張瑞永，管　宇，吳信明，梅建國，姚春陽，沈志強，雷連成

(1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

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低血清培養(yǎng)PK-15細胞及其增殖豬圓環(huán)病毒2型的研究

張瑞永1,2，管宇2，吳信明2，梅建國2，姚春陽2，沈志強2，雷連成1*

(1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

依次采用含60、30、20、10 mL/L血清濃度的低血清培養(yǎng)基馴化PK-15細胞，并給馴化好的細胞上接種豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)，以確定PCV-2在該培養(yǎng)體系下的生長情況。結(jié)果用含60、30、20 mL/L血清濃度的低血清培養(yǎng)基各進行3代次馴化，PK-15細胞能完全適應(yīng)且生長狀態(tài)良好；當血清濃度降至10 mL/L時，傳代1次細胞無法保持良好狀態(tài)，細胞出現(xiàn)貼壁較差、生長停滯等現(xiàn)象。各血清濃度培養(yǎng)體系中細胞生長曲線測定結(jié)果顯示，在細胞培養(yǎng)的0、24、48、72、96 h各組細胞密度與常規(guī)培養(yǎng)的對照組差別不明顯。因此用該低血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)PK-15細胞時，血清最低添加量為20 mL/L。用該體系培養(yǎng)的PK-15細胞接種PCV-2后，通過熒光抗體染色測定病毒滴度。結(jié)果顯示，低血清培養(yǎng)的PCV-2病毒滴度為106.5TCID50/mL，與常規(guī)條件培養(yǎng)的PCV-2對照(病毒滴度為106.375TCID50/mL)差別不明顯，表明該體系可用于PCV-2的增殖。表明研究建立了PK-15細胞低血清培養(yǎng)PCV-2體系，為PCV-2的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

PK-15細胞；低血清培養(yǎng)基；豬圓環(huán)病毒2型；增殖；間接免疫熒光

隨著現(xiàn)代生物制品行業(yè)的不斷發(fā)展，對疫苗制造的安全性和有效性要求不斷提升，各生產(chǎn)廠家對效率產(chǎn)能、產(chǎn)品質(zhì)量提升的需求也越來越迫切。目前多數(shù)動物疫苗生產(chǎn)廠家采用PK-15細胞培養(yǎng)PCV-2并用來制造豬圓環(huán)病毒疫苗[1-5]。通常用含60 mL/L～100 mL/L的新生牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞[6-9], 但血清的使用具有價格昂貴、不同批次間存在質(zhì)量差異等諸多缺點[10-14]。這些缺點使得血清在細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用受到限制[15-19]。經(jīng)過廣泛研究，已經(jīng)有低血清培養(yǎng)基產(chǎn)品問世，該培養(yǎng)基可以將血清用量降到較低水平，實現(xiàn)對細胞的低血清培養(yǎng)[20-21]，使用低血清培養(yǎng)基具有提高疫苗質(zhì)量安全性、降低生產(chǎn)綜合成本、提高生產(chǎn)效率等優(yōu)勢，對疫苗生產(chǎn)企業(yè)具有重要意義。本研究從血清市場及疫苗制造的實際情況出發(fā)，經(jīng)過馴化培養(yǎng)，建立了PK-15細胞低血清培養(yǎng)體系，并應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒增殖，以期為傳代細胞系低血清馴化培養(yǎng)及圓環(huán)病毒在低血清培養(yǎng)細胞上的增殖研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞、毒株和試劑PK-15細胞、PCV-2 DBN株，由山東綠都生物科技有限公司保存；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；T2(低血清細胞培養(yǎng)液)，深圳壹生科公司產(chǎn)品；新生牛血清(BS)，康源生物有限公司產(chǎn)品；0.8 g/L胰酶-EDTA,Amresco公司產(chǎn)品；PCV-2單克隆抗體，JBT公司產(chǎn)品；FITC標記的羊抗鼠二抗，KPL公司產(chǎn)品。

1.1.2儀器設(shè)備倒置熒光顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，吸管，洗耳球，96孔細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)瓶，移液器等。

1.2方法

1.2.1PK-15細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)取生長狀態(tài)良好且鋪滿T75瓶底的PK-15細胞，棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液。加入5 mL胰酶-EDTA消化液洗細胞1次，更換新鮮消化液3 mL，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化3 min～5 min后，棄去消化液并吸取6 mL含100 mL/L血清的培養(yǎng)液輕輕吹打使之完全消化散開。按1∶3比例傳至3個新的細胞培養(yǎng)瓶。于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。一般經(jīng)過48 h需要進行下一次傳代操作。

1.2.2含60 mL/L BS低血清培養(yǎng)基對PK-15細胞的馴化培養(yǎng)將已長成良好單層的PK-15細胞按1∶3比例傳至3個新的細胞培養(yǎng)瓶。選擇其中2瓶用含60 mL/L血清的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，另外1瓶按常規(guī)方法加入含60 mL/L血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照。長滿單層后各瓶均以1∶3比例繼續(xù)連傳3代。

1.2.3含30、20、10 mL/L BS 低血清培養(yǎng)基對PK-15細胞的馴化培養(yǎng)將用含60 mL/L BS低血清的培養(yǎng)基馴化的PK-15細胞按常規(guī)方法繼續(xù)傳代，培養(yǎng)基中血清降為30 mL/L、20 mL/L和10 mL/L，按1∶3比例繼續(xù)連傳3代。同時增設(shè)含60 mL/L血清普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為對照。其余濃度馴化操作步驟同上。

1.2.4PK-15細胞計數(shù)及生長曲線測定分別對正常傳代PK-15細胞及用含60、30、20 mL/L BS 低血清培養(yǎng)基馴化的PK-15細胞進行生長曲線測定，在細胞傳代后0(接種密度)、24、48、72、96 h用血球計數(shù)板按常規(guī)方法進行活細胞計數(shù)。

1.2.5馴化的PK-15細胞凍存及復蘇取對生長良好的用含20 mL/L血清濃度的低血清培養(yǎng)的細胞，經(jīng)胰酶消化后加入適量凍存液(成分為：800 mL/L 低血清培養(yǎng)基；100 mL/L血清；100 mL/L DMSO)。 用吸管吹打制成細胞懸液(細胞密度約為1×106～3×106/mL) 。加入1 mL細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。細胞凍存7 d后，將凍存的PK-15細胞從液氮罐中取出，放于37℃溫水中快速搖動，使其融化。在超凈工作臺上將其移入細胞培養(yǎng)瓶中，加入含20 mL/L BS的低血清培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)。5 h～6 h后更換1次含20 mL/L BS的低血清培養(yǎng)液，繼續(xù)置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h至細胞長成單層觀察細胞狀態(tài)。

1.2.6PCV-2 增殖試驗取低血清培養(yǎng)液(含20 mL/L血清)馴化并生長良好的單層PK-15細胞按1∶3比例傳代，傳代同時按體積比50 mL/L接入PCV-2種毒。37℃培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，更換含20 mL/L血清的低血清培養(yǎng)基，同時添加終濃度為2 mmol/L D-氨基葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以2∶1比例傳代，傳代24 h后添加終濃度為2 mmol/L D-氨基葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲病毒。同時設(shè)置用含60 mL/L血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的PK-15細胞接毒的對照。

1.2.7PCV-2 病毒滴度測定用PK-15細胞懸液將待檢的病毒液在滅菌管中作1∶10系列稀釋，取10-3～10-75個稀釋度分別接種96孔板，每個稀釋度6個孔，每孔100 μL，同時設(shè)正常細胞對照孔。37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)24 h，更換含2 mmol/L D-氨基葡萄糖的DMEM維持液，100 μL/孔。37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)48 h，待細胞長滿單層。棄去維持液，用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌3次，800 mL/L冷丙酮4℃固定細胞30 min，100 μL/孔，棄丙酮，用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌3次，加入1∶300稀釋的PCV-2抗體，50 μL/孔，37℃作用1 h；移去孔內(nèi)液體，用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌3次；加入1∶100稀釋的FITC標記的羊抗鼠二抗，50 μL/孔，37℃作用1 h；移去孔內(nèi)液體，用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌3次；熒光顯微鏡下觀察，正常細胞對照孔應(yīng)無熒光物質(zhì)著染，而接種病毒的細胞孔細胞胞漿內(nèi)應(yīng)有大量綠色熒光物質(zhì)著染。計算每個稀釋度含有PCV-2陽性細胞(細胞為綠色熒光物質(zhì)著染)的孔數(shù)，按Reed-Muench法計算TCID50。

2　結(jié)果

2.1PK-15細胞培養(yǎng)結(jié)果

將含60 mL/L BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的PK-15細胞傳代48 h后，可長至良好的單層。生長良好的細胞，邊緣清晰，輪廓清楚，無懸浮的死細胞，培養(yǎng)液清澈，無混濁現(xiàn)象(圖1)。

圖1　含60 mL/L BS DMEM培養(yǎng)的PK-15 細胞單層(100×)Fig.1　PK-15 cells in 60 mL/L BS DMEM(100×)

2.2含60 mL/L BS的低血清培養(yǎng)基對PK-15細胞的馴化培養(yǎng)結(jié)果

用含60 mL/L BS的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PK-15細胞，連傳3代后，細胞生長良好，邊緣清晰，輪廓清楚，無懸浮的死細胞，培養(yǎng)液清澈，無混濁現(xiàn)象。與對照比較無明顯差別(圖2)。

2.3含30、20 mL/L BS的低血清培養(yǎng)基對PK-15細胞的馴化培養(yǎng)結(jié)果

分別用含30、20 mL/L BS的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，連傳3代后，細胞均生長良好，邊緣清晰，輪廓清楚，無懸浮死細胞，培養(yǎng)液清澈，無混濁現(xiàn)象。與對照無明顯差別(圖3、圖4)。

圖2　含60 mL/L BS T2(低血清細胞培養(yǎng)液)馴化培養(yǎng)的 PK-15細胞(100×)Fig.2　PK-15 cells in 60 mL/L BS T2(low serum cell culture medium)(100×)

圖3　含30 mL/L BS T2馴化培養(yǎng)的PK-15細胞(100×)Fig.3　PK-15 cells in 30 mL/L BS T2(100 ×)

圖4　含20 mL/L BS T2馴化培養(yǎng)的PK-15細胞(100×)Fig.4　PK-15 cells in 20 mL/L BS T2(100 ×)

2.4含10 mL/L BS的低血清培養(yǎng)基對PK-15細胞的馴化培養(yǎng)結(jié)果

用含10 mL/L血清濃度的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，僅傳1代后，細胞生長出現(xiàn)異常，細胞出現(xiàn)脫落拉網(wǎng)現(xiàn)象，接近死亡(圖5)。與對照差別明顯。繼續(xù)傳代后細胞幾乎不再貼壁全部死亡。

2.5細胞計數(shù)及生長曲線測定結(jié)果

分別對細胞傳代后0(接種密度)、24、48、72、96 h進行活細胞計數(shù)，正常傳代及含有60、30、20 mL/L BS 低血清培養(yǎng)基馴化的PK-15細胞測定生長曲線如圖6所示。由結(jié)果可知，不同血清含量馴化的細胞在各個時期增殖情況與常規(guī)PK-15細胞無明顯差別。

圖5　含10 mL/L BS T2馴化培養(yǎng)的PK-15細胞(100×)Fig.5　PK-15 cells in 10 mL/L BS T2(100×)

2.6PCV-2滴度測定結(jié)果

在馴化好的PK-15細胞上接入PCV-2收獲后測得熒光半數(shù)感染量為TCID50=10-6.5/mL，對照細胞接入PCV-2收獲后測得熒光半數(shù)感染量為TCID50=10-6.375/mL。二者差別不明顯，PCV-2熒光抗體檢測見表1。

圖6　不同血清濃度低血清培養(yǎng)基馴化的PK-15細胞生產(chǎn)曲線Fig.6　Proliferation curve of PK-15 cells in culture containing different concentrations of the sera

3　討論

3.1血清濃度變化對細胞增殖的影響

低血清培養(yǎng)體系由于減少了血清用量，在初次傳代或者降低血清含量的初代細胞會出現(xiàn)少量的貼壁不牢、細胞漂浮等現(xiàn)象[6-7]，這些屬于正?，F(xiàn)象。所以，在馴化過程中需要通過連續(xù)多代次傳代適應(yīng)。低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞狀態(tài)會略微發(fā)生變化，表現(xiàn)為細胞扁平化，這可能和培養(yǎng)基更換以及血清含量降低有關(guān)，多次傳代后可出現(xiàn)轉(zhuǎn)變。本研究根據(jù)洪艷等[22]對BKH-21細胞低血清馴化獲得的經(jīng)驗將血清降低次序定為60、30、20、10 mL/L，由于采用了專業(yè)配方的PK-15適應(yīng)性低血清培養(yǎng)基，并未出現(xiàn)降低血清濃度后細胞生長緩慢、快速衰老死亡等變化。在降低過程中，含60、30、20 mL/L血清濃度的體系中傳代3次，都表現(xiàn)為較快適應(yīng)，鏡檢觀察無細胞衰老、變形、細胞停滯生長等常見的細胞衰老現(xiàn)象。但當血清含量降至10 mL/L時，細胞出現(xiàn)了立即不適應(yīng)現(xiàn)象。這說明該培養(yǎng)基中含有10 mL/L濃度的血清時，培養(yǎng)體系無法支撐細胞生長。本試驗并沒有將血清濃度繼續(xù)細分，后續(xù)試驗將繼續(xù)精細優(yōu)化以得到該培養(yǎng)基最佳的血清用量。

表1　PCV-2病毒半數(shù)感染量檢測結(jié)果

通過連續(xù)的每隔24 h細胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)血清降低并未對細胞生長過程造成顯著影響，計數(shù)結(jié)果均在常規(guī)誤差范圍內(nèi)，24 h細胞均表現(xiàn)常規(guī)性良好的對數(shù)生長現(xiàn)象，48 h后由于細胞平臺效應(yīng)，細胞數(shù)量不再增加。所以該培養(yǎng)體系完全可以替代常規(guī)細胞培養(yǎng)體系。由于含有10 mL/L血清濃度的培養(yǎng)體系中細胞直接快速衰老死亡，本研究未進行該濃度下細胞計數(shù)試驗。

3.2培養(yǎng)體系變化對病毒滴度的影響

據(jù)李智力等[23]報道，常規(guī)培養(yǎng)時血清濃度變化往往會對病毒增殖造成較大影響。但本試驗中低血清培養(yǎng)系統(tǒng)中PCV-2接毒試驗結(jié)果表明，PCV-2在該低血清培養(yǎng)體系中增殖并未受到顯著影響。因為未來應(yīng)用中低血清培養(yǎng)系統(tǒng)的目的就是將血清濃度降到較低水平，所以本試驗僅在已馴化好的含20 mL/L血清的低血清培養(yǎng)系統(tǒng)進行了病毒增殖試驗，數(shù)據(jù)顯示，通過3次測量結(jié)果的平均值，二者數(shù)據(jù)幾乎一致，與對照組并無明顯差別。在培養(yǎng)基中添加20 mL/L血清的情況下并不影響病毒的增殖。但豬圓環(huán)病毒增殖培養(yǎng)本身是一個相對復雜的過程[24]，簡單按原始條件進行培養(yǎng)并不能完全代表病毒在該體系的最佳增殖狀態(tài)。此外，病毒在該培養(yǎng)體系中的穩(wěn)定性、免疫原性等關(guān)鍵參數(shù)是否變化仍需深入研究[25]。

總之，本試驗采用低血清培養(yǎng)基對PK-15細胞進行馴化培養(yǎng)。用含20 mL/L血清的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞生長狀態(tài)良好，在該體系中按常規(guī)方法接入PCV-2，病毒增殖滴度可達106.5TCID50/mL，與常規(guī)方法增殖病毒的滴度差異不顯著。該體系可以初步應(yīng)用于PCV-2的增殖培養(yǎng)。本研究建立的PK-15細胞及PCV-2低血清培養(yǎng)體系，為PCV-2的疫苗生產(chǎn)工藝改進及相關(guān)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

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Study on PK-15 Cells Cultivated with Low Serum Culture and Culture Proliferation of Porcine Circovirus Type 2

ZHANG Rui-yong1,2, GUAN Yu2, WU Xin-ming2, MEI Jian-guo2,YAO Chun-yang2, SHEN Zhi-qiang2, LEI Lian-cheng1

(1.College of Veterinary Medicine Jilin University，Changchun，Jilin,130062；2.ShandongLvduBio-SciencesandTechnologyCo.Ltd.,Binzhou，Shandong,256600，China)

In this study,the low serum media containing 6%,3%,2% and 1% sera,respectively,were used to culture PK-15 cells and to proliferate the porcine circovirus type 2.The results showed that PK-15 cells were in good growth state in concentrations of 6%,3% and 2% sera culture medium,respectively,but when the concentration of the serum was decreased to 1%,the cells were in poor attachment and growth.Meanwhile,the densities of PK-15 cells at 0 h,24 h,48 h and 72 h time point in concentrations of 6%,3% and 2% serum culture medium was not significantly different with the control.Thereby,the culture media containing 2% serum were selected for cell cultivation and virus yield,and the virus titers were determined by indirect immunofluorescent assay.The results showed that the PCV-2 titer of the low serum culture was 106.5TCID50/mL,a little bit higher than that of the control (106.375TCID50/mL),but the difference was not significant. In this study,the PK-15 cell culture aging system with low serum culture medium for PCV-2 proliferation was established, which laid the foundation for the research of PCV-2.

PK-15 cell;low serum medium; PCV-2;proliferation;indirect immuno fluorescent assay

2016-04-11

山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GSF121027)

張瑞永(1980-)，男，山東臨沂人，碩士，主要從事獸用生物制品學工作。*通訊作者

S852.659.2

A

1007-5038(2016)09-0016-05