范丹丹,張　毅,劉琳琳,王冬冬,王建琳,徐守振，畢玉海，尹燕博*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032；3.丹陽市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇丹陽 212300；4.中國科學(xué)院微生物研究所,北京 100101)

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兩株不同致病力H9N2亞型禽流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建

范丹丹1△,張毅2△,劉琳琳3,王冬冬1,王建琳1,徐守振1，畢玉海4，尹燕博1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032；3.丹陽市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇丹陽 212300；4.中國科學(xué)院微生物研究所,北京 100101)

為研究H9N2亞型禽流感病毒毒株對禽類致病性的分子致病機制，選用A/chicken/Shandong/818/2010和A/chicken/Shandong/196/2011 兩株致病力存在明顯差異的野生型H9N2亞型禽流感病毒，用RT-PCR擴增其全基因組序列，并將其全部克隆于PHW2000雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體。經(jīng)測序驗證后，將其轉(zhuǎn)入293T細胞，并拯救出2株具有血凝活性的毒株。對拯救毒株進行全基因組測序驗證后，結(jié)果表明拯救出的毒株與2株野生型病毒的核苷酸序列完全一致；體外試驗證明，拯救毒株與野生毒株在雞胚和細胞中的復(fù)制能力一致；動物試驗證明，拯救毒株保持了野生型毒株對雞和雞胚的致病力。這兩套反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建，研究了病毒變異規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了可能導(dǎo)致H9N2亞型禽流感病毒增強的關(guān)鍵氨基酸位點，為流感的監(jiān)測及預(yù)防提供依據(jù)。

H9N2亞型禽流感病毒；強致病性；反向遺傳；感染性克隆

1994年陳伯倫等[1]首次從我國廣東某雞場發(fā)病雞的體內(nèi)分離到H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)。香港大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所等單位發(fā)表的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，H9N2亞型禽流感病毒在我國(特別是南方地區(qū))持續(xù)流行，且宿主范圍廣泛，包括雞、鴨、珍珠雞、鵪鶉等[2-4]。近年來，在我國部分商品產(chǎn)蛋雞場及養(yǎng)雞專業(yè)村的流感調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型禽流感病毒抗體陽性雞群占總的流感病毒抗體陽性雞群的93.67%，說明H9N2亞型AIV在雞群中廣泛存在[5]。H9N2亞型AIV為低致病性禽流感病毒，在早期的研究中，試驗條件下接種SPF雞，一般不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀[6]。在養(yǎng)殖環(huán)境下，雞感染H9N2亞型AIV會產(chǎn)生呼吸困難、腹瀉、產(chǎn)蛋下降等癥狀，當(dāng)繼發(fā)細菌感染時可引起一定的死亡[7-9]。近些年來，根據(jù)本實驗室對臨床分離的H9N2亞型毒株研究發(fā)現(xiàn)，部分分離株對雞和雞胚的致病性顯著增強。強致病力毒株在雞體內(nèi)復(fù)制力強、排毒時間長，可以造成雞系統(tǒng)性感染，接種雞胚后，雞胚平均死亡時間(mean death time,MDT)顯著小于一般的H9N2毒株[10]。

為研究H9N2亞型毒株致病力增強的分子機制，本研究對2007年—2013年分離的部分H9N2亞型毒株進行了全基因組測定，并根據(jù)致病力試驗的結(jié)果，選擇了一對致病力存在明顯差異，且基因組差異相對較小的毒株。用RT-PCR擴增2株H9N2亞型病毒的8個基因全長片段,克隆入雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體PHW2000。將8個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，均拯救出了預(yù)期組合、有感染性的H9N2亞型流感病毒。這兩套H9N2亞型反向遺傳操作系統(tǒng)的建立，為基因功能、結(jié)構(gòu)及與宿主細胞相互作用的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒A/chicken/Shandong/818/2010(SD/818)分離自山東某雞場，據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)指定方法測定其MDT為60.5 h，IVPI為0.63；A/chicken/Shandong//2011(SD/196)分離自山東某活禽市場，其MDT為96.3 h，IVPI為0。

1.1.2試劑RNeasy Plus RNA提取試劑盒、Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit、DH5α感受態(tài)細胞，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Trans5K DNA Marker，北京全式金公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ、BsaⅠ、T4連接酶，NEB公司產(chǎn)品；DMEM(含有L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉)細胞培養(yǎng)液，HyClone公司產(chǎn)品；澳洲胎牛血清、PBS緩沖液、雙抗、2.5 g/L Trypsin-EDTA、Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，Gioco公司產(chǎn)品；Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑,Invitrogen公司產(chǎn)品；TPCK-Trypsin，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1禽流感病毒目的基因片段的擴增對收集的尿囊液按照RNeasy Plus RNA提取試劑盒說明書進行病毒總RNA的提取，并加入20 μL無RNA酶水溶解RNA。采用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit，對病毒基因組RNA模板進行RT-PCR。RT-PCR所用引物均參考Hoffmann E等報道[11]。

1.2.2反向遺傳操作系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建用BsmBⅠ或BsaⅠ酶切PHW2000載體質(zhì)粒，用BsaⅠ酶切病毒PB2和NA基因片段，用BsmBⅠ酶切PB1、PA、HA、NP、M、NS基因片段，利用T4連接酶連接PHW2000載體和目的基因片段。將連接好的載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，并篩選其中的陽性克隆，送北京六合華大基因技術(shù)服務(wù)公司測序，以確保陽性克隆序列的正確性。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性克隆質(zhì)粒并利用核酸定量儀進行質(zhì)粒定量。

1.2.3病毒的拯救

1.2.3.1細胞的準(zhǔn)備將293T細胞和MDCK細胞按照5∶1的比例鋪于6孔細胞板，鋪板后18 h～24 h進行轉(zhuǎn)染，此時細胞85%左右融合。進行轉(zhuǎn)染前用PBS緩沖液輕輕洗2次細胞。

1.2.3.2混合質(zhì)粒將流感病毒8個基因片段質(zhì)粒各500 ng加入1.5 mL離心管中。

1.2.3.3轉(zhuǎn)染加入200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基(無血清、無抗生素)于已加入質(zhì)粒的1.5 mL離心管中→加入10 μL Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑→瞬時離心以混勻→室溫放置45 min→加入200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基于離心管中；吸凈6孔板中的細胞液，用PBS緩沖液洗2次后，吸凈殘余的PBS；將1.5 mL離心管中的液體全部移入孔中，37 ℃培養(yǎng)6 h；加入含有2 μg/mL TPCK-胰酶的Opti-MEM培養(yǎng)基于6孔板中，1 mL/孔，37℃培養(yǎng)48 h～72 h后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4拯救病毒的增殖及鑒定

1.2.4.1增殖將轉(zhuǎn)染后凍存的細胞液從-80 ℃冰箱取出，待其融化后吹打混勻細胞液，接種于10日齡SPF雞胚，于37 ℃孵育72 h，收獲尿囊液，測定其凝集紅細胞的活性。若無血凝活性，則盲傳一代，放棄仍無血凝性的樣本。

1.2.4.2鑒定對拯救的病毒進行全基因組序列測定，然后通過與兩親本病毒基因組的比較來判定拯救的病毒的正確性。引物序列及病毒RNA提取、片段擴增和測序的方法同1.2.1。

1.2.5病毒復(fù)制力的測定參照Zhang Y等[12]報道的方法,測定并繪制拯救病毒和野生型病毒在MDCK細胞上的生長曲線；分別以106EID50劑量的拯救病毒和野生型病毒平行接種9枚雞胚，在接種后6、12、24、48 h，分別取3枚雞胚，測定其EID50，取平均數(shù)代表病毒在該時間點的復(fù)制情況，并繪制復(fù)制曲線。

1.2.6病毒對雞胚和雞致病力的測定按照OIE手冊介紹的方法，分別測定野生型和拯救毒株的雞胚平均死亡時間(MDT)和靜脈致病指數(shù)(IVPI)，以此來比較病毒對雞胚和雞的致病力。MDT測定方法為將收獲的尿囊液進行10倍比稀釋，接種10日齡SPF雞胚，連續(xù)觀察7 d，計算引起所有雞胚死亡的最大稀釋度使雞胚死亡的平均時間。IVPI的測定方法為將收獲的尿囊液10倍稀釋靜脈接種于6周齡SPF雞，觀察10 d并記分，正常雞記作0，病雞記作1，嚴(yán)重感染記作2，死亡雞記作3，計算10 d內(nèi)每日觀察記錄的平均值。

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取病毒的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后用帶有酶切位點的流感病毒通用引物進行PCR擴增，酶切后連入PHW2000載體，經(jīng)篩選和PCR鑒定呈陽性，且目的條帶大小與預(yù)期一致的克隆，進行序列測定，測序結(jié)果證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒所攜帶的目的基因序列，與原病毒基因序列完全一致(圖1)。

2.2病毒的拯救

通過轉(zhuǎn)染試劑，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的293T細胞。細胞液接種雞胚48 h～72 h后，收獲尿囊液，測定血凝活性，血凝活性均大于26，經(jīng)血凝抑制試驗鑒定，獲得的毒株為H9N2亞型禽流感病毒。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)PCR擴增，測定其序列，與原病毒序列進行比對，結(jié)果證實拯救獲得的病毒基因序列與原病毒序列完全一致。

2.3病毒的復(fù)制能力

2.3.1病毒在雞胚中的復(fù)制能力的測定分別將SD/818和拯救獲得的rSD/818，SD/196和rSD/196接種SPF雞胚，然后在不同的時間點收獲尿囊液，測定病毒滴度，比較野生毒株和拯救毒株在雞胚中的復(fù)制能力。結(jié)果顯示，野生型毒株SD/818與其拯救株rSD/818在各個時間點的復(fù)制情況基本一致。SD/196和rSD/196的復(fù)制情況也無顯著差異。然而在感染病毒后24、48 h，SD/818和rSD/818均比SD/196和rSD/196高約1個log10EID50/mL(圖2)。

A.SD/196；B.SD /818

1.PB2;2.PB1;3.PA;4.HA;5.NP;6.NA;7.M;8.NS;9.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000

1.PB2;2.PB1;3.PA;4.HA;5.NP;6.NA;7.M;8.NS;9.DNA Marker DL 5 000

圖1質(zhì)粒鑒定結(jié)果

Fig.1The results of plasmid identification

2.3.2病毒在MDCK細胞中的復(fù)制能力分別將野生型毒株和拯救獲得的毒株接種MDCK細胞后，在不同的時間點收獲細胞上清液，測定病毒的增殖情況(圖3)。結(jié)果顯示，2株病毒的野生型毒株和拯救毒株之間的復(fù)制情況基本一致，且兩組病毒間在MDCK細胞上的復(fù)制情況也無顯著差異。

2.4病毒對雞胚的致病力

將拯救獲得的毒株接種SPF雞胚，測得其MDT值(表1)，以此衡量病毒對雞胚的致病力。結(jié)果表明，SD/818與rSD/818的MDT無有顯著差異，SD/196與rSD/196的MDT也無顯著差異。證明拯救株相比野生型毒株，對雞胚的致病力未發(fā)生改變。

2.5病毒對SPF雞的致病力

將拯救的病毒靜脈接種SFP雞，觀察10 d，記錄發(fā)病和死亡情況，測得毒株的IVPI(表1)，以此衡量毒株對雞的致病力。結(jié)果證實，2株拯救獲得的毒株與野生型毒株相比，其IVPI未發(fā)生顯著變化，證明其對雞的致病力未發(fā)生變化。

3　討論

H9N2亞型禽流感病毒在我國流行十分廣泛，對我國的肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的危害。近些年來，在對病原的監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)部分H9N2亞型禽流感毒株可以在72 h內(nèi)致死雞胚，部分毒株甚至可以在48 h內(nèi)致死雞胚[13-15]。接種SPF雞后，發(fā)現(xiàn)這些毒株對雞呈現(xiàn)比較強的致病力，IVPI比2007年分離到的H9N2毒株顯著提高。本研究在以往臨床調(diào)查和實驗室研究的基礎(chǔ)上，選擇致病性不同而基因組相似的H9N2亞型禽流感病毒為研究對象，應(yīng)用生物信息學(xué)和反向遺傳學(xué)等技術(shù)，探討影響H9N2亞型流感病毒復(fù)制力和致病力的關(guān)鍵氨基酸位點，評價這些關(guān)鍵氨基酸位點對病毒組織嗜性、復(fù)制能力等影響，解析H9N2亞型禽流感病毒對雞致病力增強的分子機制。

圖2　H9N2野生型毒株與拯救毒株在雞胚中的復(fù)制情況Fig.2　The replication ability of H9N2 AIV field virus and rescued virus in chicken embryos

圖3　H9N2野生型毒株與拯救毒株在MDCK 細胞上中的復(fù)制情況Fig.3　The replication ability of H9N2 AIV field virus and rescued virus in MDCK cells表1　H9N2亞型野生型毒株和拯救毒株對雞胚 和SPF雞的致病力Table 1　Virulence of field virus and rescued virus in SPF chickens and chicken embryos

毒株Virus最小致死量的雞胚死亡時間/hMDT靜脈接種指數(shù)IVPISD/81860.50.63rSD/81862.50.60SD/19696.30rSD/19693.50

目前，關(guān)于H9N2亞型AIV感染力和致病力的分子機制的研究仍不夠深入，反向遺傳操作系統(tǒng)提供了一個可以從分子水平研究流感病毒致病性、種間傳播能力、病毒變異機制的平臺和基礎(chǔ)[16-17]。SD/818和SD/196病毒株反向遺傳系統(tǒng)的建立是研究H9N2亞型AIV的第一步，可以通過定點突變深入研究決定H9N2亞型AIV致病力及傳播能力的關(guān)鍵基因及位點，探索H9N2亞型AIV致病的分子基礎(chǔ)及跨種傳播的分子基礎(chǔ)，為預(yù)測流感的大流行提供依據(jù)。

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Establishment of Reverse Genetics System for Two Different Virulences of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus

FAN Dan-dan1△,ZHANG Yi2△，LIU Lin-lin3,WANG Dong-dong1,WANG Jian-lin1,XU Shou-zhen1,BI Yu-hai4,YIN Yan-bo1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong,266019,China;2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao,Shandong,266032,China;3.DanyangPreventionandControlCenterofAnimalDisease,Danyang,Jiangsu,212300,China;4.InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,100101China)

In order to obtain two stains of rescued H9N2 viruses,which showed different virulences to chickens,two sets of eight plasmid system were established.The rescued virus was generated by reserve genetic technique.The full genome of rescued virus was sequenced,and the results showed the rescued virus carried 100% homogeny whth their wild type.Theinvitroexperiment indicated the rescued virus carried identical replication ability in chicken embryos and MDCK celsl.The animal experimentinvivoshowed the virus maintained the same pathogenicity to embryos and SPF chickens.The above experiments proved the reverse genetic operating systems were established,which laid a solid foundation for researching the molecular mechanism of pathogenicity of H9N2 influenza virus.

H9N2 subtype avian influenza virus;higher pathogenicity;reverse genetics;infectious clone

2016-03-01

國家自然科學(xué)基金項目(31272535)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團隊建設(shè)項目(№SDAIT-13-011-03)

范丹丹(1990-)，女，山東棗莊人，碩士，獸醫(yī)師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。張毅(1983-)，男，山西定襄人，博士，主要從事獸醫(yī)流行病學(xué)研究?！魍蓉暙I作者。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)09-0005-05