趙 梅， 王春娟， 董運(yùn)海， 李劍芳*， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

重組β-甘露聚糖酶制備低聚葡甘露糖工藝條件的優(yōu)化

趙 梅1， 王春娟1， 董運(yùn)海1， 李劍芳*1， 鄔敏辰2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

研究了利用自主構(gòu)建的重組畢赤酵母菌株GS115/Auman26A所產(chǎn)β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制備低聚葡甘露糖的工藝條件。以底物魔芋粉的水解率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定酶法制備低聚葡甘露糖的酶解條件如下：加酶量60 U/g，酶解溫度40℃，魔芋粉質(zhì)量濃度30 g/L，酶解時(shí)間5 h。魔芋粉水解率和酶解液還原糖質(zhì)量濃度分別為53.3%和10.45 mg/mL。超濾后的酶解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜檢測可知組分主要以低聚葡甘露糖為主，其中還原性單糖占9.83%，二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。

重組β-甘露聚糖酶；魔芋粉；低聚葡甘露糖；超濾

魔芋是廣泛分布在我國云南、四川、貴州等地區(qū)的特有經(jīng)濟(jì)作物，目前在國內(nèi)主要作為一種粗纖維食物或食品添加劑使用。魔芋的主要活性成分為葡甘露聚糖，它是對魔芋進(jìn)行深加工利用的重要成分。魔芋葡甘露聚糖 （konjac glucomannan，KGM）是由葡萄糖和甘露糖按一定的摩爾比 （1∶1.6）以β-1，4糖苷鍵結(jié)合而成的雜多糖，在主鏈甘露糖的C3位置上存在以β-1，3糖苷鍵形成的分支結(jié)構(gòu)［1］。利用酶法水解魔芋粗提產(chǎn)品魔芋粉制備低聚葡甘露糖 （glucomannan-oligosaccharides，GMOS），既可拓寬魔芋的應(yīng)用范圍、提高原料的附加值，同時(shí)又可減少酸堿使用量，具有較好的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。

β-甘露聚糖酶 （EC 3.2.1.78），是一類能夠水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的內(nèi)切酶，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中［1］。目前，低聚甘露糖可由芽孢桿菌、黑曲霉、毛霉等微生物來源的β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖 （從魔芋、角豆膠及瓜爾豆膠等植物中提?。┲频茫?-3］，其結(jié)構(gòu)是由2～10個(gè)單糖分子通過β-1，4或β-1，3糖苷鍵連接而成。研究表明，低聚甘露糖可有效促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌等腸道有益菌群的特異性增殖，降低腸道pH以抑制有害菌的生長；可通過提高腸粘膜局部免疫力、增強(qiáng)動(dòng)物非特異性免疫、促進(jìn)肝臟分泌甘露糖結(jié)合蛋白來增強(qiáng)機(jī)體免疫力［4］；還具有改善血清脂質(zhì)、降低膽固醇和三酸甘油酯含量、不增加血糖濃度等特點(diǎn)［5］，是新一代功能性食品。

采用自主構(gòu)建的酵母工程菌GS115/Auman26A作為產(chǎn)重組β-甘露聚糖酶菌株，通過該重組酶降解魔芋葡甘露聚糖制備GMOS。與其他方法相比［6］，該方法具有產(chǎn)酶活性高、操作簡易、易分離純化及安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。作者以水解率為指標(biāo)，分別考察加酶量、酶解溫度、底物質(zhì)量濃度以及酶解時(shí)間對酶解過程的影響。通過控制水解率 （50%～60%）并結(jié)合膜分離法制備獲得GMOS，并利用高效液相色譜（HPLC）對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，以期為后期進(jìn)行單一組分的分析和進(jìn)一步精制研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也是為其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

魔芋粉，購自武漢靖江魔芋制品有限公司；畢赤酵母工程菌GS115/Auman26A，由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；D-甘露糖、角豆膠：購自Sigma公司；3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。YPD、BMGY 和BMMY培養(yǎng)基的配制參照 Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊。

1.2 β-甘露聚糖酶的制備

在 YPD平板上活化重組畢赤酵母 GS115/ Auman26A菌種，挑取重組子接種至BMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min培養(yǎng)至A600 nm值為2～4；4 000 r/min離心5 min收集菌體，將菌體重懸于BMMY液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h，每隔24 h添加一次甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%。誘導(dǎo)結(jié)束后8 000 r/min離心5 min收集上清液，同時(shí)測定β-甘露聚糖酶活性。

1.3 β-甘露聚糖酶的酶活性測定（DNS法）

采用改良的DNS法測定β-甘露聚糖酶活性。取2.4 mL 5 mg/mL角豆膠溶液 （pH 5.5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）于40℃預(yù)熱5 min后加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，40℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴中顯色7 min，加入5 mL去離子水混勻后測定 A540 nm。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖（以甘露糖計(jì)）所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.4 魔芋粉總糖含量測定

總糖是指樣品被酸完全水解后所有還原性單糖之和。測定方法：準(zhǔn)確稱取0.2 g魔芋粉，置于25 mL具塞試管內(nèi)，依次加入去離子水10 mL和0.5 mL濃H2SO4，于100℃水解2 h，冷卻后用NaOH溶液中和。將中和液轉(zhuǎn)移并定容至100 mL，濾紙過濾，取上清液1 mL用DNS法測定還原糖 （以甘露糖計(jì)）量，計(jì)算總糖量。

1.5 魔芋粉水解率測定

在魔芋粉中加入β-甘露聚糖酶液 （加酶量以U/g魔芋粉計(jì)），在一定條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，取樣，離心取上清適當(dāng)稀釋用DNS法測定酶解液中的還原糖 （以甘露糖計(jì)）量。

1.6 魔芋粉酶解條件試驗(yàn)

利用自主構(gòu)建的畢赤酵母工程菌 GS115/ Auman26A作為產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌種，以魔芋粉為底物酶解制備GMOS?？紤]到緩沖液會(huì)向體系帶入過多離子，故采用以去離子水代替緩沖液溶脹魔芋粉的方法［8］，以達(dá)到簡化后續(xù)產(chǎn)品精制工藝、減少酸堿使用量、降低生產(chǎn)成本及保護(hù)環(huán)境等目的。利用單因素試驗(yàn)分別探討加酶量、酶解溫度、底物質(zhì)量濃度以及酶解時(shí)間對酶解過程的影響，利用DNS法測定還原糖的含量，通過對水解率 （50%～60%）的控制，確定酶解魔芋粉的最優(yōu)條件。

1.7 酶解產(chǎn)物的制備與超濾分離

以優(yōu)化過的反應(yīng)條件進(jìn)行酶解反應(yīng)，將反應(yīng)完畢后的魔芋粉酶解液沸水滅酶、冷卻、離心，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后移至超濾裝置。選取截留相對分子質(zhì)量為2 000的超濾膜，在0.2 MPa的壓力下進(jìn)行超濾，收集超濾透過液。將收集的透過液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后凍干，即得GMOS干粉。準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量，計(jì)算GMOS得率。

1.8 酶解產(chǎn)物定性檢測

稱取凍干后的GMOS粉末水溶至終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，用HPLC檢測酶解產(chǎn)物中組分的構(gòu)成及含量。色譜條件：色譜柱Sugar-PakTM I（6.5 mm ×300 mm），柱溫85℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相：純水，檢測器：示差折光。根據(jù)GMOS保留時(shí)間定性，色譜峰面積歸一化法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-甘露聚糖酶活性及魔芋粉總糖量

利用DNS法測定同一批次畢赤酵母GS115/ Auman26A β-甘露聚糖酶的酶活性，其對角豆膠的酶活性為517.2 U/mL。由此可知，重組菌株GS115/ Auman26A具有極高的產(chǎn)酶活性，對工業(yè)化生產(chǎn)有著重要意義。0.2 g魔芋粉經(jīng)濃H2SO4徹底水解后，定容至100 mL，測定還原糖量，計(jì)算得魔芋粉中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.1%。

2.2 魔芋粉酶解加酶量的確定

在魔芋粉質(zhì)量濃度20 g/L、45℃水解4 h條件下，考察加酶量對魔芋粉水解率的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)?shù)孜锬в蠓哿砍渥?、其他條件固定，反應(yīng)體系不含有抑制酶活性的物質(zhì)時(shí)，酶促反應(yīng)的速率與酶濃度成正比。由圖1可知，當(dāng)加酶量在30～60 U/g范圍時(shí)，水解率和還原糖濃度隨著加酶量的增加而逐漸增加。當(dāng)加酶量為60 U/（g魔芋粉）時(shí)，水解率最高達(dá)到40.60%，還原糖質(zhì)量濃度為7.07 mg/mL，之后趨于平穩(wěn)。若加酶量不足，底物水解不充分；而過多的加酶量致使酶解速度過快，可將底物迅速降解為短鏈低聚糖，從而促進(jìn)了單糖生成的可能性?？紤]到生產(chǎn)成本及制備高含量的GMOS并盡量減少單糖含量的目的，所以需控制酶解過程的加酶量和酶解程度。因此，確定加酶量為60 U/g。

圖1 加酶量對魔芋粉水解率和還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of the enzyme dosage on hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration

2.3 魔芋粉酶解溫度的確定

向質(zhì)量濃度20 g/L的魔芋粉中添加60 U/（g魔芋粉）的β-甘露聚糖酶，置于不同溫度下水解4 h，考察酶解溫度對魔芋粉水解率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖可見，該酶在35～45℃時(shí)魔芋粉的水解率和還原糖質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，在40℃時(shí)魔芋粉水解率和還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到最高，分別為41.4% 和7.20 mg/mL；當(dāng)溫度為50℃時(shí)，酶解能力迅速降低。通常酶的作用速率隨溫度的升高而升高，但溫度過高會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，使其部分失活直至完全失活。據(jù)之前報(bào)道顯示，該酶的最適溫度為40℃且具有良好的穩(wěn)定性，之后酶活性隨溫度的升高而逐漸降低，45℃時(shí)相對酶活性為88.2%，而50℃的相對酶活性迅速下降為37.7%。由此可知，在40℃下具有最高反應(yīng)速率，并可長時(shí)間發(fā)揮作用且保持較高活性，故確定酶解反應(yīng)溫度為40℃。

2.4 魔芋粉酶解底物質(zhì)量濃度的確定

取20 mL不同質(zhì)量濃度的魔芋粉溶液，分別加入60 U/g的β-甘露聚糖酶，于40℃反應(yīng)4 h，考察底物質(zhì)量濃度對魔芋粉水解率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖可見，當(dāng)魔芋粉質(zhì)量濃度在5～30 g/L之間時(shí)，還原糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)急速上升趨勢，隨后增加逐漸減慢；隨著魔芋粉質(zhì)量濃度增加，水解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，水解率最高可達(dá)42.70%；隨后逐漸降低，其原因可能是由于魔芋粉質(zhì)量濃度的不斷增加導(dǎo)致其粘度的增加，阻礙了酶與魔芋粉的接觸，從而降低其酶解作用。但由于酶解反應(yīng)可以在短時(shí)間內(nèi)迅速減低魔芋粉的粘度，因此在工業(yè)生產(chǎn)上可以批量添加魔芋粉的方式，從而獲得高質(zhì)量濃度的酶解液。

圖2 酶解溫度對魔芋粉水解率和還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration

圖3 底物質(zhì)量濃度對魔芋粉水解率和還原糖濃度的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the hydrolysis rate ofkonjac powder and reducing sugar concentration

2.5 魔芋粉酶解時(shí)間的確定

向質(zhì)量濃度為30 g/L魔芋粉溶液中加入60 U/g 的β-甘露聚糖酶，于40℃反應(yīng)，每隔1 h取樣測定還原糖量，考察酶解時(shí)間對魔芋粉水解率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖可見，當(dāng)加酶量一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解率和還原糖質(zhì)量濃度逐漸增加。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)，還原糖質(zhì)量濃度和水解率逐漸平穩(wěn)，還原糖質(zhì)量濃度為10.45 mg/mL，其中水解率達(dá)到60.1%，極大程度提高了魔芋粉的利用率。β-甘露聚糖酶總是優(yōu)先作用長鏈甘露聚糖，其活性隨甘露聚糖鏈長的降低而降低。隨著時(shí)間的延長，當(dāng)?shù)孜镏心鼙挥行獾拈L鏈甘露聚糖完全水解，酶轉(zhuǎn)而攻擊短鏈低聚糖促使還原性單糖生成量增加，為充分提高底物的利用率并控制水解率為50～60%，故選擇酶解時(shí)間為5 h。

圖4 酶解時(shí)間對魔芋粉水解率和還原糖濃度的影響Fig.4 Effect of time on the hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration

2.6 酶解產(chǎn)物組分分析

膜分離過程的實(shí)質(zhì)是依據(jù)濾膜孔徑的大小使得原料側(cè)組分有選擇性地透過膜，而達(dá)到物質(zhì)分離、提純和濃縮的目的。按分離粒子或分子大小將膜分離法分為：反滲透、透析、電滲析、納濾、超濾、微濾6種。反滲透和納膜過濾有望用于功能性低聚糖的分離。作者采用超濾方法將十糖以內(nèi)的GMOS與甘露聚糖酶、淀粉、纖維素、高聚合度葡甘露聚糖及少量菌體進(jìn)行分離。

粗糖液先經(jīng)10 000 r/min高速離心、0.45 μm微孔濾膜過濾后移至超濾裝置，再經(jīng)超濾膜超濾以有效地控制產(chǎn)物相對分子質(zhì)量。收集超濾透過液，濃縮、冷凍、干燥，按照公式（3）計(jì)算其產(chǎn)率為48.1%。

用HPLC檢測酶解產(chǎn)物的組分構(gòu)成及含量，結(jié)果如圖5所示。甘露糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為13.765、12.288 min（譜圖未給出），由此可知M為甘露糖，G為葡萄糖。比較圖中出峰的保留時(shí)間，可知各種糖是按照相對分子質(zhì)量從大到小規(guī)律出峰，HPLC色譜圖中自左向右分別是GMOS、葡萄糖和甘露糖。其中還原性單糖含量占9.83%，二糖以上的GMOS占90.17%。酶解液經(jīng)超濾膜過濾后，截留的基本是聚合度為十糖以內(nèi)的GMOS。研究證明，β-甘露聚糖酶作用于魔芋膠或角豆膠的作用位點(diǎn)是多糖鏈非還原端的第3或第4個(gè)糖分子。雖然不同來源的β-甘露聚糖酶對底物的作用深度不同，但主要產(chǎn)物是甘露低聚糖，相對來說，很少產(chǎn)生單糖［14］。

圖5 魔芋粉酶解產(chǎn)物組分的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of enzymatic hydrolysate fractions from konjac powder

3 結(jié)語

我國魔芋資源豐富，但所開發(fā)的魔芋產(chǎn)品品種有限，目前主要作為粗纖維食物或食品添加劑使用，采用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)高附加值的魔芋產(chǎn)品具有重要意義。利用微生物產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶水解魔芋制備GMOS，可極大地拓寬魔芋應(yīng)用范圍、提高其附加值，且安全環(huán)保。采用自主構(gòu)建的重組畢赤酵母工程菌GS115/Auman26A作為產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株，具有產(chǎn)酶活性高、易分離純化等優(yōu)點(diǎn)。以底物魔芋粉的水解率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定酶法制備低聚葡甘露糖的酶解條件如下：加酶量60 U/g，酶解溫度40℃，魔芋粉質(zhì)量濃度30 g/L，酶解時(shí)間5 h。在優(yōu)化條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，測得魔芋粉水解率和酶解液還原糖質(zhì)量濃度分別為53.3%和10.45 mg/mL。超濾后的酶解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜檢測可知，組分主要以十糖以內(nèi)的GMOS為主，其中還原性單糖含量占9.83%，二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。作者所建立的生產(chǎn)工藝操作簡單，成本較低，生產(chǎn)流程不對環(huán)境造成污染，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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Optimization of Hydrolytic Conditions for Glucomannan-Oligosaccharides by Recombinant β-Mannanase

ZHAO Mei1， WANG Chunjuan1， DONG Yunhai1， LI Jianfang*1， WU Minchen2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The hydrolytic conditions of konjac powder were optimized for glucomannanoligosaccharides （GMOS） by recombinantβ-mannanase produced from Pichia pastoris GS115/Auman26A.The condition was optimized using the single factor test with the hydrolysis rate of substrate as the index.The optimized enzymatic condition was determined to use 60 U enzyme per gram konjac powder and 30 g/L konjac powder at 40℃for 5 h enzymolysis.The hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration were 53.3%and 10.45 mg/mL，respectively.The enzymatic hydrolysate after ultrafiltration was detected by high performance liquid chromatography （HPLC）.The hydrolysate was mainly composed by glucomannan-oligosaccharides，including 9.83% reducing monosaccharide and 90.17%glucomannan-oligosaccharides.This research can greatly improve the added value of konjac powder and lay the research foundation for further refining and functionalization of GMOS.

β-mannanase，glucomannan-oligosaccharides，konjac powder，ultrafiltration

Q 78

A

1673—1689（2016）07—0704—05

2015-01-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271811）。

李劍芳（1965—），女，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，主要從事食品與生物技術(shù)研究。E-mail：lijf@163.com