袁　鵬　劉學(xué)政

天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部　天津　300222；①錦州醫(yī)科大學(xué)

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咖啡酸苯乙酯對(duì)糖尿病大鼠血視網(wǎng)膜屏障的影響

袁鵬劉學(xué)政①

天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部天津300222；①錦州醫(yī)科大學(xué)

①目的觀察咖啡酸苯乙酯(CAPE)對(duì)糖尿病大鼠血視網(wǎng)膜屏障的影響。②方法將鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組：DM組不使用任何藥物；CAPE5組每3天腹腔注射CAPE 5mg/kg；CAPE 10組每 3 天腹腔注射CAPE 10mg/kg；另取正常大鼠作為對(duì)照組(CON組)。3個(gè)月以后，分光光度計(jì)比色法定量分析視網(wǎng)膜示蹤物伊凡思藍(lán)的滲漏量，用視網(wǎng)膜干重(mg)標(biāo)準(zhǔn)化伊凡思藍(lán)(ng)含量。③結(jié)果4組大鼠視網(wǎng)膜伊凡思藍(lán)滲漏量分別為： CON 組(11.62±3.35)ng/mg； DM 組(54.31±4.89)ng/mg；CAPE5組(29.65±3.88)ng/mg；CAPE10組(26.51±4.05)ng/mg。DM組大鼠視網(wǎng)膜伊凡思藍(lán)滲漏量較CON組增加了3.7倍(P<0.01)，CAPE5組和CAPE10組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜伊凡思藍(lán)滲漏量較DM組分別減少了45%(P<0.05)和51%(P<0.05)，但CAPE5組和CAPE10組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。④結(jié)論CAPE可對(duì)糖尿病大鼠血視網(wǎng)膜屏障的破壞起到保護(hù)作用。

糖尿病視網(wǎng)膜病變血視網(wǎng)膜屏障咖啡酸苯乙酯

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病微血管病變和神經(jīng)性病變?cè)谘鄣转?dú)特環(huán)境中的表現(xiàn)，可對(duì)視力造成不可挽回的影響，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的難題之一。近年的研究試驗(yàn)證明DR是一種低度的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，在微觀層次，DR與炎癥反應(yīng)有許多共同點(diǎn)[1]，這些共同點(diǎn)包括毛細(xì)血管的擴(kuò)張、滲出、血流動(dòng)力學(xué)的改變、白細(xì)胞的粘附、聚集和遷移等。血視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)是視網(wǎng)膜組織生理的一個(gè)重要組成部分，正常BRB對(duì)于維持視網(wǎng)膜的透明性、正常代謝和感光功能必不可少。糖尿病狀況下，氧化應(yīng)激水平升高造成的細(xì)胞毒作用和炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的白細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附以及視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞凋亡是引起B(yǎng)RB破壞的主要原因。研究藥物對(duì)BRB的保護(hù)作用成為DR藥物研發(fā)的切入點(diǎn)之一。咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)是一種從蜂膠中分離出的酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)作用，是一種有效的特異性NF-κB抑制劑[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究CAPE對(duì)糖尿病大鼠BRB的保護(hù)作用，以初步觀察CAPE在治療DR中的藥理作用，為藥物治療DR探索可能的方法。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料雄性清潔級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220g，購自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于溫度為25℃、濕度為40%的動(dòng)物房普通飼料喂養(yǎng)。CAPE購自美國IL公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司，One Touch II血糖測(cè)定儀購自美國強(qiáng)生Lifescan公司，超聲波細(xì)胞破碎儀(VCX105型,Sonics & materials公司)，真空干燥箱(DZF-150型，南方干燥設(shè)備有限公司)，紫外可見分光光度計(jì)(UV-2550型，島津公司)。

1.2模型制備與分組大鼠禁食12小時(shí)后,按45mg/kg尾靜脈注射1%STZ溶液[0.1mol/L的檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)配制]；48小時(shí)后尾靜脈采血測(cè)血糖，以后每月測(cè)1次，將血糖濃度大于16.7mmol/L的大鼠定為糖尿病模型大鼠。取30只糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。DM組不使用任何藥物，CAPE 5組每3天腹腔注射CAPE 5mg/kg，CAPE 10組每3天腹腔注射CAPE 10mg/kg。3個(gè)月以后3組各剩下8、8、9只大鼠。另取10只SD大鼠,注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為正常對(duì)照組(CON 組)。

1.3BRB破壞的定量分析水合氯醛麻醉大鼠，按30mg/kg體質(zhì)量自尾靜脈注射伊凡思藍(lán)(Evans Blue，EB)，循環(huán)2小時(shí)后打開胸腔，左心室灌注預(yù)熱至37℃的檸檬酸鈉緩沖液配制的1%多聚甲醛溶液(pH=4.5)，壓力為100mmHg，灌注2分鐘。灌注后立即取出大鼠眼球，體視鏡下分離視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜真空干燥5小時(shí)，電子天平稱重。將單個(gè)視網(wǎng)膜置于120μL甲酰胺中，70℃水浴抽提，18小時(shí)后移至超濾離心管中。4℃、12000r/min離心45分鐘，取上清液50μL。使用分光光度計(jì)分別測(cè)量EB在620nm處的最大吸收光值和720nm處的最小吸收光值(每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值)。計(jì)算凈吸光度值=A620nm-A720nm。用視網(wǎng)膜干重(mg)和標(biāo)準(zhǔn)化EB(ng)含量表示，結(jié)果為ng/mg。

2　結(jié)果

計(jì)算出EB在甲酰胺中的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y=0.0829x+0.0054。由此計(jì)算出各組樣品比色值相應(yīng)EB濃度。

表1　各組大鼠EB滲漏量比較

注：與CON組比較,*P<0.01；與DM組比較,#P<0.05；與CAPE5組比較,※P>0.05

4組大鼠視網(wǎng)膜EB滲漏量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=166.87，P<0.01)。DM組大鼠視網(wǎng)膜EB滲漏量較CON組增加了3.7倍(P<0.01)，CAPE5組和CAPE10組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜EB滲漏量較DM組分別減少了45%(P<0.05)和51%(P<0.05)，但CAPE5組和CAPE10組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表 1。

3　討論

BRB在空間上有內(nèi)外兩層：內(nèi)層是由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及連接組成的內(nèi)皮性屏障，外層是由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及連接組成的上皮性屏障，BRB的破壞是DR早期的特征性病理改變，BRB破壞造成的視網(wǎng)膜血管滲漏在糖尿病患者和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠均可觀察到。

為數(shù)眾多的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)參與了BRB的破壞，這些因子由病變組織本身及浸潤的白細(xì)胞分泌而來，或因BRB的破壞由血清而來，并且相互作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和相互關(guān)聯(lián)的作用通路，共同影響DR的發(fā)生和發(fā)展。NF-κB是一種參與一系列基因表達(dá)調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子，在免疫和炎癥反應(yīng)中起著重要作用，糖尿病狀況下，升高的炎性介質(zhì)和高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)等可作為細(xì)胞外信號(hào)活化NF-κB[3～5],活化的NF-κB可介導(dǎo)ICAM-1、IL-1β、COX-2和VEGF等與BRB破壞密切相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，被視為糖尿病微血管病變的中心調(diào)控因子。

ICAM-1介導(dǎo)的白細(xì)胞和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附被認(rèn)為在DR的發(fā)生、發(fā)展中起到始動(dòng)作用，是DR在微血管水平病理變化的開端，可造成毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷、BRB的破壞以及毛細(xì)血管無灌注的形成。內(nèi)源性和外源性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)均可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管ICAM-1 的表達(dá)[6～8]，VEGF和ICAM-1相互關(guān)聯(lián)，是BRB破壞和視網(wǎng)膜新生血管形成的主要調(diào)節(jié)因素。早期研究結(jié)果表明，使用CAPE后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)水平均得到了明顯抑制[9],因此，CAPE可能通過抑制糖尿病狀況下升高的NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性減少VEGF和ICAM-1的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而對(duì)BRB起保護(hù)作用。

視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞具有微血管屏障、收縮血管、調(diào)節(jié)血容量、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和限制新生血管擴(kuò)展等作用，損傷后直接引發(fā)BRB的破壞。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡依賴于NF-κB的激活[10]，NF-κB引發(fā)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡是BRB破壞的重要原因。因此CAPE可能通過抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性抑制周細(xì)胞的凋亡，對(duì)BRB起保護(hù)作用。

高血糖誘導(dǎo)的代謝異常明顯造成視網(wǎng)膜微血管病變，活性氧(reactive oxygen specie，ROS)和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是高血糖和微血管病變之間的紐帶[11]。ROS能使細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的不飽和脂肪酸氧化，氧化產(chǎn)物產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用能損傷視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜，導(dǎo)致BRB的破壞和血液流變學(xué)的改變。CAPE結(jié)構(gòu)中含有一對(duì)臨位酚羥基，其中一個(gè)羥基供氫氧化成羰基之后易與另一個(gè)羥基形成穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵，從而阻礙電子奪取鏈反應(yīng)。因此，CAPE亦可能通過自身供氫氧化，中斷各種原因引起的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷，對(duì)BRB起到保護(hù)作用。

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(2016-03-17收稿)(庫雪飛編輯)

The effects of caffeic acid phenethyl ester on the blood-retinal barrier of diabetic rats

YUANPeng,LIUXuezheng

(BasicMedicalDepartmentofTianjinMedicalCollege,Tianjin300222,China)

ObjectiveTo observe the effects of caffeic acid phenethyl ester on the blood-retinal barrie of diabetic rats.MethodsDiabetic rats induced by streptozotocin were divided into three groups,diabetic group(DM),do not use any drugs;CAPE5 group,according to 5mg/kg,intraperitoneal injection of CAPE every 3 days；CAPE10 group,according to 10mg/kg,intraperitoneal injection of CAPE every 3 days；other rats were in normal control group(CON).3 months later,Using the Spectrophotometer colorimetric method to analysis the leakage of retinal tracer assessed by Evans Blue.ResultsThe amount leakage of evans blue in four groups were:CON group(11.62±3.35) ng/mg;DM group(54.31±4.89)ng/mg;CAPE5 group(29.65±3.88) ng/mg;CAPE10 group(26.51±4.05)ng/mg.The amount leakage of evans blue in DM group was 3.7 times higher than that in CON group (P<0.01);CAPE5 group and CAPE10 group retina evans blue leakage compared with the DM group were reduced by 45% (P<0.05) and 51% (P<0.05)，but there was no obvious difference between the CAPE5 group and CAPE10 group(P>0.05).ConclusionCaffeic acid phenethyl ester can protect the blood-retinal barrier of diabetic rats.

Diabetic retinopathy.Blood-retinal barrier.Caffeic acid phenethyl ester

袁鵬(1981-)，男，碩士研究生，講師。研究方向：糖尿病視網(wǎng)膜病變。

劉學(xué)政。

R 587.1,R 774

A

2095-2694(2016)04-268-04