戰(zhàn) 欣， 于呈呈， 石耀華， 顧志峰，王愛(ài)民

(海南大學(xué)海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

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馬氏珠母貝msi60基因表達(dá)量與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)分析

戰(zhàn) 欣， 于呈呈， 石耀華， 顧志峰，王愛(ài)民*

(海南大學(xué)海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

[目的] 探討礦化基因、貝殼和珍珠經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)關(guān)系。[方法] 選擇47個(gè)培育優(yōu)質(zhì)珍珠的馬氏珠母貝，測(cè)量貝殼的殼寬、殼高、殼長(zhǎng)、絞合線長(zhǎng)、總殼重、左殼重、珠層厚度及珍珠的直徑、重量、珠層厚度，并分析礦化基因msi60在外套膜內(nèi)緣組織的相對(duì)表達(dá)量，珍珠經(jīng)濟(jì)性狀和貝殼經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)關(guān)系。[結(jié)果] 珍珠的珠層厚度、珍珠直徑和珍珠重量3個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀均與受體貝貝殼的殼寬、殼長(zhǎng)、總殼重和左殼重呈顯著相關(guān)，推測(cè)育珠貝的生長(zhǎng)狀況在一定程度上影響珍珠的培育；msi60在外套膜內(nèi)緣的相對(duì)表達(dá)量與珍珠重量之間存在相關(guān)性(P= 0.059)，貝殼和珍珠的珍珠層厚度存在顯著相關(guān)性(P= 0.019)，推測(cè)在馬氏珠母貝中，貝殼的礦化和珍珠的礦化可能具有共同的上游調(diào)控元件。[結(jié)論]msi60在形成貝殼珍珠質(zhì)層的外套膜內(nèi)緣組織中的基因表達(dá)量與珍珠的經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)。該研究為馬氏珠母貝生物礦化分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料。

貝殼；珍珠；經(jīng)濟(jì)性狀；殼基質(zhì)蛋白；馬氏珠母貝

馬氏珠母貝(Pinctadafucatamartensii)是培育海水珍珠的主要珍珠母貝，其貝殼具有珍珠質(zhì)層，可用于制作貝雕、珍珠粉，亦可作為珍珠的代用品供藥用和化妝品的制造[1]。目前，我國(guó)海水珍珠產(chǎn)業(yè)已成為廣東、廣西和海南部分地區(qū)重要的支柱性產(chǎn)業(yè)[2]，因此，對(duì)于馬氏珠母貝的遺傳育種和海水珍珠礦化過(guò)程的研究一直是熱點(diǎn)問(wèn)題。

馬氏珠母貝的貝殼由珍珠層和棱柱層組成，珍珠質(zhì)層是由外套膜內(nèi)緣的上皮細(xì)胞分泌的[3-5]，貝殼和珍珠的珍珠層組成成分完全相同。貝類貝殼的絕大部分由CaCO3晶體構(gòu)成，僅不到5%的組成成分是有機(jī)基質(zhì)，包括蛋白質(zhì)和多糖。蛋白質(zhì)是由貝類的外套膜組織分泌的，負(fù)責(zé)調(diào)控貝殼的形成[6]，mis60是參與貝殼珍珠質(zhì)層形成的蛋白之一，不溶于水，在形成貝殼珍珠質(zhì)層的外套膜內(nèi)緣組織中表達(dá)[3,5]。

馬氏珠母貝的研究主要包括遺傳育種[7-8]、插核育珠[9-11]、珍珠形成的分子機(jī)制研究[12-14],但很少將育珠貝的生長(zhǎng)性狀、珍珠的經(jīng)濟(jì)性狀和礦化基因表達(dá)量進(jìn)行綜合分析，探討育珠貝對(duì)珍珠形成的影響。筆者分析了msi60基因在馬氏珠母貝外套膜內(nèi)緣組織的基因表達(dá)量，貝殼經(jīng)濟(jì)性狀和珍珠經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)性，旨在為貝類生物礦化分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1樣品和數(shù)據(jù)收集馬氏珠母貝于2012年11月采自海南省陵水市馬氏珠母貝養(yǎng)殖場(chǎng)，從506個(gè)育珠貝中選取培育優(yōu)質(zhì)珍珠的馬氏珠母貝47個(gè)，將其外套膜內(nèi)緣組織放入RNAstore樣本保存液(天根生化科技有限公司，北京)中保存，后立即放入-80 ℃冰箱中存放。測(cè)量47個(gè)馬氏珠母貝貝殼的殼寬、殼高、殼長(zhǎng)、絞合線長(zhǎng)、總殼重、左殼重、珠層厚度以及所產(chǎn)珍珠的直徑、重量和珍珠質(zhì)層厚度。貝殼和珍珠的珍珠層厚度采用光學(xué)相干斷層掃描儀OSLF-1500(斯?fàn)栴D科技有限公司，深圳)測(cè)量。

1.2RNA提取和cDNA合成外套膜內(nèi)緣組織的RNA提取采用TRNzolA+總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。cDNA合成采用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，合成的cDNA稀釋6倍后保存于-20 ℃用于熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.3熒光定量PCR擴(kuò)增參考基因使用β-actin，其正向引物序列actin-F為GGTCACTCACACCGTGCCTAT，反向引物序列actin-R為GTGATGTCTCTTCCGGCTAGGT[15]。mis60基因熒光定量PCR的正向引物msi60-F為AGGTGGACGAAGAGGTAGAGGTAG，反向引物msi60-R為AGCGGCAGCGGCAACATC[16]。熒光定量PCR擴(kuò)增使用SuperReal PreMix (SYBR Green) (天根生化科技有限公司，北京)。熒光定量PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA,10 μL 2×SuperReal PreMix (添加SYBR Green染料),0.4 μmol/L 的正反向引物，PCR總體積為20 μL。熒光定量PCR程序：95 ℃變性15 min；95 ℃變性15 s，60 ℃ 運(yùn)行 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品的熒光定量PCR反應(yīng)重復(fù)3次，取平均值作為基因表達(dá)量的最終結(jié)果。采用溶解曲線法(60～95 ℃)檢測(cè)是否存在非特異性擴(kuò)增。

1.4數(shù)據(jù)分析計(jì)算貝殼和珍珠各個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最大值和最小值；基因表達(dá)量的結(jié)果分析采用ΔΔCT法[17]； 采用SPSS 15.0軟件(SPSS,Chicago,USA)估算msi60在外套膜內(nèi)緣組織的基因表達(dá)量與珍珠和貝殼經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)性。

2　結(jié)果與分析

2.1貝殼和珍珠的經(jīng)濟(jì)性狀47個(gè)馬氏珠母貝的貝殼和珍珠經(jīng)濟(jì)性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最小值和最大值見(jiàn)表1。由表1可知，珍珠的珠層厚度(0.32 mm)比貝殼的珠層厚度(0.94 mm)?。籱si60在外套膜內(nèi)緣組織的相對(duì)表達(dá)量在不同馬氏珠母貝個(gè)體中的差異較大(標(biāo)準(zhǔn)差 = 4.22)。

表1　珍珠和貝殼的經(jīng)濟(jì)性狀

2.2相關(guān)性分析msi60在外套膜內(nèi)緣組織的基因表達(dá)量與珍珠、貝殼經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，珍珠的珠層厚度、珍珠直徑和珍珠重量3個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀均與育珠貝貝殼的殼寬、殼長(zhǎng)、總殼重和左殼重具有顯著相關(guān)性。雖然表1中貝殼的珍珠質(zhì)層厚度比珍珠厚，但從表2可以看出，貝殼和珍珠的珠層厚度存在顯著相關(guān)性(P=0.019)。msi60在外套膜內(nèi)緣組織的相對(duì)表達(dá)量與珍珠重量存在相關(guān)性(P= 0.059)。

表2　msi60在外套膜內(nèi)緣組織的基因表達(dá)量與珍珠和貝殼經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)性

3　討論

3.1貝殼與珍珠經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)性分析影響貝殼和海水珍珠價(jià)值的品質(zhì)除色澤、大小等性狀外，還有一個(gè)比較特殊的性狀即珠層厚度[18]，在養(yǎng)殖珍珠分級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定了海水養(yǎng)殖珍珠珠層厚度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18781—2008)。珠層厚度越厚，珍珠的經(jīng)濟(jì)價(jià)值越高，但珍珠生長(zhǎng)在珍珠囊中，在不傷害育珠貝的前提下，很難檢測(cè)到珍珠的珠層厚度。該研究發(fā)現(xiàn)，珍珠的珠層厚度與貝殼的殼寬和殼長(zhǎng)等性狀呈顯著相關(guān)性，這為根據(jù)殼寬和殼長(zhǎng)等性狀推測(cè)珍珠的珠層厚度提供了可能。

Wada等[19]研究發(fā)現(xiàn)，育珠貝的貝殼重量與所產(chǎn)珍珠的重量呈正相關(guān)性，該研究也得到類似的結(jié)果。珍珠的珠層厚度、珍珠直徑和珍珠重量3個(gè)珍珠的經(jīng)濟(jì)性狀均與育珠貝貝殼的殼寬、殼長(zhǎng)、總殼重和左殼重具有顯著相關(guān)性，說(shuō)明馬氏珠母貝育珠貝的生長(zhǎng)速度越快，個(gè)體越大，貝殼越隆起，培育大型珍珠的可能性越高，推測(cè)育珠貝的生長(zhǎng)狀況在一定程度上影響珍珠的培育，在實(shí)踐中可以將貝殼的殼寬、殼長(zhǎng)等經(jīng)濟(jì)性狀作為育珠貝選擇育種的重要指標(biāo)。

3.2msi60相對(duì)表達(dá)量與經(jīng)濟(jì)性狀之間的相關(guān)性該研究發(fā)現(xiàn)，貝殼和珍珠的珍珠層厚度存在顯著相關(guān)性(P=0.019)，雖然珍珠和貝殼具有相同組成成分的珍珠質(zhì)層，但貝殼的礦化過(guò)程對(duì)于育珠貝而言是一個(gè)必需的生長(zhǎng)過(guò)程，而珍珠的形成對(duì)于育珠貝而言是一個(gè)排斥異物的免疫過(guò)程[18]，由于形成珍珠的珍珠囊是來(lái)源于小片貝的組織，其遺傳物質(zhì)與育珠貝不同，msi60基因在珍珠囊的表達(dá)和在外套膜內(nèi)緣的表達(dá)并不完全相同。另外，生物礦化受多基因調(diào)控且易受環(huán)境因素的影響，因此，該研究?jī)H發(fā)現(xiàn)msi60在外套膜內(nèi)緣的相對(duì)表達(dá)量與珍珠重量(P= 0.059)存在相關(guān)性。

該研究通過(guò)探討馬氏珠母貝珍珠、貝殼經(jīng)濟(jì)性狀和msi60在外套膜內(nèi)緣組織基因表達(dá)量之間的相關(guān)性，初步探討了生物礦化過(guò)程在珍珠形成和貝殼的珍珠質(zhì)層形成過(guò)程中的異同，為闡明生物礦化分子機(jī)制研究提供資料。

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Relationship between Gene Expression ofmsi60 and Economic Traits inPinctadafucatamartensii

ZHAN Xin,YU Cheng-cheng,SHI Yao-hua, WANG Ai-min*et al

(Marine Institute,Hainan University,Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education,Hainan Key Laboratory of Tropical Hydrobiological Technology,Haikou,Hainan 570228)

[Objective] The aim was to analyze the correlations among gene expression levels ofmsi60,economic trait of shell and economic trait of pearl oyster.[Method] A total of 47 pearl oysters that cultured high quality pearls were selected and ten traits (shell width,shell height,shell length,hinge length,total shell weight,left shell weight,thickness of shell nacreous layer,pearl diameter,pearl weight and thickness of pearl nacreous layer) of the selected samples were measured.The correlations among gene expression levels ofmsi60,economic traits of shell and economic traits of pearl were analyzed.[Result] All of the economic traits of pearls were significantly correlated with shell width,shell length,total shell weight and left shell weight.It was assumed that the growth status of host oyster affects pearl culture.It was found that gene expression levels ofmsi60 in mantle center were correlated with pearl weight(P=0.059).What’s more,thickness of shell and pearl nacreous layer were significantly correlated with each other(P=0.019).[Conclusion] Gene expression ofmsi60 is correlated with economic traits of pearl.The study will enrich the information for elucidating the molecular mechanism of biomineralization.

Shell; Pearl; Economic trait; Shell matrix protein;Pinctadafucatamartensii

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2010CB126405);海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(kyqd1216);海南大學(xué)青年基金項(xiàng)目(qnjj1227);海南省青年基金項(xiàng)目(313033)。

戰(zhàn)欣(1981- )，女，遼寧大連人，講師，博士，從事貝類育種和分子生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事貝類遺傳育種研究。

2016-06-27

S 968.3

A

0517-6611(2016)23-084-03