高桂玲， 成家楊

（北京大學 深圳研究生院，廣東 深圳 518055）

硝氮質量濃度和溫度在不同培養(yǎng)模式下對雨生紅球藻生長的影響

高桂玲， 成家楊*

（北京大學 深圳研究生院，廣東 深圳 518055）

探究了自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下，硝氮質量濃度和生長溫度對雨生紅球藻生長的影響，以及自養(yǎng)脅迫階段不同脅迫溫度（30，35，38℃）對蝦青素積累的影響。研究結果表明：雨生紅球藻在異養(yǎng)條件下的最高生物量（3.319 g/L）遠高于自養(yǎng)條件下最高生物量（0.687 g/L），生物量提高了84%。自養(yǎng)條件下蝦青素最高質量分數(shù)為2.264%，異養(yǎng)條件下蝦青素最高質量分數(shù)為3.199%，比自養(yǎng)條件下蝦青素最高質量分數(shù)提高41.29%。異養(yǎng)生長具有明顯的生長優(yōu)勢，此條件下最適碳源為乙酸鈉質量濃度1.5 g/L，最適硝氮質量濃度濃度為0.5 g/L，最適生長溫度為22℃，最佳脅迫溫度為30℃。

自養(yǎng)；異養(yǎng)；硝氮；溫度；雨生紅球藻

蝦青素（Astaxanthin）是一種具有多種生物活性的紅色非維生素A源的酮類胡蘿卜素。它的還原能力是類胡蘿卜素的10倍、維生素E的100～550倍［1］，在醫(yī)藥、保健、化妝品、食品以及飼料添加劑等方面都有廣泛的應用前景［2］。在蝦青素的生物來源中，雨生紅球藻（Heamatococcus lacustris）中蝦青素可占其干質量的l%以上，是目前已知的蝦青素含量最高的生物物種［3-4］，且體內蝦青素及其酯類的結構配比與養(yǎng)殖對象所需一致，因此被公認為自然界中蝦青素的最佳來源［5］。2010年，根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》規(guī)定，批準雨生紅球藻作為新資源食品，具有廣泛的應用前景。同時，雨生紅球藻還是研究次生類胡蘿卜素（secondary carotenoids）的生物合成與基因表達［6］以及細胞的感光與運動的良好材料［7］。探究環(huán)境因素對雨生紅球藻的影響，提高營養(yǎng)細胞的生長密度，已成為目前國際上應用研究的熱點。

在眾多環(huán)境因素中，硝氮質量濃度和生長溫度對雨生紅球藻的生長起著至關重要的作用，但由于不同研究者采用的培養(yǎng)方法和藻種的差異，導致實驗結果不盡相同［7］。據(jù)報道，雨生紅球藻既能進行光合自養(yǎng)，又能利用有機碳源進行化能異養(yǎng)生長［8］，作者主要針對硝氮質量濃度和生長溫度對自養(yǎng)和異養(yǎng)兩種營養(yǎng)方式下雨生紅球藻生長的影響進行對比，旨在探究雨生紅球藻最適的營養(yǎng)方式以及最優(yōu)生長條件，為雨生紅球藻高密度生長提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

實驗所用雨生紅球藻Heamatococcus lacustris藻種：武漢水生所提供。

1.2 所用藥品及儀器

紫外分光光度計（UV-1800）：北京佳源興業(yè)科技有限公司產品；離心機（5810R）：深圳市萬千科技有限公司產品；電熱恒溫水浴鍋（HWS-12）：上海一恆科學儀器有限公司產品；隔膜真空泵（GM-0.5B）：天津市津騰實驗設備有限公司產品；智能型人工氣候箱（MGC-450HP-2）：上海一恆科學儀器有限公司產品；Clever Chem 200全自動間斷化學分析儀（GRS-10705-01-B）：深圳朗誠實業(yè)有限公司產品。

1.3 實驗設計

1.3.1 硝氮濃度及生長溫度對自養(yǎng)條件下雨生紅球藻生長的影響 培養(yǎng)基選用BG-11，所用試驗器皿先經浸泡，高壓滅菌，冷卻后使用。試驗操作均在超凈工作臺無菌條件下進行。將處于對數(shù)生長期的海洋微藻接種于250 mL的三角瓶中進行一次性培養(yǎng)，體積分數(shù)10%接種。將裝有藻細胞的三角瓶置于植物培養(yǎng)箱中，分別設置22、25、28℃3個生長溫度，每個溫度下設置0、0.5、1、1.5、3 g/L硝氮質量濃度梯度，每個樣品設3組平行。設置培養(yǎng)條件為：光照強度約為2 500 lx、pH約為7.5，光暗比為12 h光照：12 h黑暗，每天搖動三角瓶3次，以防止藻細胞附壁沉淀，且變換三角瓶位置—使其光照均勻，培養(yǎng) 7d，測定雨生紅球藻的生物量，葉綠素a含量及NO消耗情況。

1.3.2 異養(yǎng)條件下碳源的選擇 用BG11做基本培養(yǎng)基，選取不同種類常見碳源對雨生紅球藻進行異養(yǎng)培養(yǎng)，以生物量為指標，選取能維持該藻異養(yǎng)生長的碳源。

1.3.3 硝氮質量濃度及生長溫度對異養(yǎng)條件下雨生紅球藻生長的影響 培養(yǎng)基選用BG-11，所用試驗器皿先經浸泡，高壓滅菌，冷卻后使用。試驗操作均在超凈工作臺無菌條件下進行。將處于對數(shù)生長期的微藻接種于250 mL三角瓶中進行一次性培養(yǎng)，接種率為體積分數(shù)10%。將裝有藻細胞的三角瓶置于植物培養(yǎng)箱中，分別設置22、25、28℃3個生長溫度，每個溫度下設置0、0.5、1、1.5、3 g/L硝氮質量濃度梯度，每個樣品設3組平行。設置培養(yǎng)條件為：以1.5 g/L醋酸鈉為有機碳源，pH約為7.5，黑暗培養(yǎng)，每天搖動三角瓶3次，以防止藻細胞附壁沉淀，培養(yǎng)7 d，測定雨生紅球藻的生物量，葉綠素a含量及NO消耗情況。

1.3.4 脅迫溫度對蝦青素積累的影響 Fabregas等的研究結果［9-11］表明，隨著硝酸鉀濃度的提高，蝦青素含量降低。這說明，雨生血球藻轉化產蝦青素需要較低濃度的氮源，尤其在缺氮條件下，可以大量積累蝦青素。故將1.3.1、1.3.2中各個樣品在培養(yǎng)7 d后離心，重新接種到沒有氮源的BG11培養(yǎng)基，直接放入光強為 5 000 lx，設置脅迫溫度分別為 30、35、38℃。脅迫7 d之后，測定蝦青素含量。

1.4 吸光度值與生物量的標準曲線

預培養(yǎng)微藻3～5 L，待其生長至對數(shù)生長期后，將其離心收獲，用蒸餾水洗滌兩次，把待測藻液分為6份，每份約300 mL左右，分別加入蒸餾水或者離心濃縮得不同濃度，測量每份藻液的吸光度A值［12］。從各濃度梯度中取100～400 mL藻液V，用玻璃砂芯真空抽濾，濾膜為Whatman玻璃纖維濾膜（GF/C Cat No.1822-47），孔徑1.2 μm。抽濾前對濾膜進行稱重m1，抽濾后將濾膜移至烘箱，65℃烘干12 h至恒重，再次稱重m2。用（m2-m1）/V得到吸光度為A時每升微藻的干質量m。根據(jù)各梯度濃度的A與對應的m值，利用excel軟件繪制A-干質量標準曲線。

1.5 藻液葉綠素a的測定--超聲輔助熱乙醇提取法測定葉綠素a

取對數(shù)生長期藻液10 mL過0.45 μm混合纖維素膜，將帶藻細胞的膜冷凍過夜，取出后迅速用8 mL熱乙醇（80℃）于熱水?。?0℃）中萃取2 min，將萃取液超聲破碎5～20 min后，于暗處靜置2～6 h，離心（5 000 r/min，4℃）5 min后取上清液3.5 mL置于比色皿中，于665，750 nm處測吸光值A665b和A750b，然后滴加200 μL 1 mol/L鹽酸酸化，5 min后于波長665和750 nm處再測吸光值A665a和A750a［13］。

根據(jù)Lorenzen公式計算單位樣品中葉綠素a質量濃度：

葉綠素a質量濃度：c=AK（A665b-A665a）υ/VL，

A665b=（A665b-A750b），A665a=（A665a-A750a）。

其中，c為葉綠素質量濃度；A為不同萃取溶劑中葉綠素a的比吸光系數(shù)；K為常數(shù)，為純葉綠素a酸化前的光密度與酸化前后的光密度變化的比值；υ為提取液體積（mL）；V為樣品的體積（L）；L為比色杯光程長度 （cm）；采用熱乙醇為萃取溶劑，A= 11.5，K=2.43，比色皿光程為1 cm，則公式（1）可簡化為：葉綠素a（μg/L）=27.9（A665b-A665a）υ/V

1.6 蝦青素的測定

移取5 mL孢子態(tài)的藻體，5 000 r/min離心10 min，除上清液，收集藻體。加入1 mL甲醇-KOH溶液 （體積分數(shù)30%甲醇和質量分數(shù)5%KOH混合液）震蕩，使藻種均勻分散后置 65℃恒溫水浴中加熱 15 min，4 000 r/min，離心15 min，除上清液；沉淀加蒸餾水離心洗滌2次，去除殘留堿液。上述藻體，加入5 mL二甲基亞砜，200 W超聲波破碎 10 min，40℃震蕩提取20 min，離心收集上清液，沉渣加入二甲基亞砜重復提取，直至藻體沉淀變白，取紅色上清液測A490 nm［14］。

蝦青素質量濃度：C=4.5×A490×Va/Vb

其中：C為蝦青素質量濃度，mg/L；A490為上清液在490 nm吸光值；Va為提取液體積，mL；Vb為藻液體積，mL。

每隔5 d取2 mL藻體液于離心管，4 000 r/min離心3 min，取上清液，采用Clever Chem200全自動間斷化學分析儀進行NO離子測定，以蒸餾水為對照標準。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用EXCEL 2000和SPSS 11.5進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差（mean±SD）的形式表示，顯著水平為0.05。

2 結果與討論

2.1 硝氮及溫度對雨生紅球藻生物量的影響

通過研究雨生紅球藻生長的吸光度值與干質量之間的線性關系，可為量化評估生物量提供計算依據(jù)。雨生紅球藻生長吸光度值與其干質量之間的關系，可用線性方程y=0.996 0x+0.292 7來表征，其中y表征干質量 （g/L），x表征藻液在680 nm處吸光度，R2值為0.999 4，線性擬合度較好。以下研究中所涉及的生物量均通過測定OD值并進行線性擬合所得。

2.1.1 硝氮及溫度在自養(yǎng)條件下對雨生紅球藻生物量的影響 圖1為自養(yǎng)條件下在22、25、28℃培養(yǎng)溫度下各硝氮濃度組的生長曲線，經過7 d的培養(yǎng)，各組生長至對數(shù)期并出現(xiàn)明顯差異 （P＜0.05）。22℃條件下最高生物量在0.282～0.687 g/L范圍內，25℃條件下最高生物量在0.191～0.600 g/L范圍內，28℃條件下最高生物量在0.195～0.393 g/L范圍內，比較各個溫度下的最高生物量可知，22℃生長溫度下生物量最高，為0.687 g/L，其次是25℃，28℃生長溫度下生物量最小，為0.393 g/L。說明雨生紅球藻適宜的生長溫度為22℃，溫度過高會抑制藻體生長，表現(xiàn)為生物量不高，這與殷明炎等［15］的實驗結果一致。

圖1 自養(yǎng)條件下生物量變化曲線Fig.1 Dry weight in autotrophic mode

同一溫度下，隨著硝氮質量濃度的增高，生物量呈遞減趨勢。0.5 g/L組表現(xiàn)明顯的生長優(yōu)勢，生物量高于其他組（P＜0.05），22℃條件下，對數(shù)末期最高生物量可達0.687 g/L，是3 g/L（22℃）對數(shù)末期生物量的2倍。在培養(yǎng)前3 d，1 g/L組、0.5 g/L和1.5 g/L組生物量相差不多（P＞0.05），生長速率（斜率）也相差不多（P＞0.05），但比較3 g/L高氮組要高，說明在培養(yǎng)初期微藻在確保正常生長的氮濃度范圍內利用氮元素進行快速生長繁殖，過高的氮濃度下細胞生長繁殖速率反而下降。3 d后各組生物量開始差別，0.5 g/L組生物量開始明顯高于其他各組，且3 g/L組在培養(yǎng)3 d后生物量均開始下降，表現(xiàn)出明顯的高氮抑制現(xiàn)象，藻體開始發(fā)黃。而在小于1.5 g/L的各組中，生物量一直呈上升趨勢，進一步說明雨生紅球藻的耐受質量濃度為1.5 g/L，超過此質量濃度，藻體不能正常生長，綜合可知，自養(yǎng)條件下，0.5 g/L硝酸鈉為雨生紅球藻最適宜的氮質量濃度，這與Harker M等的研究結果一致［16］。

2.1.2 硝氮及溫度在異養(yǎng)條件下對雨生紅球藻生長的影響

1）雨生紅球藻異養(yǎng)碳源探究結果。由表1可以看出，選取乙酸鈉作為雨生紅球藻異養(yǎng)生長的碳源較合理。添加不同乙酸鈉時雨生血球藻的生長曲線如圖2。

表1 不同碳源做有機底物的生長試驗結果Table1 Growth on different carbon source

在添加乙酸鈉為碳源時，由圖2可以看出，雨生紅球藻能利用乙酸鹽在暗處進行異養(yǎng)生長，乙酸鹽的濃度對雨生紅球藻的生長有很大的影響，微藻只能忍受較低的有機物濃度，過高的乙酸鈉不但不能獲得高濃度的細胞密度，反而會影響細胞正常生長，這是由于在培養(yǎng)系統(tǒng)中具有強離子性的有機物（如乙酸鈉），培養(yǎng)液中的離子濃度就會增加，這就會明顯地抑制微藻的生長［15］。雨生紅球藻異養(yǎng)生長所需乙酸鈉添加量為1.5 g/L。

2）硝氮及溫度在異養(yǎng)條件下對雨生紅球藻生物量的影響 圖3表示異養(yǎng)條件下，以乙酸鹽為碳源，22、25、28℃培養(yǎng)溫度下各硝氮質量濃度組的生長曲線。經過9 d的培養(yǎng)，各組生長出現(xiàn)明顯差異。22℃條件下生物量在2.080～3.319 g/L，25℃條件下生物量在1.813～3.309 g/L，28℃條件下生物量在1.302～1.945 g/L，也就是說，雨生紅球藻在低溫度下較高溫下生長要好，表現(xiàn)為生物量較高。22℃下最高生物量是28℃條件下最高生物量的2倍。由此說明在本實驗條件下雨生紅球藻的最適生長溫度為22℃。

圖2 添加不同質量濃度乙酸鈉時雨生血球藻的生長曲線Fig.2 Growth of Heamatococcus lacustris on different sodium acetate concentrations

圖3 異養(yǎng)條件下雨生紅球藻干質量變化曲線Fig.3 Dry weightof Heamatococcus lacustris in heterotrophic mode

硝氮質量濃度對雨生紅球藻生物量的影響也不同。22℃時1.5 g/L組在接種后第二天開始無法正常生長，出現(xiàn)白色渾濁，藻體發(fā)白，說明藻體開始死亡，異養(yǎng)條件下，高氮會抑制藻細胞正常生長。其他各組變化趨勢一致，在培養(yǎng)第7 d各組進入穩(wěn)定期，生物量均達到最高，0.5 g/L組在培養(yǎng)期間表現(xiàn)出較明顯的生長優(yōu)勢，生長速率較其他組高，尤其在培養(yǎng)前3 d，是細胞快速生長繁殖時期，細胞在培養(yǎng)初期就表現(xiàn)出對氮質量濃度的選擇性，而在后期，各組生長速率（斜率）開始下降，高質量濃度的氮（1 g/L）抑制及低質量濃度（0.3 g/L）的缺氮都會減弱甚至影響藻細胞的生長。實驗對照組中，在完全無氮條件下，藻細胞仍表現(xiàn)有微弱生長。異養(yǎng)條件下小球藻的葉綠體是細胞內氮源儲庫之一，其他條件合適而僅缺氮源情況下，葉綠素降解釋放氮供細胞生長，起調節(jié)氮源作用。

2.2 硝氮及溫度對雨生紅球藻葉綠素a的影響

2.2.1 硝氮及溫度在自養(yǎng)條件下對雨生紅球藻對數(shù)末期葉綠素a的影響 生長溫度不同，對數(shù)末期細胞中葉綠素a的含量也不同，對于同一濃度而言，隨著生長溫度的升高，葉綠素a呈下降趨勢，22℃培養(yǎng)溫度下葉綠素含量明顯高于25℃和28℃（P＜0.05）；對于同一溫度而言，隨著氮質量濃度的升高，葉綠素a含量依次減少。綜合可知，22℃培養(yǎng)溫度下0.5 g/L組葉綠素a含量最高。隨著培養(yǎng)時間繼續(xù)，各組藻體開始進入脅迫階段，葉綠素a含量開始下降，細胞進入蝦青素積累階段，至培養(yǎng)結束，各組蝦青素含量最高，而葉綠素a含量均降至最低。

圖4 自養(yǎng)條件下對數(shù)末期葉綠素a質量濃度Fig.4 Chlorophyll a content in autotrophic mode

2.2.2 硝氮及溫度在異養(yǎng)條件下對雨生紅球藻對數(shù)末期葉綠素a的影響 圖5表示異養(yǎng)條件下在22、25、28℃培養(yǎng)溫度在生物量最高時各氮濃度組葉綠素a變化圖，由圖可以看出在對數(shù)期（即培養(yǎng)第7 d）葉綠素a含量均達到最大值，且葉綠素a含量隨著硝氮質量濃度的升高而增加，0.5 g/L組生物量比1 g/L組大，而葉綠素a含量比1 g/L組小，此時維持細胞快速生長的可能是由于葉綠素會分解藻細胞生長提供氮源，對于1 g/L組而言，并未出現(xiàn)氮缺乏狀態(tài)，所以葉綠素a含量降低不明顯，而對0.3和0.5 g/L組，氮在培養(yǎng)前幾天就已經消耗殆盡，處于氮缺乏狀態(tài)，所以葉綠素會分解，也就出現(xiàn)了0.5 g/L組生物量高于1 g/L組而葉綠素低于1 g/L組的現(xiàn)象。對于1.5 g/L組，由于藻體出現(xiàn)發(fā)白渾濁現(xiàn)象，所以葉綠素a均很小甚至是0。相比筆者之前做的自養(yǎng)實驗，異養(yǎng)條件下各組葉綠素a含量均比自養(yǎng)條件下小，這是由于異養(yǎng)和光合自養(yǎng)的環(huán)境條件不同，可使微藻所含的化學成分發(fā)生明顯的變化。在異養(yǎng)條件下，細胞的葉綠素含量是兼養(yǎng)時的1%，葉綠素a與b的比值及類胡卜素的含量都有所下降。至實驗結束，各組葉綠素a含量均降至最低。

圖5 異養(yǎng)條件下對數(shù)末期葉綠素a質量濃度Fig.5 Chlorophyll a content in heterotrophic mode

綜上，進一步說明，雨生紅球藻在異養(yǎng)條件下最適宜的生長溫度為22℃，最適宜的硝氮質量濃度為0.5 g/L。

2.3 雨生紅球藻對硝氮的利用情況

2.3.1 硝氮及溫度在自養(yǎng)條件下雨生紅球藻對硝氮的利用情況 圖6表示自養(yǎng)條件下在22、25、28℃培養(yǎng)條件下各組對硝酸根離子的消耗情況，由圖可以看出，在培養(yǎng)第一天消耗氮離子最多近50%，隨著培養(yǎng)進行，氮離子越來越少，以致達到缺氮狀態(tài)。其中，3 g/L組由于高氮抑制藻細胞生長不能有效利用氮離子而使培養(yǎng)基中有氮剩余。并且，在最適宜溫度22℃下消耗的氮離子多于其他溫度組，說明在最適宜溫度下可以促進藻細胞生長更有效地利用氮離子。微藻對硝氮的利用率在對數(shù)末期均已經達到95%以上，在細胞營養(yǎng)生長階段，細胞消耗了培養(yǎng)基中大部分的氮源，而在蝦青素積累階段，培養(yǎng)基中氮含量已經很少，說明缺氮或低濃度的氮［14］利于雨生血球藻蝦青素的積累。

圖6 自養(yǎng)條件下雨生紅球藻對NO消耗情況Fig.6 Consumption of nitric nitrogen in autotrophic mode

2.3.2 硝氮及溫度在自養(yǎng)異養(yǎng)條件下雨生紅球藻對硝氮的利用情況 圖7表示異養(yǎng)條件下在22、25、28℃培養(yǎng)溫度不同氮濃度組雨生紅球藻對氮離子的消耗情況。如圖可以看出3個溫度下微藻對氮離子的消耗趨勢相似，在培養(yǎng)第一天消耗氮離子最多，接近一半，之后的培養(yǎng)時間內微藻繼續(xù)消耗剩余的氮離子，對于1.5 g/L組，由于高氮抑制作用，藻細胞無法正常生長，所以氮離子基本不變。對于0.3 和0.5 g/L組，對數(shù)期時生物量最大，但氮離子剩余量很少，由上文可知，此時支持藻細胞積累蝦青素階段的氮源可能是由葉綠素分解提供，說明異養(yǎng)藻有利用更高氮濃度的潛力。而對于1 g/L組，由于出現(xiàn)氮抑制，藻細胞對氮離子的利用也受到影響，實驗結束時氮離子仍有剩余。

比較3個不同溫度下微藻利用氮離子情況可知，在較適宜生長的溫度下（22℃）藻細胞對氮離子的利用率高于不適宜藻細胞生長的高溫條件（28℃），進一步說明，在低溫下，微藻生長良好能夠更好地利用營養(yǎng)物質。

圖7 異養(yǎng)條件下雨生紅球藻對NO消耗情況Fig.7 Consumption of nitric nitrogen in heterotrophicmode

2.4 蝦青素產量

2.4.1 自養(yǎng)條件下蝦青素最終產量 圖8（a）、（b）、（c）分別表示自養(yǎng)條件下在3種（22，25，28℃）生長溫度下，各個脅迫溫度對蝦青素的積累產生的影響，結果顯示，22℃培養(yǎng)溫度下，35℃脅迫溫度下蝦青素的積累量明顯高于其他脅迫溫度 （P＜0.05），蝦青素最高含量出現(xiàn)在1.5 g/L、22℃組，為干質量的2.264%，缺氮培養(yǎng)基中藻體變紅較快，轉化時間較短的情況下有優(yōu)勢，最高積累量達到2.216%，但最終蝦青素含量低于1.5 g/L、22℃組，推測蝦青素的持續(xù)產生需要微量的氮源支持，具體機理還需進一步研究。25℃培養(yǎng)溫度下，缺氮培養(yǎng)基中藻體生物量雖然不高，但蝦青素質量濃度高于其他組，達到2.047%，可能是因為高溫生長條件下，細胞生長受到抑制，生物量不高，進而影響了蝦青素的積累。28℃培養(yǎng)溫度下明顯低于22℃及25℃各組蝦青素含量（P＜0.05），進一步說明而高溫對蝦青素含量的影響主要是通過降低生物量而影響蝦青素的產量的。0.5和1 g/L雖然生物量較高，但在各個脅迫溫度下均沒有變紅，缺氮組雖然生物量不高，但是單個細胞中蝦青素含量卻較高，分析認為藻細胞中的Rubisco可作為一個氮庫，為缺氮條件下細胞內蝦青素的積累提供了一定的氮源。綜合圖2～8，可知，蝦青素積累的最優(yōu)脅迫溫度為35℃，蝦青素含量最高出現(xiàn)在22℃培養(yǎng)溫度下的1.5 g/L組，最高可達干質量的2.264%。

圖8 不同脅迫溫度下蝦青素的質量分數(shù)Fig.8 Astaxathin content in autotrophic mode

2.4.2 異養(yǎng)條件下蝦青素最終產量

1）培養(yǎng)基中沒有有機物時的蝦青素產量 將對數(shù)末期的藻液離心重新接種到氮、有機物（乙酸鈉）均為0 g/L的BG培養(yǎng)基中，進行自養(yǎng)高溫脅迫，各個脅迫溫度對蝦青素的積累產生的影響，在22℃生長條件下，3種脅迫溫度（30，35，38℃）下均有蝦青素產生，蝦青素質量分數(shù)范圍在3.341～31.985 mg/g，最高蝦青素質量分數(shù)出現(xiàn)在0.5 g/L組，可達3.199%（干重），脅迫溫度取30℃。在25℃和28℃生長條件下，最高蝦青素質量分數(shù)分別為2.092%和1.053%，脅迫溫度均為35℃，但與30℃差別不大。出于成本及能源考慮，對于雨生紅球藻而言，最佳脅迫溫度為30℃。

3 個脅迫溫度下，各硝氮質量濃度組蝦青素質量分數(shù)規(guī)律一致，即在0.3～0.5 g/L范圍內，蝦青素質量分數(shù)隨著硝氮質量濃度的升高而增加。其中0.3，0.5 g/L組最高值在低溫時差別較大，在高溫時差別較小。在0.5～1 g/L范圍內，蝦青素質量分數(shù)隨著硝氮質量濃度的升高而降低。38℃脅迫時，各組蝦青素質量分數(shù)均不高，且無較大差別，并且藻體均出現(xiàn)渾濁，變黃。說明過高溫度不利于細胞積累蝦青素，還會破壞細胞結構，導致細胞死亡。

22℃生長條件下30℃脅迫，0.5 g/L組最高蝦青素質量分數(shù)為31.985 mg/g，是25℃生長條件下35℃脅迫1 g/L組的2倍，是28℃生長條件下30℃脅迫1g/L組的3倍。

2）培養(yǎng)基中存在有機物時的蝦青素產量 將對數(shù)末期的藻液離心重新接種到氮不存在且有機物（乙酸鈉）為1.5 g/L的BG培養(yǎng)基中，進行自養(yǎng)高溫脅迫。結果發(fā)現(xiàn)，至實驗結束（第21 d）脅迫溫度為30～35℃時，藻體未變紅，且出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，藻體越發(fā)發(fā)黃，而脅迫溫度為38℃時，由于溫度過高大部分藻體死亡，藻液發(fā)白且有大量沉淀。Ogbonna等在對微藻異養(yǎng)與自養(yǎng)相互交替的養(yǎng)殖系統(tǒng)的研究中指出，微藻從異養(yǎng)轉到自養(yǎng)狀態(tài)時，培養(yǎng)液中有機物濃度必須為零。因為此時細胞密度很高，光線穿透力低，如有機物存在，則異養(yǎng)生長占優(yōu)勢，達不到強化的效果，對于雨生紅球藻而言，達不到脅迫的目的，因此蝦青素產量可以忽略。

3 討論

蝦青素具有多種生物活性，在醫(yī)藥、保健、化妝品、食品以及飼料添加劑等方面都有廣泛的應用前景。雨生紅球藻細胞在環(huán)境脅迫時會由綠色游動細胞變?yōu)榧t色不動細胞，并開始積累蝦青素，是目前已知的蝦青素含量最高的生物物種，高濃度生物量對蝦青素積累有很大影響，如何提高在游動階段細胞的密度也是目前國內外研究的重點，雨生紅球藻可以進行光合自養(yǎng)，也可以利用有機碳源進行化能異養(yǎng)生長，在自養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)和轉化的雨生紅球藻生長速度慢，很難獲得較高的細胞濃度，在胞囊階段盡管細胞體積有所增加，但細胞生長速率很低，細胞數(shù)量很難再增長，這樣也導致蝦青素產量較低［18］。在嚴格異養(yǎng)條件下，細胞可以維持很長時間的綠色游動階段而達到較高的細胞濃度，作者探究了硝氮濃度及生長溫度在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下對雨生紅球藻生長的影響，通過對比旨在尋求雨生紅球藻的最佳生長條件及營養(yǎng)方式，為實現(xiàn)高密度培養(yǎng)提供基礎數(shù)據(jù)。

4 結語

探究了硝氮和生長溫度對雨生紅球藻在自養(yǎng)和異養(yǎng)兩種營養(yǎng)方式下的影響，結果表明：雨生紅球藻在異養(yǎng)條件下的最高生物量（3.319 g/L）遠高于自養(yǎng)條件下最高生物量（0.687 g/L），生物量提高了3.83倍，具有明顯的生長優(yōu)勢，而且異養(yǎng)條件節(jié)省能源，不需要光照，有很大的發(fā)展前景，只是由于雨生紅球藻對環(huán)境變化非常敏感，并且傳統(tǒng)的培養(yǎng)箱不能達到完全密閉，而且異養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中存在有機物，培養(yǎng)過程中很容易受到污染。如何提高技術，改善設備，實現(xiàn)生物量的進一步穩(wěn)定提高是下一步將解決的問題。

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Research on the Effects of Nitric Nitrogen and Temperature on Heamatococcus lacustris Under Different Cultural Modes

GAO Guiling， CHENG Jiayang*
（Shenzhen Graduate School，Peking University，Shenzhen 518055，China）

Autotrophic and heterotrophic growth and the effect of nitric nitrogen，temperature on Heamatococcus lacustris were investigated.The microalgae grew better in heterotrophic mode.In autotrophic and heterotrophic the biomass were 0.687 g/L and 3.319 g/L respectively，the astaxathin content were 2.264%and 3.199%，respectively.In heterotrophic，the optimum growth concentration of sodium acetate was 1.5 g/L，nitric nitrogen was 0.5 g/L，growth temperature was 22℃，the suitable stress temperature was 30℃.

autotrophic，heterotrophic，nitric nitrogen，temperature，Heamatococcus lacustris

TS 201

A

1673—1689（2016）07—0684—08

2014-09-20

國家自然科學基金重點項目 （81130070）；中國博士后科學基金項目 （2012M520106）；中國博士后特別資助項目（2013T60025）；深圳市戰(zhàn)略新興產業(yè)發(fā)展專項資金項目（CXZZ20120618111150009）。

成家楊（1962—），江西都昌人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事環(huán)境工程研究。E-mail：chengjy@pkusz.edu.cn