馬　輝,權(quán)國輝,喬宏興,鄭　鳴,趙緒永,王永芬*,邊傳周

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院,河南鄭州 450011；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學院材料工程系,河南鄭州 450121)

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犬細小病毒單克隆抗體的制備及其在膠體金免疫層析試紙研發(fā)中的應(yīng)用

馬輝1,權(quán)國輝2,喬宏興1,鄭鳴1,趙緒永1,王永芬1*,邊傳周1

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院,河南鄭州 450011；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學院材料工程系,河南鄭州 450121)

為制備犬細小病毒膠體金免疫層析試紙，將F81細胞中分離的CPV免疫Balb/c小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞融合，建立間接ELISA方法篩選分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細胞，獲得1株能穩(wěn)定分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3E2。3E2的亞類為IgG1型，腹水抗體效價為1.8×105，交叉試驗表明,3E2可與CPV特異性結(jié)合，與其他犬常見病毒無交叉反應(yīng)。用3E2單克隆抗體制備的檢測CPV的膠體金免疫層析試紙條特異性良好，為診斷和研究CPV奠定了基礎(chǔ)。

犬細小病毒；病毒分離；單克隆抗體；膠體金免疫層析試紙

犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)所引起的傳染性疾病，可通過直接或間接接觸傳播，以劇烈的嘔吐、腹瀉和白細胞減少為主要特點，可引起犬急性心肌炎。犬細小病毒傳播性強，發(fā)病率和病死率較高，且可感染狐、貉、狼等動物，對養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動物等經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)可造成巨大經(jīng)濟損失[1]。1977年，美國科學家最先從患腸炎的犬糞便中分離出CPV。1983年，徐漢坤等首次報道了犬細小病毒病在我國的出現(xiàn)。

CPV在分類上屬細小病毒科，病毒呈圓形或六邊形，無囊膜，直徑約25 nm。病毒顆粒具有球型的衣殼,衣殼內(nèi)包含單鏈線狀DNA，在DNA兩端各有一個發(fā)夾樣的回文結(jié)構(gòu)，DNA量占整個病毒粒子重量的25%～34%。CPV基因主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2。VP1和VP2構(gòu)成病毒的衣殼，其中VP2是主要結(jié)構(gòu)成分和免疫原性蛋白，能夠促使機體產(chǎn)生中和抗體[2]。VP1和VP2蛋白對病毒與宿主細胞之間的識別起重要作用，刪除VP1或VP2蛋白的突變體均失去了對宿主細胞的感染能力。近年來，CPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1被認為在病毒的致病性和細胞毒方面起主要作用，并在體外可引起腫瘤細胞凋亡[3-5]。

目前國內(nèi)外對犬細小病毒的診斷主要通過臨床癥狀診斷、血常規(guī)檢查和試紙快速診斷等，前兩者存在著依賴臨床經(jīng)驗、特異性低等缺點，難以達到對犬細小病毒病快速診斷的要求；而快速診斷試紙條主要被國外產(chǎn)品所壟斷[6]。本研究用F81細胞分離的CPV制備獲得了單克隆抗體，并用單克隆抗體，初步制備了CPV的膠體金層析快速檢測試紙條。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物、細胞株及毒株貓腎細胞系細胞(F81)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；犬細小病毒病料，河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)院提供；SP2/0多發(fā)性骨髓瘤細胞，河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室保存； Balb/c小鼠和日本長耳大白兔，購自河南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心；含有CPV VP2基因的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-VP2,河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室構(gòu)建并保存；犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺狀病毒(CAV),河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室鑒定并保存。

1.1.2主要試劑與藥品dNTP、DNA提取試劑盒、瓊脂糖、DNA Marker DL 2 000 和蛋白分子質(zhì)量標準等,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DMEM、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、50倍HAT貯存液，GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，Hyclone公司產(chǎn)品；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗體、PEG 4000、DMSO、BSA及氯金酸，Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜(NC膜)，Millipore公司產(chǎn)品；樣品墊和PVC底板，上海金標生物科技有限公司產(chǎn)品；SBA Clonotyping System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒，Southern Biotechnology公司產(chǎn)品；引物合成和序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；CPV多抗IgG由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室制備；犬細小病毒陰性血清由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)院提供；其他常規(guī)用試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2方法

1.2.1病毒的鑒定樣品由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)院提供。采集出現(xiàn)血便、高熱等疑似CPV感染的犬糞便，加入適量磷酸鹽緩沖液，5 000 r/min離心10 min，收獲上清液。按常規(guī)DNA提取方法提取DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。參照CPV基因序列(基因登錄號: M19296.1)，設(shè)計引物序列為：上游引物P1：5′-AATCACAGCAAACTCAAGCAGAC-3′；下游引物P2：5′-TAGCAAATTCATCACCTGTTCTTAG-3′。以提取的DNA樣品為模板，使用Taq酶擴增，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán);最后72℃ 10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL用 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果[7]。

1.2.2病毒的分離和抗原的制備將采集的病料加入含1 000單位/mL 青霉素和鏈霉素的DMEM細胞維持液(含20 mL/L胎牛血清)制成1∶9的懸液，混勻后5 000 r/min離心20 min，取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾，置-20℃保存?zhèn)溆?。將單層的F81細胞用胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，按體積10%的病料上清同步接種F81細胞，置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)立陰性對照，同時逐日觀察細胞病變并進行盲傳[8-9]。

待細胞病變達到80%以上時，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min 4℃離心30 min，收獲上清，加入PEG 6000濃縮，經(jīng)過Sepharose 4FF凝膠柱層析，收集洗脫峰即為CPV抗原，紫外分光法檢測CPV濃度，保存于-80℃。

1.2.4小鼠的免疫將純化的CPV抗原加等體積弗氏完全佐劑初次免疫6周齡Balb/c小鼠，每隔2周分別再注射2次以加強免疫。細胞融合前3 d再加強免疫1次注射抗原。

1.2.5雜交瘤細胞的篩選和McAb腹水制備按常規(guī)方法進行細胞融合，使用建立的間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)，選擇能夠穩(wěn)定分泌、效價較高的單個克隆進行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備腹水，并采用辛酸-硫酸銨鹽析法和親和層析法純化腹水中的McAb[12]。

1.2.6McAb亞型鑒定及染色體計數(shù)①采用SBA Clonotyping System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒測定制備的CPV McAb的Ig亞類。②選擇生長良好的雜交瘤細胞，用秋水仙素阻斷法進行染色體核型分析，在顯微鏡下選擇染色體分散良好的細胞觀察計數(shù)。

1.2.7McAb的特異性分析將犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CPV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)作為包被抗原進行間接ELISA，檢測該單克隆抗體的特異性。

1.2.8膠體金抗體的制備將 200 mL 0.1 g/L氯金酸溶液，攪拌加熱至沸騰，迅速加入2 mL 10 g/L檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色從淺黃逐漸變黑，然后變紅，繼續(xù)煮沸10 min，溶液冷卻后微孔濾膜過濾，4℃下保存?zhèn)溆?。將制備的膠體金，調(diào)整pH至8.0后加純化后的3E2單抗攪拌，室溫靜止5 min，經(jīng)低溫高速離心法純化獲得膠體金抗體[13]。

1.2.9免疫試紙條的制備和初步鑒定在玻璃纖維上噴涂膠體金抗體。取蛋白濃度為1.5 mg/mL 的CPV多抗IgG標記在硝酸纖維素膜上，設(shè)為檢測線；取蛋白濃度為1.0 mg/mL 的羊抗鼠IgG抗體噴在離檢測線5 mm處，即為質(zhì)控線；將噴有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜與樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水紙組裝成試紙條。取PCR和ELISA鑒定的犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)，用制備的膠體金試紙條進行檢測，驗證其特異性。

2　結(jié)果

2.1PCR鑒定

通過PCR擴增，得到608 bp左右的預(yù)期大小目的片段，經(jīng)測序與預(yù)期序列一致，證明樣品中含有CPV(圖1)。

2.2病毒的分離

從第3代開始一般會出現(xiàn)規(guī)律性細胞病變，接種病料上清液后約24 h～36 h，細胞出現(xiàn)彌散性顆粒，胞漿收縮，細胞變圓；約48 h病變細胞開始逐漸拉網(wǎng)、崩解、脫落；約72 h～96 h，細胞病變達80%以上時，收毒，置-80℃保存?zhèn)溆?圖2)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照;2.目的片段;3.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.PCR products of CPV;3.Negative control

圖1CPV PCR檢測結(jié)果

Fig.1Detection of CPV by PCR

2.3間接ELISA方法建立

采用方陣滴定確定抗原的最佳包被濃度和陽性血清最佳稀釋度，陽性判斷標準為OD待檢血清>0.4,且OD待檢血清/OD標準陰性值≥2.1，當抗原的稀釋濃度為1∶160，血清的稀釋度為1∶80，陰性與陽性血清的OD 450 nm值相差最大(P/N=9.253)。建立了篩選犬細小病毒 McAb的間接ELISA方法(表1)。

2.4雜交瘤細胞株的篩選

經(jīng)脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0細胞融合并篩選，獲得1株能高效分泌抗CPV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3E2。間接ELISA檢測，3E2腹水效價為1∶1.8×105。

2.5McAb的Ig亞類鑒定

檢測抗體的Ig亞類，結(jié)果表明，3E2亞類為IgG1型。

A.F81細胞;B.病變F81細胞

A.F81 cells;B.CPE of F81 cells

圖2　CPV病毒的分離

2.6雜交瘤細胞染色體數(shù)目

Balb/c小鼠脾細胞的染色體為40條，SP2/0骨髓瘤細胞的染色體為62條。統(tǒng)計結(jié)果表明，該細胞株染色體數(shù)介于90條～100條，大約為小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞染色體數(shù)目之和，說明為兩者融合產(chǎn)生(圖3)。

2.7McAb的特異性檢測

將3E2分別與犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)包被的ELISA板進行交叉反應(yīng)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn),3E2與CPV可發(fā)生陽性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV不發(fā)生反應(yīng)，表明制備的McAb與其他犬常見病毒沒有交叉反應(yīng)，制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性(表2)。

2.8膠體金溶液的制備

制成的膠體金溶液日光下肉眼觀察透明清亮、顏色為酒紅色、無沉淀。經(jīng)紫外分光光度計檢測其最大吸收波長為525 nm。

圖3　雜交瘤細胞的染色體分析Fig.3　Analysis of chromosones of hybridoma cells

2.9膠體金免疫層析試紙的特異性

特異性試驗結(jié)果顯示犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)在膠體金免疫層析試紙檢測線上均無條帶，為陰性。犬細小病毒(CPV)在檢測線上均出現(xiàn)特異性條帶，為陽性(圖4)。

表2　McAb交叉反應(yīng)試驗結(jié)果

1.犬細小病毒;2.犬瘟熱病毒;3.犬冠狀病毒;4.犬腺病毒Ⅱ型;5.陰性對照

1.CPV;2.CDV;3.CCV;4.CAV;5.Negative control

圖4膠體金試紙條特異性檢測

Fig.4Specificity test of colloidal gold test strip detection

3　討論

犬細小病毒病傳播性強，發(fā)病率和病死率較高，且一年四季都有發(fā)生，絕大多數(shù)年齡、品種的犬類都可被傳染，但幼犬和純種犬更易被感染，病死率也高[14-15]。細小病毒感染犬類后，一旦發(fā)病治愈率特別低，沒有特效藥，早期確定犬細小病毒病并予以抗病毒、消炎、補液和止嘔等治療，可以提高療效和存活率，因此，對CPV的早期檢測就非常關(guān)鍵[16-19]。膠體金免疫層析試紙檢測方法只需將待測溶液加入試紙條中，靜止后一段時間觀察結(jié)果，不需要儀器設(shè)備來讀取結(jié)果，不需要操作者有專業(yè)技能，能減少很大檢測工作量和節(jié)省大量檢測費用，敏感性高，特異性好[20]。但目前我國市場上部分CPV試紙條主要以國外進口為主，價格較為昂貴，市場較為廣闊。

我們以分離得到并純化的CPV為抗原，多次腹腔注射免疫小鼠獲得了能夠分泌抗CPV McAb的脾細胞，ELISA試驗結(jié)果表明該雜交瘤細胞產(chǎn)生的McAb只與CPV發(fā)生特異性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV無明顯的交叉反應(yīng)，表明制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性。另外，經(jīng)間接ELISA檢測，3E2腹水效價為1∶1.8×105。

本試驗確定了標記的最佳條件，設(shè)定3E2為金標抗體、取蛋白濃度為1.5 mg/mL 的CPV多抗IgG標記為檢測線，蛋白濃度為1.0 mg/mL的兔抗鼠IgG高免血清標記為質(zhì)控線，初步建立了膠體金免疫層析方法。本試驗建立的診斷方法特異性強，與其他3種犬常見病毒抗原無交叉反應(yīng)，具有較好的重復(fù)性，與ELISA方法結(jié)果一致，可用于CPV的快速檢測。下一步我們將在反應(yīng)條件、穩(wěn)定性及工藝上進一步改進，以期進一步提高檢測靈敏度。

本研究分離并純化了CPV，經(jīng)免疫Balb/c小鼠后，通過雜交瘤技術(shù)獲得了1株高親和力和高特異性的雜交瘤細胞，經(jīng)鑒定制備出的McAb效價高、特異性強。并在此基礎(chǔ)上研發(fā)了膠體金免疫層析檢測試紙條，快捷準確，在臨床上具有很好的應(yīng)用前景，有一定的社會和經(jīng)濟價值，并為犬細小病毒的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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Development of Monoclonal Antibody and Colloidal Gold Immunochromatographic Assay for Detecting CPV

MA Hui1,QUAN Guo-hui2,QIAO Hong-xing1,ZHENG Ming1,ZHAO Xu-yong1,WANG Yong-fen1,BIAN Chuan-zhou1

(1.College of Biotechnology,Henan University of Animal Husabandry and Economy,Zhengzhou,Henan,450046,China;2.DepartmentofMaterialsScienceandEngineering,ZhengzhouTechnicalCollege,Zhengzhou,Henan,450121,China)

The canine arvovirus (CPV) isolated from dog feces was cultured and purified.SP2/0 myeloma cells SP2/0 were fused with spleen cells from CPV immunized Balb/c mice.Positive cells producing antibodies were screened by indirect ELISA,and a monoclonal antibody against CPV was generated and designated as 3E2.The monoclonal antibody belongs to IgG1.The titer of ascites was 1.8×105as detected by ELISA.No cross-reactions were observed between the McAb prepared and other canine viruses and the McAb could recognize CPV.Based on the McAb,the GICA was established by purified and gold labeled McAb 3E2.It could detect the CPV specifically.Therefore,the results indicated that the method had high specificity.It could serve as effective detection measure for clinic and further research of CPV.

CPV;virus isolation;monoclonal antibody;colloidal gold immune chromatography

2016-03-01

鄭州市科技攻關(guān)計劃項目(121PPTGG463)；河南省科技攻關(guān)項目(142102310034)；河南省高等學?？萍紕?chuàng)新團隊項目(HUAHE2015001)

馬輝(1980-)，男，河南許昌人，講師，博士，從事動物病原生物學研究。*通訊作者

S854.43;S852.659.2

A

1007-5038(2016)09-0026-05