)據(jù)相吻合（見表2）。主要的糖殘基是葡萄糖，也檢測到少量的半乳糖、木糖和阿拉伯糖基的糖殘基。末端糖基 （T-Araf，T-Glcp和T-Galp）百分比之和為27.5%，而分支部分（3，5-Araf，3，4-Glcp，2，4-Glcp，3，6-Glcp，4，6-Glcp，3，6-Glcp，2，6-Glcp 和-3，4，6-Glcp0）為26.56%。

2.2.3 核磁共振分析 GLP-In的核磁共振譜圖更能清晰的表明其結(jié)構(gòu)特點（圖2）。1H-NMR譜顯示，質(zhì)子信號幾乎都出現(xiàn)在δ 3.30-5.50區(qū)間內(nèi)，這是典型的多糖信號，且H-1質(zhì)子化學(xué)位移δ＞4.95，可判斷為α型-鏈接的吡喃糖苷鍵構(gòu)型［28］。結(jié)合前面數(shù)據(jù)分析，作者提出一個α-葡聚糖狀結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖2 胞內(nèi)靈芝多糖GLP-In的1H-NMR譜圖Fig.21H NMR spectrum of GLP-In，four sugar residues were detected in anomeric region

圖3 胞內(nèi)靈芝多糖GLP-In的預(yù)計結(jié)構(gòu)Fig.3 Proposed structure of GLP-In

3 結(jié)語

從靈芝深層發(fā)酵液中獲得的靈芝胞內(nèi)外多糖和子實體多糖，經(jīng)單糖組成分析和光譜初步解析，胞內(nèi)外多糖的組成主要是葡萄糖，子實體多糖的單糖組成全部是葡萄糖，靈芝胞內(nèi)多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖這5種單糖組成，其摩爾比為葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶木糖= 83.75∶4.76∶4.15∶2.04∶5.30；通過IR、GC-MS、NMR等分析其是以α-（1→4）位鍵合吡喃葡萄糖主鏈為主，以T-Glcp為主要的殘基，同時存在半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖的分支殘基。胞內(nèi)多糖的組成和結(jié)構(gòu)的確定，為靈芝多糖樣本庫的建立提供了相關(guān)數(shù)據(jù)，也將為后續(xù)構(gòu)效關(guān)系的確立提供理論參考。

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Structure Features and Monosaccharide Composition of the Intracellular Polysaccharide from Submerge-Cultured Ganoderma lucidum

SUI Xiaochen1， ZHANG Jue2， GUO Qingbin3， CUI Steve W3， LIU Yanfang1， XIA Yongmei*1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology/School of College of Chemical&Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Nuclear Medicine of Ministry of Health，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China；3.Guelph Food Research Centre，Agriculture and Agri-Food Canada，Guelph N1G5C9，Canada）

The molecular weight and monosaccharide composition of intracellular polysaccharide from submerge-cultured Ganoderma lucidum（GLP）was investigated in this study，whose structure features was also thoroughly studied for the first time.This work could build a solid theoretical foundation for the further research on the biological activity and structure-activity relationship of GLP.The components of intracellular GLP were preliminary determined as glucose，galactose，mannose，arabinose and xylose with a molar ratio of 83.75∶4.76∶4.15∶2.04∶5.30 using monosaccharide composition analysis and spectrum analysis.The structure feature was confirmed with a backbone of 1，4-α-glucan and main terminal sugar residues of T-Glcp，and other branch residues containing galactose，mannose，xylose and arabinose by characterization of IR，GC-MS，HPAE-PAD and NMR，respectively.

Ganoderma lucidum，submerge-cultured，monosaccharide compositions，structure features

O 657.3

A

1673—1689（2016）07—0728—06

2015-01-04

國家自然科學(xué)基金項目（20875038，31371837）；2014年美大地區(qū)科研合作項目（5922059999140060）；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室2015自主研究課題（SKLF-ZZB-201504）。

夏詠梅（1965—），女，江蘇南京人，工學(xué)博士，教授，主要從事精細化品合成及生物催化研究。

E-mail：ymxia@jiangnan.edu.cn