張道杰,田明新,王小慧,孫佳惠,計(jì)娓娓,常海濤,盧東裕

(北京圣元惠仁醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所生化遺傳室　101101)

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·論著·

氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度評(píng)估

張道杰,田明新△,王小慧,孫佳惠,計(jì)娓娓,常海濤,盧東裕

(北京圣元惠仁醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所生化遺傳室101101)

目的對(duì)Waters公司ACQUITY TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀及其配套試劑檢測(cè)氨基酸、肉堿的程序進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)估，探討評(píng)估的意義。方法按照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室——測(cè)量不確定度的評(píng)定與表達(dá)》提供的方法，用兩種不同批號(hào)的試劑盒檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)控品各20個(gè)工作日，每個(gè)工作日在常規(guī)標(biāo)本檢測(cè)前、后各檢測(cè)一次質(zhì)控品，隨機(jī)更換檢測(cè)者，計(jì)算測(cè)量復(fù)現(xiàn)性引入的測(cè)量不確定度；統(tǒng)計(jì)原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2014年和2015年進(jìn)行的20次新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)、16次?；鈮A室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)，計(jì)算偏倚引入的測(cè)量不確定度；根據(jù)測(cè)量復(fù)現(xiàn)性引入的測(cè)量不確定度和偏倚引入的測(cè)量不確定度計(jì)算相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)擴(kuò)展不確定度。以原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評(píng)的允許總誤差指標(biāo)作為目標(biāo)擴(kuò)展不確定度。結(jié)果瓜氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙酰肉堿、辛酰肉堿、十二碳酰肉堿、十六碳酰肉堿、十八碳酰肉堿的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度為19.1%～26.1%(k=2)，小于目標(biāo)不確定度；亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、游離肉堿的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度為31.0%～43.3%(k=2)，大于目標(biāo)不確定度；異戊酰肉堿的不確定度需另行評(píng)估。結(jié)論通過(guò)氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度的評(píng)估，不僅可以為持續(xù)改進(jìn)檢測(cè)質(zhì)量提供機(jī)會(huì)，而且有助于實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員正確解讀檢測(cè)數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗(yàn)報(bào)告。

串聯(lián)質(zhì)譜；非衍生化；氨基酸；肉堿；不確定度

按照ISO15189：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的要求》，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為檢驗(yàn)過(guò)程中用于報(bào)告樣品被測(cè)量值的每個(gè)測(cè)量程序測(cè)量不確定度。目前血常規(guī)項(xiàng)目、臨床化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目已有測(cè)量不確定度評(píng)估的文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，但對(duì)濾紙干血斑氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度評(píng)估報(bào)道較少。為使臨床正確理解和應(yīng)用濾紙干血斑氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序，提高遺傳代謝病的實(shí)驗(yàn)診斷水平，本研究對(duì)濾紙干血斑氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度進(jìn)行了評(píng)估，評(píng)估對(duì)象包括瓜氨酸(CIT)、亮氨酸(LEU)、蛋氨酸(MET)、苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)、纈氨酸(VAL)和游離肉堿(C0)、丙酰肉堿(C3)、異戊酰肉堿(C5)、辛酰肉堿(C8)、十二碳酰肉堿(C12)、十六碳酰肉堿(C16)和十八碳酰肉堿(C18)，共13個(gè)原衛(wèi)生部臨檢中心開(kāi)展室間質(zhì)評(píng)的檢測(cè)項(xiàng)目?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源均為濾紙干血斑標(biāo)本。測(cè)量復(fù)現(xiàn)性引入的測(cè)量不確定度評(píng)估標(biāo)本來(lái)源于美國(guó)Perkin Elmer公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒(下文稱(chēng)PE試劑盒，包括氨基酸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品、酰基肉堿內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品、干血斑質(zhì)控品、V型底耐熱微孔板、V型截底潔凈微孔板、鋁箔制微孔板封套、黏性微孔板封套中的質(zhì)控品)。偏倚引入的測(cè)量不確定度評(píng)估標(biāo)本來(lái)源于原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本。

1.2儀器與試劑儀器為美國(guó)Waters公司的串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(包括串聯(lián)質(zhì)譜儀ACQUITY TQD、高效液相色譜儀1525μ、自動(dòng)進(jìn)樣器2777C)；試劑為PE試劑盒和溶劑包(包括萃取液和流動(dòng)相)。輔助儀器及試劑包括孵育振蕩器(Thermo IEMS Incubator/Shaker HT)、甲醇，均為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.3合成不確定度根據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室——測(cè)量不確定度的評(píng)定與表達(dá)》提供的方法計(jì)算相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel和相對(duì)擴(kuò)展不確定度urel。相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel計(jì)算式為ucrel=[ucrel(bias)2+urel(Rw)2]1/2。相對(duì)擴(kuò)展不確定度urel計(jì)算式為urel=k×ucrel，式中k包含因子，采用k=2，包含概率P=0.954 5。

1.3.4目標(biāo)不確定度選擇標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]，將原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評(píng)的允許總誤差指標(biāo)作為目標(biāo)擴(kuò)展不確定度[4-5]。

2　結(jié)　　果

氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表1。與目標(biāo)不確定度相比，CIT、MET、PHE、C3、C8、C12、C16、C18的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度滿(mǎn)足要求，而LEU、TYR、VAL、C0、C5的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度不滿(mǎn)足要求，但LEU、C0的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度接近目標(biāo)不確定度，只有TYR、VAL、C5的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度超過(guò)目標(biāo)不確定度較多。

表1　　氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果

續(xù)表1　　氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果

3　討　　論

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于遺傳代謝病的篩查與診斷，將實(shí)驗(yàn)診斷模式由“一種檢測(cè)、一個(gè)參數(shù)、一種疾病”轉(zhuǎn)為“一種檢測(cè)、多個(gè)參數(shù)、多種疾病”，一次檢測(cè)能同時(shí)提供50種氨基酸和肉堿參數(shù)，篩查或診斷幾十種遺傳代謝病，極大地推動(dòng)了新生兒遺傳代謝病篩查的發(fā)展。但該檢測(cè)程序標(biāo)本類(lèi)型為濾紙干血斑，上機(jī)前需標(biāo)本處理，儀器檢測(cè)原理明顯不同于常規(guī)臨床化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)方法有衍生、非衍生之分，所用試劑也有自配、配套之別[6]，其性能特征、質(zhì)量管理尚無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)，因此用于遺傳代謝病篩查與診斷的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)也存在不少問(wèn)題與挑戰(zhàn)[7]，也會(huì)出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性。因此筆者認(rèn)為，對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)的性能特征、質(zhì)量指標(biāo)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)的研究和評(píng)估，以便實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員正確解讀檢測(cè)數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗(yàn)報(bào)告。

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)，表達(dá)了測(cè)量值的可靠程度，因此對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)估有助于上述問(wèn)題的解決。本研究表明氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度因不同的檢測(cè)項(xiàng)目而不同，CIT、MET、PHE、C3、C8、C12、C16、C18的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度為19.1%～26.1%，LEU、TYR、VAL、C0的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度為31.0%～43.3%。利用這些項(xiàng)目的測(cè)量不確定度，實(shí)驗(yàn)室可以更全面地分析檢測(cè)數(shù)據(jù)，發(fā)出更恰當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)報(bào)告。比如新生兒濾紙干血斑PHE參考范圍為22～120 μmol/L,高苯丙氨酸血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)為PHE大于120 μmol/L、苯丙氨酸與酪氨酸的比值大于2[8]。若新生兒的PHE檢測(cè)值為140 μmol/L，結(jié)合其相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度為24.5%，則該新生兒本次檢測(cè)的PHE值的分布范圍為106～174 μmol/L，可理解為該新生兒本次檢測(cè)的PHE值也可能不大于120 μmol/L，因此該檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該建議重新采血復(fù)查，不可輕易下高苯丙氨酸血癥的實(shí)驗(yàn)診斷意見(jiàn)。若另一新生兒的PHE檢測(cè)值為160 μmol/L，則該新生兒本次檢測(cè)的PHE值的分布范圍為121～199 μmol/L，可理解為該新生兒本次檢測(cè)的PHE值95%的可能大于120 μmol/L，若苯丙氨酸與酪氨酸的比值也大于2，則該檢驗(yàn)報(bào)告就應(yīng)該明確提示高苯丙氨酸血癥，指導(dǎo)臨床進(jìn)一步確診。

既然測(cè)量不確定度對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員正確解讀檢測(cè)數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗(yàn)報(bào)告有指導(dǎo)作用，那么測(cè)量不確定度的評(píng)估就要從實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際出發(fā)，不可死搬教條。比如本研究中的C5，偏倚引入的相對(duì)測(cè)量不確定度已達(dá)37.59%，相比目標(biāo)不確定度(30.0%)而言太大，說(shuō)明當(dāng)前C5檢測(cè)程序的正確度不好，應(yīng)該進(jìn)行性能驗(yàn)證，查找原因，待正確度問(wèn)題解決后，再評(píng)估其測(cè)量不確定度。故本次C5的測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果作廢。

當(dāng)然，本研究評(píng)估的氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度相比臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目的測(cè)量不確定度而言[1]，數(shù)值較大，究其原因：首先，氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序所用的標(biāo)本類(lèi)型為濾紙干血斑，需要打孔取樣進(jìn)行前處理后再上機(jī)檢測(cè)。由于血斑上血量存在不同程度的分布不均勻情況，勢(shì)必造成重復(fù)打孔取樣誤差，而且前處理過(guò)程中還有轉(zhuǎn)移加樣操作，還存在加樣誤差。因此，相對(duì)于臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目的直接用血清(血漿)上機(jī)檢測(cè)，氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)程序的前處理過(guò)程加大了測(cè)量復(fù)現(xiàn)性引入的測(cè)量不確定度；其次，原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和酰基肉堿室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)(從2014年正式開(kāi)始)發(fā)放的標(biāo)本中[9]，有些標(biāo)本的?；鈮A濃度過(guò)低(低于檢測(cè)系統(tǒng)的功能靈敏度，且?；鈮A濃度降低對(duì)診斷遺傳代謝病意義不大)，容易造成偏倚過(guò)大，這也可能加大偏倚引入的測(cè)量不確定度。基于此，本次評(píng)估?；鈮A的偏倚引入的測(cè)量不確定度未選擇濃度過(guò)低的標(biāo)本的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

此外，本研究表明，參照衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)建議的臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目目標(biāo)不確定度設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)[3]，將原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評(píng)的允許總誤差指標(biāo)作為目標(biāo)擴(kuò)展不確定度是可行的，大部分氨基酸和?；鈮A的相對(duì)合成擴(kuò)展不確定度小于允許總誤差。對(duì)于大于目標(biāo)不確定度的檢測(cè)項(xiàng)目，應(yīng)該查找原因，改進(jìn)檢測(cè)程序，提高檢驗(yàn)質(zhì)量，從而提高遺傳代謝病實(shí)驗(yàn)診斷水平。

綜上所述，通過(guò)對(duì)氨基酸及肉堿非衍生

化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度的評(píng)估，不僅可以客觀地認(rèn)識(shí)檢測(cè)系統(tǒng)的性能，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)存在的問(wèn)題[10]，為持續(xù)改進(jìn)提供機(jī)會(huì)[11-12]，而且有助于實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員正確解讀檢測(cè)數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗(yàn)報(bào)告。

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Evaluation on measurement uncertainty of detecting procedure of amino acids and carnitines by using non-derivatized tandem mass spectrometry method

ZHANGDaojie,TIANMingxin△,WANGXiaohui，SUNJiahui，JIWeiwei，CHANGHaitao，LUDongyu

(DepartmentofBiochemicalGenetics,BeijingShengyuanHuirenMedicalLaboratoryInstitute,Beijing101101,China)

ObjectiveTo evaluate the measurement uncertainty of the detecting procedure of amino acids and carnitines by the Waters ACQUITY TQD tandem mass spectrometer and PerkinElmer NeoBaseTMnon-derivatized MSMS kit,and to discuss the meaning of evaluation.MethodsAccording to the method provided by the Medical Laboratories-Evaluation and Expression of Measurement Uncertainty,the internal quality control was detected by using two different batch codes of kit for 20 d,once before and after the routine sample detection on each working day,the detector were randomly changed,and then the measurement uncertainty introduced by measurement reproducibility was calculated;the amino acid external assessment quality control data in 20 times of neonatal hereditary metabolic disease tandem mass spectrometry screening provided by the National Center for Clinical Laboratory in 2014 and 2015,and the same and 16 times of carnitines external assessment quality control data were performed the statistics,and then the measurement uncertainty introduced by bias was calculated.Next the relative standard uncertainty and the relative expanded uncertainty according to the measurement uncertainty introduced by bias and measurement reproducibility were calculated.The allowed total error indicators of amino acid and carnitines external quality assessment in the neonatal hereditary metabolic disease tandem mass spectrometry screening by the National Center for Clinical Laboratory were used as the target expanded uncertainty.ResultsThe relative expanded uncertainties of citrulline,methionine,phenylalanine,propionyl carnitine,octanoyl carnitine,dodecanoyl carnitine，palmitoyl carnitine and octadecanoyl carnitine were 19.1%-26.1%(k=2)，which were smaller than the target uncertainty.The relative expanded uncertainties of leucine,tyrosine,valine,free carnitine were 31.0%-43.3%(k=2)，which were greater than the target uncertainty.The uncertainty of isovaleryl carnitine needed to be estimated separately.ConclusionAssessing the measurement uncertainty of the detecting procedure of amino acids and carnitines by the non-derivatized tandem mass spectrometer method can not only provide an opportunity for continuously improving the detection quality，but also can help the experimental technique staffs to interpret the test data correctly and the clinician to use the detection reports correctly.

tandem mass spectrometer；non-derivatized；amino acid；carnitine；measurement uncertainty

張道杰，男，副主任技師，主要從事實(shí)驗(yàn)室管理及遺傳代謝病的實(shí)驗(yàn)診斷研究?！?/p>

，E-mail：tianmingxin@shengyuan.com.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.026

A

1673-4130(2016)17-2423-04

2016-03-23

2016-05-29)