熊艷杰　裴銀輝　朱玉芳　周芳媛　英艷飛　董素寧

華北理工大學　河北唐山　063000

?

風濕寒癥型類風濕性關節(jié)炎動物模型滑膜CD3、CD21和CD68的表達

熊艷杰裴銀輝朱玉芳周芳媛英艷飛董素寧

華北理工大學河北唐山063000

①目的探討風濕寒癥型大鼠類風濕性關節(jié)炎(RA)模型滑膜區(qū)域主要免疫細胞CD3、CD21、CD68的表達。②方法免疫組織化學方法檢測風濕寒癥型RA模型組(模型組)和對照組大鼠關節(jié)滑膜區(qū)域CD3、CD21和CD68的表達，分析該區(qū)域的主要免疫細胞成分。③結果模型組在造模后第21、28、35、42天CD3平均表達率呈逐漸上升趨勢，第42天最高；且各時間點均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組與對照組CD21在各時間點相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組CD68在造模后第28天和35天的表達率高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。④結論風濕寒癥型RA動物模型滑膜區(qū)域炎細胞浸潤有T淋巴細胞和巨噬細胞，而其中T淋巴細胞是主要免疫細胞，B淋巴細胞與RA局部滑膜組織的損傷無關。

類風濕性關節(jié)炎滑膜CD3CD21CD68

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、全身性免疫疾病，典型病變以關節(jié)滑膜炎及關節(jié)損壞和畸形為主，臨床多表現(xiàn)為對稱性及周圍關節(jié)病變，病變可能侵犯全身各個器官如心臟、肝臟、脾臟、腎臟及動脈等[1]。RA最主要的病理表現(xiàn)為滑膜炎，其形態(tài)學特點為滑膜細胞的增生、襯里下層大量炎癥細胞浸潤、間質(zhì)纖維化及新生血管形成等。隨著基礎和臨床研究的進展，RA滑膜區(qū)域的免疫特性研究及重要炎癥細胞在啟動和維持滑膜免疫炎癥反應中的作用受到更多風濕學界學者的關注，本研究將通過免疫組織化學方法檢測RA動物模型滑膜區(qū)域CD3、CD21和CD68的表達，分析該區(qū)域的主要免疫細胞成分。

1　材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物。5周齡雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為(130.25±15.36)g，購自華北理工大學實驗動物中心[動物許可證號：SCXK(軍)2014-0001]。大鼠適應性喂養(yǎng)1周,隨機分兩組：模型組和對照組，每組20只。所有動物均在同等條件下喂養(yǎng)(動物房許可證號：SYXK2015-0038)，自由飲水進食，普通飼料定時定量喂養(yǎng)，選擇光線充足，通風良好的實驗環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.2實驗試劑。CD3抗體(ZM-0417)、CD21抗體(ZM-0525)、羊抗兔/小鼠二抗(PV6000)和DAB均購于中杉金橋生物技術有限公司；CD68抗體(RLM 3161)購于蘇州睿瀛生物技術有限公司；卡介苗(上海瑞楚生物科技有限公司)；羊毛脂(中國嘉定華亭羊毛脂廠產(chǎn)品))；液體石蠟(天津市大茂化學試劑廠)。

1.2實驗方法

1.2.1風濕寒癥型RA動物模型造模方法。模型組大鼠右后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(CFA) 0.1mL,同時將大鼠置于4℃冷水中,水深2cm,站立40分鐘,同時伴以4級風力。除注射CFA外，其他風濕寒癥處理每天1次,連續(xù)造模14天。對照組于大鼠右后足趾皮內(nèi)注射生理鹽水0.1mL,不進行其他處理。

1.2.2實驗數(shù)據(jù)采集。每天記錄大鼠一般狀態(tài)，包括毛發(fā)、行動、進食及精神狀態(tài)，耳、尾、足是否出現(xiàn)關節(jié)紅腫及其他炎癥反應。從造模第一天開始，分別在第 21、28、35、42天隨機抽取兩組大鼠各5只，測量并記錄每只大鼠的體重和關節(jié)腫脹度；取大鼠右后肢踝關節(jié)，EDTA脫鈣液脫鈣約30天后脫水包埋制成病理蠟塊行HE切片及免疫組化染色。

1.2.3CD3、CD21和CD68的免疫組化檢測步驟。每個踝關節(jié)蠟塊分別切片三張貼附于免疫組化粘附載玻片上，且每張切片下同時撈取扁桃體組織做陽性對照，滴加PBS代替一抗做陰性對照行免疫組織化學染色。69℃烤片2小時后分別進行CD3、CD21和CD68免疫組織化學染色，具體操作見二抗說明書進行。

1.3免疫組化結果判斷CD3和CD21陽性表達均定位在細胞膜，細胞膜有棕黃色顆粒著色判為陽性細胞。CD68陽性表達定位在細胞漿，細胞漿有棕黃色顆粒著色判為陽性細胞。CD3和CD21兩個抗體每張切片隨機選取5個高倍視野，計數(shù)每個視野網(wǎng)格測微尺內(nèi)每100個淋巴細胞中該抗體陽性細胞個數(shù)，得出陽性表達百分率，5個高倍視野陽性表達百分率/5得出每張切片該抗體陽性表達百分率均數(shù)；CD68陽性細胞百分率以整張切片滑膜增生細胞中的CD68陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)計算。

1.4統(tǒng)計學分析應用SPSS 11.5 軟件進行統(tǒng)計學分析，多組均數(shù)比較應用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，檢驗水準取雙側α=0.05。

2　結果

2.1模型組大鼠表現(xiàn)模型組大鼠造模后3～21天，大鼠精神欠佳，右足爪紅腫，右足趾皮下軟組織逐漸腫脹，關節(jié)滑膜表現(xiàn)軟組織慢性炎癥，中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞增多；28天后大鼠輕度脫毛，食欲減退，體重無明顯增長，足趾表面腫脹嚴重，皮膚開始潰爛，滑膜由單層變復層，滑膜組織增生水腫，新生血管增多，血管翳形成，慢性炎癥明顯；35天大鼠足趾表面腫脹減輕，皮膚潰爛嚴重，滑膜層次增多，關節(jié)腔間隙變窄，關節(jié)炎、纖維化明顯；42天時，大鼠行動遲緩，足爪紅腫減輕，可見踝關節(jié)及足趾畸形，關節(jié)軟骨出現(xiàn)剝脫性病變，關節(jié)腔結構紊亂有炎性細胞浸潤。對照組大鼠各階段均無皮下腫脹及關節(jié)畸形現(xiàn)象，滑膜細胞無增生和水腫表現(xiàn)。結合大鼠關節(jié)和滑膜表現(xiàn)，說明風濕寒癥型RA動物模型造模成功。

2.2模型組與對照組滑膜區(qū)域不同時間CD3、CD21和CD68的表達情況本實驗中模型組大鼠關節(jié)滑膜炎組織中大量表達CD3細胞，部分表達在淋巴濾泡周圍，陽性細胞胞膜呈棕黃色顆粒狀，細胞核為藍色(圖a)；正?；そM織極少量表達CD3抗體。模型組CD3抗體在造模后第21、28、35、42天的平均表達率分別為54%、60%、74%和83%，呈逐漸上升趨勢，第42天最高。第35天和第42天的表達率均高于第21天，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且第42天與第28天相比差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組CD3抗體在造模后第21、28、35、42天的表達率均高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。提示RA滑膜組織中T淋巴細胞數(shù)量增加，且RA的嚴重程度與T淋巴細胞浸潤數(shù)量相關。

表1　模型組與對照組各時間點CD3、CD21和CD68的表達

注：與對照組比較，*P<0.05;與同組21天比較,△P<0.05；與同組28天比較,#P<0.05

關節(jié)滑膜炎組織淋巴濾泡中有部分細胞表達CD21抗體，陽性表達在細胞膜，在濾泡外其他淋巴細胞中也有散在陽性細胞表達(圖b)；正?；そM織少許細胞表達CD21抗體。模型組CD21抗體在造模后第21、28、35、42天的平均表達率逐漸上升，分別為23%、35%、44%和51%，第42天最高。CD21抗體在造模后第21、28、35、42天，模型組與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。提示正常滑膜組織中亦有一定數(shù)量B淋巴細胞，B淋巴細胞在滑膜組織的浸潤與RA局部滑膜組織的損傷無關。

滑膜炎組織淋巴濾泡中亦有散在細胞的細胞漿表達棕黃色顆粒，這些細胞表達CD68抗體，淋巴濾泡外圍細胞散在陽性，另可見滑膜下層組織中少許星狀細胞表達CD68抗體(圖c)，提示滑膜炎組織中存在巨噬細胞；而正?；そM織細胞中只有極少量CD68抗體表達(圖d)。模型組CD68抗體在造模后第21、28、35、42天表達率逐漸上升，分別為17%、28%、30%和31%，同樣為第42天最高。CD68分子表達率在造模后第28天和35天模型組高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在造模后第21天和42天，模型組與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。提示滑膜炎組織中巨噬細胞增多，可能參與RA滑膜組織炎癥的形成與發(fā)展。

注：a：RA模型組滑膜組織CD3陽性表達；b：RA模型組滑膜組織CD21陽性表達；c：RA模型組滑膜組織CD68陽性表達；d：正常組陰性表達

圖1模型組與正常組CD3、CD21和CD68免疫組化染色(IHC×400)

3　討論

RA是以關節(jié)滑膜炎為特征，由多種免疫細胞及其分泌的細胞因子相互作用的一種自身免疫性疾病。 RA的病理表現(xiàn)為關節(jié)滑膜增生、炎性細胞浸潤及滲出、血管翳形成，最終導致關節(jié)腔隙變窄，關節(jié)軟骨剝脫破壞。關節(jié)的病變過程中有多種細胞參與導致炎癥反應，例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、中性粒細胞及巨噬細胞的滲出和浸潤。CD3是存在于胸腺細胞、靜止和活化T淋巴細胞上的一種T細胞標記物，在95%以上的T細胞陽性表達，常用于總T細胞的標記，而B淋巴細胞、巨噬細胞、骨髓細胞及任何其他細胞均不表達。CD3是目前T細胞標記物的首選。CD21是人類皰疹病毒4型病毒的受體和B淋巴細胞的重要標記物,T淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞均不表達。CD68是巨噬細胞最可靠的標記物,這種抗原常在和溶酶體相關的胞漿蛋白中表達。本實驗CD3抗體在風濕寒癥型RA動物模型造模后第21、28、35、42天關節(jié)滑膜炎組織細胞呈陽性表達，其表達率呈逐漸上升趨勢。模型組第42天，滑膜增生增厚、血管翳侵入關節(jié)腔內(nèi)嚴重破壞關節(jié)軟骨時CD3表達率最高；且模型組CD3在4個時間點的表達率均高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示滑膜炎組織中大量表達T淋巴細胞，且隨著RA癥狀的加重，CD3表達率增加，T淋巴細胞炎細胞作用越明顯。模型組滑膜炎組織中的淋巴濾泡及少數(shù)散在的炎性細胞表達CD21抗體，但在4個時間點與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示正常滑膜組織中亦有一定數(shù)量B淋巴細胞，B淋巴細胞在滑膜組織的浸潤與RA局部滑膜組織的損傷無關。模型組CD68抗體表達率在造模后關節(jié)炎癥最重時期即造模第28天和35天高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在第21天和42天差異無統(tǒng)計學意義，提示模型組滑膜炎組織中巨噬細胞增多，可能參與炎癥的形成與發(fā)展。這與Fabien Dépis等報道相一致[2]，提示T淋巴細胞和巨噬細胞均參與了RA關節(jié)滑膜炎癥發(fā)生發(fā)展的過程，但是T淋巴細胞是最主要的炎癥因子。

T淋巴細胞受外界抗原刺激分泌多種細胞因子并釋放從而使機體產(chǎn)生細胞免疫應答。在T淋巴細胞的作用中，CD4+T 細胞亞群(Th細胞) 可能在RA的發(fā)病機理中扮演重要角色[3]。根據(jù)細胞分泌因子的作用，Th細胞可分為Th0細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)。Th0細胞為Th1細胞和Th2細胞的前體細胞，由白細胞介素(IL)-12等細胞因子分化而來；Th1細胞主要分泌的細胞因子有IL-2、IL-12、IFN-γ(γ干擾素)、TNF(β腫瘤壞死因子)等，參與細胞免疫的調(diào)節(jié)并輔助細胞毒性T細胞和單核巨噬細胞的分化[4]，介導細胞免疫應答引起炎性細胞因子的產(chǎn)生，導致炎癥的產(chǎn)生；Th2主要分泌抑炎細胞因子如IL-4、IL-6和IL-10等,其具有增強由B淋巴細胞介導的體液免疫應答的作用，促進IgE的產(chǎn)生,嗜酸性粒細被激活，從而產(chǎn)生抗炎細胞因子[5,6]；Th17細胞是不同于Th1細胞和Th2細胞的一種Th細胞亞群[7]，它分泌IL-17促炎細胞因子，通過破骨細胞生成和誘導基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),促進關節(jié)滑膜炎癥和骨損傷致關節(jié)畸形[8,9];而Treg細胞亦是近年來研究的一種特殊的細胞亞群，它釋放的抑制性細胞因子(TGF)-β和IL-10參與調(diào)控RA中的炎癥性免疫應答過程，且Th17和Treg細胞可能在微環(huán)境細胞因子的作用下相互轉化，調(diào)節(jié)Th17/Treg之間的平衡是RA治療的一個重要研究目標[10]。本課題目前只分析出RA滑膜區(qū)域炎性因子的滲出和浸潤主要為T淋巴細胞，其主要作用機制還有待進一步實驗研究。除了T淋巴細胞與RA關節(jié)滑膜炎的發(fā)生和發(fā)展有重要聯(lián)系，在RA早期病理變化中，滑膜炎癥細胞中巨噬細胞在細胞因子的激活下，在炎癥組織局部增多聚集，亦與滑膜細胞的增生水腫及血管翳的形成有關[11]。本實驗中CD68標記的巨噬細胞在滑膜增生細胞和局部炎性組織中均有增多，隨著RA癥狀的加重，巨噬細胞表達量越高，血管翳對關節(jié)軟骨的破壞越嚴重，且在模型組滑膜炎癥最重及血管翳形成時期CD68與對照組相比差異具有顯著性，提示巨噬細胞與RA滑膜炎的發(fā)生和進展相關。

綜上所述，風濕寒癥型RA大鼠模型滑膜炎組織中T淋巴細胞和巨噬細胞增多，而RA的嚴重程度與T淋巴細胞浸潤數(shù)量相關，提示T淋巴細胞是RA滑膜區(qū)域的主要免疫細胞。而B淋巴細胞在滑膜組織的浸潤與RA局部滑膜組織的損傷無關，雖然模型組大鼠在造模后B淋巴細胞有較高的表達，但其與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，只能說明滑膜炎性細胞有B林巴細胞的滲出，其作用不是很明顯，這與吳桂英[12]的研究不一致，因此，確切的研究結果尚需今后的進一步實驗證實。

[1]溫博,曾升平.類風濕關節(jié)炎的研究進展[J].世界中西醫(yī)結合雜志,2014,9(9):1014-1016

[2]Fabien Dépis,Eric Hatterer,Céline Lamacchia,et al.Long-term amelioration of established collagen-induced arthritis achieved with short-term therapy combining anti-CD3 and anti-tumor necrosis factor treatments[J].Arthritis & Rheumatism,2012,64(10):3189-3198

[3]Shawn D. P. Ellis,Jenny L. McGovern,André Maurik,et al. Induced CD8+FoxP3+ Treg Cells in Rheumatoid Arthritis Are Modulated by p38 Phosphorylation and Monocytes Expressing Membrane Tumor Necrosis Factorα and CD86[J]. Arthritis & Rheumatology, 2014, 66(10): 2694-2705

[4]Brown Chrysothemis, Esterhazy Daria, Sarde Aurelien, et al.Role of retinoic acid in the stability of the T-helper-type 1 lineage and implications for autoimmunity[J].Lancet,2015,385(2) :25-26

[5]Gerald T.NePom the role of the DR4 shared epitope in selection and autoreactive T cells in rheumatoid arthritis[J].Rheumatic Disease Clinics of North Ameriea,2001,27(2):305-313

[6]Kimmig S, Baumgrass R. Biological switches:the'all-or-none' principle in T-cell activation[J].Rheumatol,2009,7(9):560-565

[7]Renata I. Mazzucchelli,Agostino Riva,Scott K. Durum. The human IL-7 receptor gene: Deletions, polymorphisms and mutations[J]. Seminars in Immunology,2012,24(3):225-230

[8]楊金娜,劉曉光,李覃,等.Th17/Treg平衡在類風濕關節(jié)炎中作用的研究進展[J].中國藥理學通報,2013,29(8):1045-1048

[9]Paulissen Sandra M J,Van Hamburg Jan Piet,Dankers Wendy,et al.The role and modulation of CCR6+ Th17 cell populations in rheumatoid arthritis[J]. Cytokine,2015,74(1):43-55

[10]Komatsu Noriko,Takayanagi Hiroshi.Regulatory T cells in Arthritis[J].Progress in molecular biology and translational science,2015,13(6): 207-215

[11]嚴瀚,劉恩志,周漢城,等. 類風濕關節(jié)炎中巨噬細胞移動抑制因子對內(nèi)皮細胞功能及血管內(nèi)皮生長因子的影響[J]. 中華關節(jié)外科雜志,2013,7(3):373-377

[12]吳桂英,李鴻斌.調(diào)節(jié)性B細胞與類風濕關節(jié)炎活動相關性[J].臨床薈萃,2014,29(9):1072-1075

(2016-03-31收稿)(張愛國編輯)

The expression of CD3,CD21,CD68 in synovial membrane of rheumatic cold symptoms type of RA rat models

XIONGYanjie,PEIYinhui,ZHUYufang,etal

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo discuss the expression of the major immune cells in synovial membrane of rheumatic cold symptoms type of RA rat models.MethodsIHC was performed to detect the expression of synovial membrane of CD3,CD21,CD68 in RA model group and normal group.Analyzed the main immune cell components in the regional of synovial membrane.ResultsThe average expression rate of CD3 antibody in model group was gradually increasing in the 21th,28th, 35th and 42th day after modeling,and the highest was the 42th day.Compared with the normal group, the model group had significant difference at the 21th,28th, 35th and 42th day after modeling(P<0.05);Compared with the normal group,the average expression rate of CD21 in model group had no significant difference at the four stages(P>0.05),the expression of CD68 in model group at the 28th and 35th day were higher than the normal group,the difference was significant(P<0.05).ConclusionThe inflammatory cells in the synovial membrane of RA has T lymphocytes and macrophages, and B lymphocytes are not related to the local synovial tissue of RA, but T lymphocytes are the main immune cells of RA.

Rheumatoid arthritis.Synovial membrane.CD3.CD21.CD68

熊艷杰(1989-)，女，研究生。研究方向：臨床免疫。

裴銀輝。

R 392

A

2095-2694(2016)04-259-05