李復煌，李冰心，鄭瑞峰 ，王　俊，李占鴻，馬富梅，劉再超， 張清水*

(1.北京市畜牧總站，北京 100107；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院/農業(yè)部動物流行病學人畜共患病重點實驗室,北京 100193；3.北京市大興區(qū)動物疾病控制中心，北京 102629；4.北京市順義區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,北京 101300)

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鴿新城疫病毒分離鑒定及動物感染試驗

李復煌1，李冰心2,3，鄭瑞峰1，王俊2，李占鴻2，馬富梅2，劉再超4， 張清水2*

(1.北京市畜牧總站，北京 100107；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院/農業(yè)部動物流行病學人畜共患病重點實驗室,北京 100193；3.北京市大興區(qū)動物疾病控制中心，北京 102629；4.北京市順義區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,北京 101300)

從發(fā)病商品肉鴿組織中分離到3株新城疫病毒，對其基因序列和感染力進行測定和分析。用RT-PCR對3株病毒F基因進行了擴增，測序，3株新城疫病毒的F基因同源性比較及進化分析結果表明,3株病毒均屬于Ⅵb亞型，且與2011年比利時分離株親緣關系較近，F(xiàn)蛋白裂解位點符合強毒特征；肉鴿攻毒試驗進一步證實了3株新城疫病毒的高致病性，肉鴿感染新城疫病毒后通過呼吸道及消化道途徑排毒，具有高度接觸傳染性。試驗結果證明了鴿感染新城疫病毒后的排毒時間及方式，為鴿新城疫的及早發(fā)現(xiàn)與防控提供了依據(jù)。

鴿；新城疫病毒；F基因；排毒監(jiān)測

鴿新城疫由鴿源禽Ⅰ型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus type Ⅰ，PPMV-Ⅰ)即新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病。該病發(fā)病急、傳播快、病死率高，發(fā)病鴿通常會出現(xiàn)腸炎、腹瀉及神經癥狀等。NDV為單股負鏈RNA病毒，全基因組長度約為15 kb，編碼6種主要的結構蛋白，其中F蛋白和HN蛋白為主要的免疫原性蛋白。病毒顆粒外包繞囊膜，具有凝集紅細胞的特性。新城疫病毒只有一個血清型，但基因型眾多，分ClassⅠ和ClassⅡ兩個大群，ClassⅠ包括9種基因型(1-9)，ClassⅡ同樣有9種基因型(Ⅰ-Ⅸ)，每種基因型還包括多種亞型[1-2]，其中從鴿子分離到的新城疫病毒絕大部分屬于ClassⅡ，僅有少數(shù)屬于ClassⅠ[3]。

該病于19世紀70年代末首次在蘇丹和埃及的信鴿中被發(fā)現(xiàn)，其后在各國被陸續(xù)報道，我國于1986年前后在發(fā)病鴿群中分離到該病病原[4]，已經給我國的信鴿及肉鴿養(yǎng)殖造成了巨大的經濟損失。鴿Ⅰ型副黏病毒可感染不同日齡的鴿子，自然條件下，肉鴿、信鴿和賽鴿均可感染發(fā)病，母鴿較公鴿易感，乳鴿較成年鴿易感，但對雞、鴨無致病性[5]。成年鴿感染后死亡相對緩慢，通常無死亡高峰，死因多由繼發(fā)感染導致。發(fā)病鴿和帶毒鴿作為該病的主要傳染源，通過呼吸道和消化道等方式傳播[6]。本實驗室于2012年—2014年分別從廣西、北京等地發(fā)病商品肉鴿中分離到3株新城疫病毒，并且對其全基因組序列進行了測序分析。同時通過人工感染商品肉鴿的方法觀察其對商品肉鴿的致病性，通過采集感染鴿咽拭子及泄殖腔拭子來觀察感染鴿的排毒方式及排毒的時間，感染雛鴿表現(xiàn)出極高的致病性，通過口腔和泄殖腔持續(xù)排毒，引發(fā)同居感染。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物9日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；35日齡商品肉鴿，購自北京大興某鴿場。

1.1.2試劑胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；病毒 RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PyrobestTMDNA 聚合酶， 寶生物工程(大連)有限公司產品；反轉錄試劑盒(AMV、RNA酶抑制劑)，Promega生物技術有限公司產品；pEASY-Blunt Simple Cloning Kit載體，Trans T1感受態(tài)細胞，DNA Marker(D2000 Plus)，北京全式金生物技術有限公司產品；胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)、LB瓊脂、LB肉湯，美國BD醫(yī)療器械有限公司產品；硫酸鏈霉素、青霉素鈉，華北制藥股份有限公司產品。

1.2方法

1.2.1病毒的分離取發(fā)病死亡鴿的肝臟、脾臟及腦等組織用滅菌研磨器研磨，離心過濾，過濾后濾液尿囊腔途徑接種5枚9日齡SPF雞胚，置于37℃孵化箱中孵育，觀察雞胚死亡情況，棄去24 h之內死亡的雞胚。收集死亡雞胚尿囊液，用10 mL/L的雞紅細胞進行HA試驗，具體操作參照文獻[7]進行。同時將處理好的病料接種雞胚成纖維細胞(chicken embryo fibroblast，CEF)，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后加入CEF細胞生長液，加完后放入37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，72 h后觀察有無細胞病變(CPE)的產生。

1.2.2病毒的鑒定

1.2.2.1引物設計根據(jù)GenBank中已發(fā)表的鴿NDV的序列，設計2對F基因的擴增引物：F上游引物F(F)5＇- ATGGGCTCCAAACCCCACATC-3＇；下游引物F(R)5＇- TCATGTTCTTGTAGTTGCTCTC-3＇，目的片段大小為1 662 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2.2病毒RNA的提取將收獲的死亡雞胚尿囊液按照MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver.5.0說明書操作，提取尿囊液中的病毒RNA。

1.2.2.3反轉錄以提取的尿囊液RNA為模板，利用引物5＇-ACGGGTAGAAGG TGTG AATC-3＇進行反轉錄，反應條件及體系如下：RNA 10 μL，反轉錄引物1 μL，70℃變性10 min，冰浴1 min。然后向反應管中依次加入：MgCl24 μL，10×buffer 2 μL，dNTP(10 μmol/L) 2 μL， RNA酶抑制劑0.5 μL，AMV 0.5 μL，至反應總體積為20 μL?；靹?，42℃反應60 min，獲得cDNA，置于-20℃凍存。

1.2.2.4PCR擴增利用反轉錄獲得的cDNA為模板，F(xiàn)基因特異性引物來擴增F基因，反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s， 55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產物用10 g/L的瓊脂糖進行凝膠電泳，觀察條帶情況。

1.2.3鴿NDV F基因的克隆及測序按照上述方法擴增出新城疫病毒的F基因，8 g/L瓊脂糖進行凝膠電泳，利用TaKaRa膠回收試劑盒對目的條帶進行膠回收；將回收片段與pEASY-Blunt Simple Cloning Kit載體連接，具體步驟按照全式金分子克隆說明書進行操作，最后將菌液涂布于加有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。篩選陽性克隆，送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

1.2.4基因組序列的拼接及分析DNA Star、Contig Express等生物學軟件將所得的序列測定結果進行分析、拼接，獲得病毒的F基因全序列，并將該序列與 GenBank 中登錄的新城疫病毒以及不同地區(qū)不同宿主來源的新城疫病毒進行序列比對，基于F基因，分析其與各毒株的核苷酸序列與氨基酸序列同源性。同時利用MegAlign軟件中的Clustal W方法對分離自不同時間、不同地點及不同宿主的27株新城疫病毒的F基因核苷酸序列構建進化樹，進行系統(tǒng)進化分析，同時對不同來源的新城疫毒株F蛋白進行氨基酸序列的同源性分析。

1.2.5試驗感染肉鴿的排毒監(jiān)測36只肉鴿平均分為3組，每組12只(10只攻毒，2只空白對照)，3株鴿源新城疫病毒分別通過滴鼻方式感染肉鴿，飼喂于不同的隔離器中，分別于攻毒后的第2、4、6、8、10、12天采集肉鴿咽拭子及泄殖腔拭子，利用含5 000單位青、鏈霉素的DMEM處理，將處理完的液體接種96孔板CEF，放入37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入CEF細胞維持液，放入CO2培養(yǎng)箱中，72 h后觀察細胞病變。

2　結果

2.1病毒的分離

死亡鴿組織研磨處理后接種9日齡SPF雞胚，雞胚大約72 h全部死亡，死亡雞胚胚體水腫、出血明顯(圖1)。收集死亡雞胚尿囊液進行血液凝集試驗，能夠凝集10 mL/L雞紅細胞，效價為6log2。組織研磨液接種CEF，約72 h后出現(xiàn)明顯的細胞病變，細胞變圓皺縮、部分細胞甚至出現(xiàn)崩解壞死(圖2)。

A.正常雞胚;B.病毒致死雞胚

A.Normal chicken embryo;B.Dead chicken embryo

圖1雞胚病變

Fig.1Pathological lesions of chicken embryo

2.2RT-PCR鑒定

提取病毒RNA，反轉錄后利用鴿新城疫病毒F基因的特異性引物進行PCR擴增，可見明顯的目的條帶1 662 bp，最終鑒定為新城疫病毒(圖3)。

A.陰性對照；B.48 h；C.72 h

A.Negative control；B.48 hours；C.72 hours

圖2病料接種CEF后細胞病變

Fig.2CPE of CEF after inoculated with the tissue samples

2.3F基因的序列測定及進化分析

對3株鴿新城疫病毒的F基因進行測序， 3株NDV F基因的大小均為1 662 bp，共編碼553個氨基酸。3株NDV F蛋白的第112-117位氨基酸裂解位點序列均為RRQKRF，屬于典型的新城疫強毒株F蛋白氨基酸裂解位點的特征[8-9]。將分離的3株鴿新城疫的F基因與參考毒株進行進化分析(表1)，繪制進化樹(圖4)，可見所分離的3株鴿源新城疫病毒親緣關系較近，且與2013年北京分離株、2011年的比利時分離株親緣關系最為接近，屬于同一分支，為Ⅵb亞型。

M.DNA 標準DL 5 000;1.樣品;2陽性對照;3陰性對照

M.DNA Marker DL 5 000;1.Sample；2.Positive control；3.Negative control

圖3F基因PCR擴增

Fig.3PCR amplification results of F gene

表1　本研究所引用GenBank中NDV F基因序列信息

2.4攻毒肉鴿的排毒監(jiān)測

試驗組肉鴿攻毒后的第2天即檢測到病毒排出，排毒方式主要以口腔、呼吸道途徑為主，第2天就開始排毒，消化道途徑排毒量較少。第4天在泄殖腔拭子中檢測到病毒，咽拭子中的病毒檢出率達到100%，并能一直持續(xù)到鴿子死亡；GX0302試驗組同居未感染肉鴿(對照組)攻毒后第6天在咽拭子中檢測到病毒，BJ0612、BJ0902則分別在攻毒后的第8天和第10天檢測到病毒的排放(圖4～圖5)。3株新城疫病毒均表現(xiàn)出較強的致病性，攻毒組肉鴿攻毒后第11天死亡率即達到90%，同居對照組死亡率達到50%。

圖4　3株鴿源新城疫病毒與不同來源的新城疫病毒基于F基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4　Phylogenetic tree constructed between three NDV strains from the pigeons and other different resources NDV based on the F gene

A.GX0302；B.BJ0612；C.BJ0902

圖5肉鴿人工感染新城疫病毒后咽拭子及泄殖腔拭子的病毒分離率

Fig.5The virus isolation rates of the throat swabs and cloacal swabs after the infections of pigeons with the three NDV strains

3　討論

鴿形目鳥類是鴿新城疫的主要傳播源，鴿源新城疫病毒最早可能起源于中東地區(qū)，于19世紀80年代迅速流行開來，尼羅河三角洲地區(qū)、蘇丹、意大利美索不達米亞及整個歐洲地區(qū)均出現(xiàn)鴿感染新城疫病毒的報道[10]，我國于1986年分到該病病原，并鑒定為Ⅵb基因型[9，11]。

20世紀80年代流行的新城疫病毒F蛋白裂解位點主要以GRQKRF為主，進入20世紀90年代以來，F(xiàn)蛋白的氨基酸裂解位點逐步進化為RRQKRF[11]，這與本實驗室所測的3株新城疫病毒的序列信息相符，通過肉鴿人工感染試驗，進一步的證實了3株新城疫病毒的強毒特征。

根據(jù)F基因遺傳系統(tǒng)進化樹可以看出，北京及廣西鴿源新城疫分離株主要位于基因Ⅵ細分支，屬于ClassⅡ中的Ⅵb亞型，這個結果與我國近幾年鴿源新城疫病毒的流行情況相符[12]。3株鴿新城疫分離株與北京分離株BJP13和比利時分離株11的親緣關系最近，表明分離株可能為最近幾年北京鴿新城疫流行毒株，且該毒株可能與比利時毒株屬于同一來源。

鴿群感染新城疫病毒后通常呈現(xiàn)流行性暴發(fā)，未免疫鴿群病死率達到100%[13-14]。鴿群發(fā)病之初通常會有一段時間的排毒期，本試驗通過人工攻毒肉鴿的方式來了解鴿感染新城疫病毒后的排毒情況，對采集的鴿拭子進行檢測，初步認識了鴿感染新城疫病毒后的排毒期及排毒方式，為鴿新城疫的及早發(fā)現(xiàn)及控制提供了理論依據(jù)。

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Isolation and Identification of Pigeon Newcastle Disease Virus and Experimental Infection in Pigeons

LI Fu-huang1，LI Bing-xin2,3，ZHENG Rui-feng1,WANG Jun2，LI Zhan-hong2，MA Fu-mei2，LIU Zai-chao4,ZHANG Qing-shui2

(1.Beijing Municipal Animal Husbandry General Station，Beijing，100107，China；2.KeyLaboratoryofAnimalEpidemiologyandZoonosis，MinistryofAgriculture，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing，100193，China；3.AnimalDiseaseControlandPreventionCentre，Daxing，Beijing，102629，China；4.InstituteofAnimalHealthSupervision，Shunyi，Beijing，101300，China)

Three Newcastle disease virus strains were isolated from dead pigeons,the molecular identification was carried out by RT-PCR method and the F gene was sequenced then.The homology comparison and phylogenetic analysis were also implemented base on the F gene.The result showed that three strains belong to the Ⅵb subtype.F protein cleavage site was consistent with the virulent NDV strains,which was further verified through pigeon challenge assay.The pigeons infected with NDV shed the virus through the respiratory and digestive tracts showing highly contagious property.The challenge assay demonstrated the shedding way of the infected pigeons which is in favour of the prevention of the pigeon ND.

pigeon；Newcastle disease virus; F gene; virus shedding

2016-04-27

北京市農業(yè)重大科技項目(20150118)

李復煌(1977-)，男，甘肅靖遠人，高級獸醫(yī)師，博士研究生，主要從事獸醫(yī)技術管理工作。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)09-0053-05