周　迪，楊旭夫，彭　凌，劉博婷

(韶關(guān)學院/粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所-韶關(guān)學院動物疫病診斷中心聯(lián)合實驗室,廣東韶關(guān) 512005)

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粵北地區(qū)梅花豬鏈球菌的分離鑒定和藥敏試驗

周迪，楊旭夫*，彭凌，劉博婷

(韶關(guān)學院/粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所-韶關(guān)學院動物疫病診斷中心聯(lián)合實驗室,廣東韶關(guān) 512005)

對來自粵北某梅花豬養(yǎng)殖基地存在的不同程度呼吸道癥狀和無癥狀梅花豬，采取鼻腔拭子進行細菌性疾病調(diào)查，通過對優(yōu)勢菌的觀察、分離純化、染色鏡檢、生理生化試驗和16 S rRNA基因序列比對分析，確定2株優(yōu)勢菌為豬鏈球菌。莢膜多糖抗原(CPS)基因分型確定1株為豬鏈球菌9型，另1株為28型。藥敏試驗結(jié)果表明，2株豬鏈球菌對12種抗菌藥物敏感，對17種抗菌藥物不敏感。

豬鏈球菌；16 S rRNA基因； CPS分型；藥敏試驗

豬鏈球菌(Streptococcussuis)不僅是一種重要的豬傳染性疾病病原菌，而且是一種人獸共患病的病原體，能引起豬和人腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎及其他疾病，其血清型眾多，在給世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失的同時[1-3]，對人類健康也構(gòu)成了巨大威脅。

畜禽品種資源是生物多樣性的重要組成部分[4]，梅花豬是聞名廣東的優(yōu)良地方豬種，因原產(chǎn)于韶關(guān)市樂昌梅花鎮(zhèn)而得名。該品種具有種豬利用年限長、適應(yīng)性強、耐粗飼、生長快、皮薄、肉嫩、味道鮮美等獨特的品質(zhì)，是國內(nèi)外許多品種所沒有的。有調(diào)查顯示，該品種豬繁殖性能出現(xiàn)下滑趨勢，數(shù)量銳減，已經(jīng)到了瀕臨滅絕的境地[5-6]。因此，除對梅花豬的品種資源、遺傳保種工作迫在眉睫外，對養(yǎng)殖過程中疾病的監(jiān)測和防控也顯得極其重要。我們對粵北某梅花豬養(yǎng)殖基地存在不同程度呼吸道癥狀的保育豬及不存在明顯癥狀的外表健康的保育豬、育肥豬采集鼻腔拭子，進行細菌性疾病的調(diào)查，結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料無菌采集粵北某基地存在嚴重和一般呼吸道癥狀的梅花豬保育豬，以及不存在明顯癥狀的健康保育豬和育肥豬鼻腔拭子共28份。

1.1.2培養(yǎng)基牛心浸汁瓊脂培養(yǎng)基，本實驗室自制；含馬血清的MH培養(yǎng)基，為商品培養(yǎng)基按照說明融化滅菌后，加入50 mL/L無菌馬血清傾倒平板制成。

1.1.3試劑細菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片,杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；TaKaRa ExTaq、 DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；基因組DNA抽提試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細菌的分離培養(yǎng)樣品棉拭子涂布接種于含100 mL/L馬血清的牛心浸汁瓊脂平板，37℃蠟燭缸培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。選取存在明顯優(yōu)勢菌的平板，挑取可疑單菌落接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板進行純化培養(yǎng)。從純化后的培養(yǎng)平板中挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢、形態(tài)觀察。

1.2.2生化試驗參照《伯杰氏細菌學鑒定手冊》豬鏈球菌的生化鑒定標準，用分離得到的菌株純培養(yǎng)物進行蔗糖、乳糖、蕈糖、山梨醇、菊糖、七葉甘、馬尿酸鹽、淀粉水解等生化試驗。

1.2.3細菌基因組DNA的提取從分離菌的純培養(yǎng)平板中挑取單菌落接種于血清營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，離心收集適量菌體?；蚪MDNA的提取按照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒說明書進行。

1.2.416 S rRNA基因序列鑒定參照文獻[7]，引用其設(shè)計的16 S rRNA基因引物，引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列信息為：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，產(chǎn)物長度約1 500 bp。反應(yīng)體系：10×ExTaqbuffer(Mg2+free) 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各1 μL, 基因組DNA模板(10 ng～100 ng)1 μL，TaKaRa ExTaq(5 U/μL)0.25 μL，加超純水定容至50 μL。反應(yīng)條件按文獻[7]中推薦的進行，產(chǎn)物經(jīng)檢測后寄送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5莢膜多糖抗原(CPS)基因分型鑒定用實驗室保存的分別對應(yīng)豬鏈球菌1、2、7、9型的豬鏈球菌引物CPS1J、CPS2J、CPS7H、CPS9H，對2株豬鏈球菌進行基因分型鑒定，引物序列信息參照文獻[8]，產(chǎn)物片段長度為別為637、498、379、303 bp。以及參照文獻[9]，合成文獻中的全部35對引物，采用兩步多重PCR法對上述1、2、7、9型引物不能鑒定的菌株重新分型鑒定，第一步用7重PCR將35種CPS型分為7個群，第二步用各群中相應(yīng)的型特異性引物進行多重PCR分型鑒定，產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6藥敏試驗采用紙片擴散法，將所分離到的菌株純培養(yǎng)物稀釋后均勻涂布于添加50 mL/L馬血清的MH平板上，按杭州濱和微生物試劑有限公司紙片法藥敏試驗操作方法,將抗菌藥物藥敏紙片貼于平板上。37℃厭氧培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。判定標準根據(jù)各菌屬藥物紙片說明進行。

2　結(jié)果

2.1豬源鏈球菌的分離、培養(yǎng)特性及涂片鏡檢觀察

2株優(yōu)勢菌在含有馬血清的牛心浸汁瓊脂上厭氧培養(yǎng)生長良好，能形成圓形、閃光、灰白色、半透明和邊緣整齊的小菌落，編號分別為MS1和MS2。革蘭染色均為陽性球菌，多呈單個存在，菌株MS1有少部分呈短鏈狀；菌株MS2部分呈中長鏈狀。

2.2生化試驗結(jié)果

分離菌株的生化特性如表1，查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》1998版，顯示2株優(yōu)勢菌符合豬鏈球菌生化特性。

2.316 S rRNA基因序列鑒定

如圖1所示，2個菌株均能擴增出預(yù)期大小的片段。測序結(jié)果經(jīng)DNA Baser軟件編緝后獲得有效序列長度分別為1 445 bp、1 421 bp，將編緝后的序列用Blast在線比對工具進行同源性比對，結(jié)果顯示,Identities值高達99%的菌株均為豬鏈球菌，從而確定2個菌株為豬鏈球菌。

表1　分離菌株的生化特性

M.DNA 標準DL 2 000;1.MS1；2.MS2

M.DNA Marker DL 2 000;1.MS1;2.MS2

圖116 S rRNA 基因PCR擴增產(chǎn)物

Fig.1PCR products of 16 S rRNA gene

2.4莢膜多糖抗原(CPS)基因分型鑒定

用豬鏈球菌CPS基因1J、2J、7H、9H分型引物分別2個菌株進行PCR分型鑒定，其中MS2豬鏈球菌經(jīng)擴增得到與9型預(yù)期大小的特異性片段，確定為豬鏈球菌9型(圖2)。用新合成的引物對菌株MS1分型，如圖3所示，第一步7重PCR顯示其CPS群為第3組，該組包括21型、28型、29型、30型4種，兩片段的大小分別為146 bp、583 bp。第二步四重PCR分型，產(chǎn)物結(jié)果顯示片段大小與28型272 bp相符，確定MS1為豬鏈球菌28型。

M.DNA 標準DL 2 000;1.MS2

M.DNA Marker DL 2 000;1.MS2

圖2菌株MS2 CPS分型鑒定

Fig.2CPS typing of srain MS2

2.5藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明，分離到的2株豬鏈球菌對青霉素G、羧芐青霉素、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、利福平和替考拉寧高度敏感；對強力霉素、呋喃妥因、氯霉素、洛美沙星和諾氟沙星中度敏感；對氨曲南、克林霉素、卡那霉素、克拉霉素、慶大霉素、林可霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、鏈霉毒、紅霉素、頭孢克肟、頭孢呋辛、阿米卡星、依諾沙星、磺胺異惡唑、呋喃唑酮和四環(huán)素等17種藥物不敏感。

M.DNA 標準DL 2 000;1.MS1 CPS群分型;2.MS1特異性CPS分型

M.DNA Marker DL 2 000;1.CPS grouping for MS1;2.Specific CPS typing for MS1

圖3菌株MS1 CPS分型鑒定

Fig.3CPS typing of srain MS1

3　討論

本研究從粵北某梅花豬養(yǎng)殖基地存在嚴重程度不同的呼吸道癥狀的梅花豬保育豬，以及不存在明顯臨床癥狀的外表健康保育豬和育肥豬采集鼻腔拭子共28份進行細菌性疾病的檢測，經(jīng)形態(tài)觀察和生理生化鑒定，初步確定2株優(yōu)勢菌為豬鏈球菌。PCR擴增16 S rRNA基因，序列經(jīng)編緝、Blast分析比對，顯示同源性高達99%的菌株均為豬鏈球菌，進而確定2株菌為豬鏈球菌，分別編號為MS1和MS2。用實驗室保存的1、2、7、9型CPS分型引物對兩個分離株進行分型鑒定，PCR結(jié)果顯示，MS2能擴增出與9型預(yù)期的303 bp特異性片段，確定為豬鏈球菌9型。參照文獻[9]，新合成引物，采用文獻中的二步多重PCR法對MS1進行分型，結(jié)果顯示CPS分群、CPS分型兩步中分別能擴增出與文獻報道的28型相符的、預(yù)期大小分別為146、583、272 bp特異性片段，確定為豬鏈球菌28型。在現(xiàn)有的35種血清型中，從發(fā)病豬中分離到的豬鏈球菌大多屬于血清1～9型，血清2型在大多數(shù)國家發(fā)病豬中都占主導(dǎo)地位[10]，近年來9型也成為臨床上豬鏈球菌感染常見的血清型[11]。豬鏈球菌的毒力因子相當復(fù)雜，潛在的毒力菌株與臨床表現(xiàn)未必一致[10]，此次分離到的9型菌株MS2是從無臨床癥狀的健康育肥豬鼻腔中分離的優(yōu)勢菌，幾種毒力相關(guān)基因sly、epf、mrp、arcA、hyl和bay檢測發(fā)現(xiàn)，其毒力相關(guān)基因譜為mrp+/bay+，其余毒力因子未檢測到(本實驗室，未發(fā)表資料)，與修福曉等[11]、Wang K等[12]分離的某1株9型豬鏈球菌毒力基因相關(guān)譜相似。沒有使豬發(fā)病的可能原因是MS1毒力相關(guān)基因變異導(dǎo)致該分離株毒性減弱，或潛在的重要的毒力基因的缺失，或者是處于感染的初期及潛伏期階段。盡管如此，基地相關(guān)工作人員應(yīng)在環(huán)境衛(wèi)生條件降低、季節(jié)變換等應(yīng)激情況下密切關(guān)注豬只的健康狀況，及早做好疾病預(yù)防控制措施。到目前為止，關(guān)于28型豬鏈球菌的分離鑒定鮮有報道，Wang K等[12]2012年在屠宰豬中分離到2株28型豬鏈球菌，并對其毒力相關(guān)基因譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)毒力相關(guān)基因型為mrp-/epf-/sly-。本次分離到的MS1是從存在嚴重呼吸道癥狀的保育豬鼻腔中分離到的優(yōu)勢菌，毒力相關(guān)因子檢測為arcA+/ bay+，提示該菌與豬只發(fā)病之間可能的相關(guān)性，關(guān)于該28型分離株的毒力及致病力還有待做進一步的研究。

抗菌藥物作為抗感染的主要藥物，對維護人類和畜禽的健康發(fā)揮了重要作用[13]。近年來，抗菌藥物的不規(guī)范使用導(dǎo)致耐藥性菌株大幅上升，增加了對疾病預(yù)防和控制的難度。為指導(dǎo)臨床用藥，本報道選用了臨床上常用的34種藥物進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，2個菌株對臨床上常見的12種藥物敏感，但對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、磺胺類藥物、呋喃類等多達17種藥物不敏感，耐藥率高達50%，耐藥性較嚴重。2株不同型豬鏈球菌具有相似的藥物敏感性，分析原因可能是：該基地多年來的用藥習慣造成細菌產(chǎn)生規(guī)律性耐藥；藥物敏感性基因可能是由質(zhì)?？刂?，質(zhì)粒經(jīng)水平傳遞分布到不同的分離菌株中，從而造成了不同分離株具有相同的藥敏特征。建議該基地以保護和利用畜禽品種資源為出發(fā)點，結(jié)合臨床癥狀、藥敏試驗結(jié)果，在養(yǎng)殖過程中合理用藥，科學防控。

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Isolation,Identification and Drug Susceptibility Test of Streptococcus suis from Plum Flower Pigs in Northern Area of Guangdong Province

ZHOU Di,YANG Xu-fu,PENG Ling,LIU Bo-ting

(Center of Collaborative Innovation and Development on Swine production and Disease Nontrol in Northern Guangdong,ShaoguanUniversity,JointLaboratoryofAnimalInfectionsDiseasesDiagnosticCenterHarbinVeterinaryResearchInstitute,COAS-ShaoguanUniversity,Shaoguan,Guangdong,512005,China)

To investigate bacterial diseases of Plum flower pigs,nasal swabs were sampled from the pigs with clinical respiratory symptoms of varying degrees and no symptoms.Two strains of dominant bacteria were obtained on the medium of bovine heart infusion agar, and identified asStreptococcussuisby a series of tests such as purified culture,morphological characteristics,staining and microscopy,physiological and biochemical tests and 16 S rRNA sequence alignment and analysis.One of the strains was serotyped as serovar 9 and the other was as serovar 28 by PCR amplification with primers CPS of 35 serovars ofS.suis.The results of drug susceptibility test showed that two strains ofS.suiswere susceptible to 12 antimicrobials,and were resistant to 17 antimicrobials.

Streptococcussuis; 16 S RNA gene;CPS typing;drug susceptibility test

2016-01-28

“粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心”平臺項目；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項資金項目(2014A020208140)

周迪(1984-)，女，江西宜春人，助理實驗師，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物及分子生物學研究。*通訊作者

S852.611;S858.28

B

1007-5038(2016)09-0125-04