程鵬，何露清，凌驍，林秀飛，李校堃

（溫州醫(yī)科大學(xué)　藥學(xué)院　中美糖尿病并發(fā)癥研究所，浙江　溫州　325035）

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CXCR7表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成能力

程鵬，何露清，凌驍，林秀飛，李校堃

（溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中美糖尿病并發(fā)癥研究所，浙江溫州325035）

目的：考察提高CXCR7表達(dá)能否提高內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）血管生成能力。方法：利用高表達(dá)CXCR7的腺病毒轉(zhuǎn)染至人臍帶血來源的EPCs，建立CXCR7high-EPCs工程化細(xì)胞。比較CXCR7high-EPCs與對照組EPCs在無血清條件下存活、黏附、經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）誘導(dǎo)的跨內(nèi)皮遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成以及一氧化氮（NO）生成能力。結(jié)果：高表達(dá)CXCR7能顯著增強(qiáng)EPCs在無血清條件下細(xì)胞存活能力、黏附功能、SDF-1誘導(dǎo)的跨內(nèi)皮遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成以及EPCs生成NO的能力，并且與SDF-1有協(xié)同作用。結(jié)論：提高CXCR7在人臍帶血來源的EPCs中表達(dá)能夠增強(qiáng)其血管生成能力，這為臨床治療血管性疾病提供新思路。

CXCR7；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞存活；管樣結(jié)構(gòu)形成

早在1997年，內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）就能夠從人的外周血中分離得到［1］。臨床研究表明外周血中EPCs的數(shù)量和功能與心血管疾病風(fēng)險及死亡率呈負(fù)相關(guān)［2-3］。動物實驗也表明移植骨髓［4］、臍帶血［5］或者外周血［6］來源的EPCs能夠改善心肌缺血以及下肢缺血動物模型的血流再恢復(fù)情況?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在EPCs參與血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7-11］。近新研究［12-13］發(fā)現(xiàn)：SDF-1的受體CXCR7也參與到SDF-1介導(dǎo)EPCs血管生成的過程中。盡管CXCR7在EPCs中表達(dá)量很低，但其介導(dǎo)SDF-1誘導(dǎo)細(xì)胞存活、與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、形成管樣結(jié)構(gòu)以及合成一氧化氮（NO）等功能不容忽視。本實驗利用攜帶人CXCR7基因的腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs獲得CXCR7高表達(dá)的EPCs。通過與空載腺病毒轉(zhuǎn)染的EPCs進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)CXCR7的EPCs其存活能力、黏附功能、跨內(nèi)皮遷移能力、管樣結(jié)構(gòu)形成以及細(xì)胞生成NO能力顯著得到提升，證明增強(qiáng)EPCs中CXCR7的表達(dá)量將顯著提高細(xì)胞血管生成功能。

1　材料和方法

1.1材料 人臍帶血來源于健康產(chǎn)婦；MCDB131培養(yǎng)基購自Gibco公司，人淋巴細(xì)胞分離液、荊豆凝集素（FITC-UEA-1）購自Sigma公司，EGM-2培養(yǎng)基購自Lonza公司，乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）購自BT公司，MTT檢測試劑盒購自凱基生物公司，CXCR7抗體購自Cell Signaling公司，基質(zhì)膠購自Corning公司，NO檢測試劑盒購自Promega公司；本實驗用到超凈臺、細(xì)胞孵育箱、流式細(xì)胞儀、倒置顯微鏡、熒光倒置顯微鏡、電子天平、細(xì)胞超生破碎儀。

1.2方法

1.2.1EPCs的分離與培養(yǎng)：無菌條件下用抗凝血袋獲取人臍帶血約100 mL，用MCDB131培養(yǎng)基按1∶1的體積比稀釋血液，將等體積的人淋巴細(xì)胞分離液Histopaque 1077輕微緩慢加至血液上層；500×g離心30 min，取中間白膜層細(xì)胞；培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后加入Single-Quots的EGM-2（含10% FBS）培養(yǎng)基重懸；鋪板于預(yù)先用2 μg/cm2人纖維粘連蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)的前7 d每天換液，之后每2 d 換1次液，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝像。

1.2.2EPCs的鑒定：待EPCs傳代后對其進(jìn)行鑒定，利用細(xì)胞免疫熒光實驗對細(xì)胞中EPCs特異性表面標(biāo)記CD133及VEGFR-2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并通過Dil-ac-LDL攝取實驗和FITC-UEA-1結(jié)合實驗對細(xì)胞進(jìn)行EPCs內(nèi)皮功能鑒定。

1.2.3轉(zhuǎn)染：利用實驗室設(shè)計的攜帶人CXCR7基因的腺病毒對EPCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，空載腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs作為陰性對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，利用免疫印跡實驗檢測EPCs中CXCR7的表達(dá)情況。

1.2.4EPCs凋亡檢測實驗：CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%，并可進(jìn)行細(xì)胞凋亡實驗。實驗分組情況：CXCR7high-EPCs組和ctrl-EPCs組用無血清的MCDB131培養(yǎng)基進(jìn)行實驗；CXCR7high-EPCs+SDF-1組和ctrl-EPCs+SDF-1組用含100 ng/mL SDF-1的無血清MCDB131培養(yǎng)基進(jìn)行凋亡實驗。EPCs培養(yǎng)48 h后，消化并收集，再用冰冷PBS洗滌2次，采用MTT檢測試劑盒并利用流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測EPCs凋亡情況。

1.2.5EPCs黏附實驗：原代培養(yǎng)出來的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1×105/孔的密度鋪板于細(xì)胞24孔板中，培養(yǎng)至完全融合；用含有10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL IL-1β的MCDB131培養(yǎng)基處理EPCs 5 h，活化內(nèi)皮細(xì)胞單層；實驗分組：CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs加至活化的內(nèi)皮細(xì)胞單層上，加入不含血清的MCDB131；在CXCR7high-EPCs+SDF-1組和ctrl-EPCs+SDF-1實驗組中加入含100 ng/mL SDF-1（Peprotech公司）的無血清MCDB131，37 ℃孵育15 min。實驗結(jié)束后把未黏附的細(xì)胞用PBS洗去；熒光顯微鏡下觀察，每個孔隨機(jī)選取5個視野，對發(fā)綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.6EPCs跨內(nèi)皮遷移實驗：將原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以每孔5×104的密度鋪板于細(xì)胞24孔板的transwell上腔，然后放在24孔板中培養(yǎng)至完全融合；取對數(shù)生長期的EPCs進(jìn)行消化，PBS重懸；進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，盡量保證各組別細(xì)胞數(shù)量一致；把EPCs加到transwell上腔。往CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs組的transwell下腔中加入無血清的MCDB131，往CXCR7high-EPCs+SDF-1和ctrl-EPCs+SDF-1組的transwell下腔中加入含有100 ng/mL SDF-1的無血清MCDB131，37 ℃孵育12 h，使EPCs穿過內(nèi)皮細(xì)胞單層和transwell膜；孵育12 h后，取出transwell小室，用棉棒刮盡上腔中的細(xì)胞。熒光顯微鏡下，每個transwell孔隨機(jī)選取5個不同視野，對穿過transwell發(fā)綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.7EPCs管樣結(jié)構(gòu)形成實驗：將包埋于碎冰中的基質(zhì)膠放在4 ℃過夜解凍；移液器槍頭，48孔板也放在4 ℃預(yù)冷；待第2天實驗時向預(yù)冷的48孔板中每孔加入125 μL基質(zhì)膠，“8”字型搖動孔板，使膠鋪平，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)熱30 min，使基質(zhì)膠充分凝固聚合；取對數(shù)生長期的EPCs用無血清MCDB131饑餓處理12 h，排除EGM-2培養(yǎng)基中血清以及生長因子對后續(xù)實驗的干擾；CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs組別中加入無血清MCDB131；CXCR7high-EPCs+SDF-1和ctrl-EPCs+SDF-1組別中加入含100 ng/mL SDF-1的無血清MCDB131，充分混勻后以每孔2.5×105/mL的細(xì)胞密度取250 μL細(xì)胞懸液加入48孔板中，37 ℃培養(yǎng)12～24 h。隨后把孔板放在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，用Image J測量管樣結(jié)構(gòu)的長度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.8EPCs NO檢測實驗：取各實驗組細(xì)胞上清液50 μL，加入50 μL Griess Reagent I進(jìn)行后續(xù)測試。空白對照組加60 μL樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品組加60 μL標(biāo)準(zhǔn)品，實驗各組加60 μL各組細(xì)胞上清液，將5 μL的NADPH（2 mmol/L）加至所有組別，隨后各組加Nitrate Reductase 5 μL，充分混勻，37 ℃孵育30 min；孵育結(jié)束后，各組加入10 μL的LDH Buffer，接著加入10 μL的LDH，充分混勻，37 ℃孵育30 min；各組中加入Griess Reagent I、Griess Reagent I I 50 μL，充分混勻后室溫孵育10 min，酶標(biāo)儀在540 nm檢測吸光度。進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，同一實驗多組間的差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EPCs的分離與培養(yǎng)結(jié)果 分離的細(xì)胞在人纖維黏連蛋白包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 d后，開始出現(xiàn)典型的細(xì)胞集落，隨后原本梭形的細(xì)胞逐漸消失，最終成鋪路石樣（見圖1A）。通過EPCs特異性表面標(biāo)記抗體CD133和VEGFR2鑒定該細(xì)胞，并運用攝取Dil-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1來鑒定細(xì)胞的內(nèi)皮功能。結(jié)果表明原代分離的細(xì)胞能夠攝取Dil-ac-LDL以及結(jié)合FITC-UEA-1（見圖1B），并且該種細(xì)胞大都表現(xiàn)出CD133和VEGFR2雙陽性（見圖1C），從人臍帶血分離的單個核細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)可以獲得高純度的EPCs。

圖1　EPCs的分離與培養(yǎng)

2.2腺病毒轉(zhuǎn)染獲得CXCR7高表達(dá)的EPCs 利用實驗室構(gòu)建的攜帶人CXCR7基因的腺病毒和空腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs，獲得CXCR7high-EPCs和Ctrl-EPCs模型。免疫印跡實驗表明：攜帶人CXCR7基因的腺病毒在轉(zhuǎn)染EPCs后明顯上調(diào)細(xì)胞中CXCR7的表達(dá)量，但對CXCR4的表達(dá)并沒有影響（P＜0.01），見圖2。

2.3提高CXCR7表達(dá)增強(qiáng)EPCs存活 不含血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)EPCs凋亡，MTT法檢測活細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示：在無血清條件下，CXCR7high-EPCs凋亡率比ctrl-EPCs低；加入外源性的SDF-1能夠顯著降低CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs的細(xì)胞凋亡率。SDF-1存在時，CXCR7high-EPCs的凋亡率與ctrl-EPCs相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。2.4 提高CXCR7表達(dá)增強(qiáng)EPCs黏附作用 本研究中通過比較不同CXCR7濃度的EPCs在活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附能力，研究提高EPCs中CXCR7的表達(dá)在促進(jìn)與活化內(nèi)皮細(xì)胞黏附的作用。實驗結(jié)果表明：CXCR7high-EPCs與活化內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力要顯著強(qiáng)于ctrl-EPCs；SDF-1能明顯增強(qiáng)CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs與活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能，且CXCR7high-EPCs的黏附能力比ctrl-EPCs更顯著（見圖4）。

圖2　不同腺病毒轉(zhuǎn)染對EPCs中CXCR7、CXCR4表達(dá)的影響

圖3　不同CXCR7表達(dá)水平對EPCs在無血清條件下對細(xì)胞凋亡率的影響

圖4　不同CXCR7濃度對EPCs與活化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的影響

2.5提高CXCR7表達(dá)增強(qiáng)EPCs跨內(nèi)皮遷移 實驗中通過transwell實驗比較不同CXCR7表達(dá)的EPCs跨內(nèi)皮單層能力，考察提高CXCR7表達(dá)能否促進(jìn)EPCs跨內(nèi)皮遷移能力。結(jié)果顯示：沒有SDF-1存在時，CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs的跨內(nèi)皮遷移能力沒有顯著差異；在給予SDF-1后，CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs跨內(nèi)皮遷移能力均得到提升，且CXCR7high-EPCs跨內(nèi)皮遷移能力也明顯強(qiáng)于ctrl-EPCs（見圖5）。

圖5　不同CXCR7表達(dá)水平對EPCs跨內(nèi)皮遷移能力的作用

2.6提高CXCR7表達(dá)增強(qiáng)EPCs管樣結(jié)構(gòu)形成 實驗通過考察不同CXCR7表達(dá)水平的EPCs在基質(zhì)膠中形成管樣結(jié)構(gòu)的能力，研究增加EPCs中CXCR7的表達(dá)是否可以促進(jìn)細(xì)胞血管形成。實驗結(jié)果證實：CXCR7high-EPCs在基質(zhì)膠中成管能力顯著高于ctrl-EPCs；SDF-1能顯著促進(jìn)CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs體外管樣結(jié)構(gòu)的形成。SDF-1存在時，CXCR7high-EPCs管樣結(jié)構(gòu)形成能力強(qiáng)于ctrl-EPCs，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖6）。

圖6　不同CXCR7表達(dá)水平對EPCs體外管樣結(jié)構(gòu)形成能力的作用

2.7提高CXCR7表達(dá)增強(qiáng)EPCs生成NO的能力 通過比較不同CXCR7表達(dá)水平的EPCs生成NO的能力，研究增加CXCR7在EPCs中的表達(dá)量是否能上調(diào)細(xì)胞促血管功能。結(jié)果顯示：CXCR7high-EPCs組別中NO的含量顯著高于ctrl-EPCs；SDF-1誘導(dǎo)能夠顯著促進(jìn)CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs產(chǎn)生NO的能力。SDF-1存在的條件下，CXCR7high-EPCs組的NO含量顯著高于ctrl-EPCs，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖7。

3　討論

本實驗利用CXCR7高表達(dá)的腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs，成功建立高表達(dá)CXCR7的EPCs模型（CXCR7high-EPCs）。研究發(fā)現(xiàn)提高CXCR7表達(dá)能夠極大程度提高EPCs的存活能力，這與前期研究［13］證明CXCR7單獨介導(dǎo)SDF-1誘導(dǎo)EPCs存活的結(jié)論保持一致。本研究中給予細(xì)胞外源性SDF-1能顯著增強(qiáng)CXCR7high-EPCs的黏附及跨內(nèi)皮遷移能力，并能與高表達(dá)的CXCR7發(fā)揮協(xié)同作用，這與前期研究［13］證明CXCR7單獨介導(dǎo)SDF-1誘導(dǎo)EPCs黏附的結(jié)論也是一致的，與Zabel等［5］對腫瘤細(xì)胞研究結(jié)果同樣相符。EPCs黏附及跨內(nèi)皮遷移能力是生成血管的起始步驟，高表達(dá)CXCR7促進(jìn)EPCs與活化的內(nèi)皮黏附、跨內(nèi)皮遷移，很可能是由于增強(qiáng)了細(xì)胞的血管生成能力。

圖7　不同CXCR7表達(dá)水平對EPCs生成NO能力的影響

實驗中運用管樣結(jié)構(gòu)形成實驗考察提高CXCR7表達(dá)對EPCs成血管能力的影響。結(jié)果表明：高表達(dá)CXCR7的EPCs其管樣結(jié)構(gòu)形成得到顯著增強(qiáng)，并與SDF-1發(fā)揮協(xié)同作用。Watanabe等［14］在炎癥研究中發(fā)現(xiàn)提高CXCR7表達(dá)對內(nèi)皮類細(xì)胞血管生成有促進(jìn)作用，這與本實驗結(jié)果相符。最后，通過檢測NO含量，結(jié)果也表明轉(zhuǎn)染CXCR7的EPCs體內(nèi)NO生成量顯著增加并與SDF-1發(fā)揮協(xié)同作用，表明CXCR7高表達(dá)可能通過提高EPCs合成NO增強(qiáng)其成血管功能。

提高EPCs中CXCR7的表達(dá)量顯著提高EPCs的存活能力、與活化內(nèi)皮的黏附功能、SDF-1介導(dǎo)細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移能力、管樣結(jié)構(gòu)形成能力以及NO生成能力，這種作用與SDF-1一起發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。提高CXCR7表達(dá)很可能是增強(qiáng)EPCs血管生成能力的有效方法，同時也為改造EPCs用于臨床干細(xì)胞移植治療血管性疾病提供新思路。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Increasing CXCR7 expression in endothelial progenitor cells can enhances its angiogenic capability

CHENG Peng, HE Luqing, LING Xiao, LIN Xiufei, LI Xiaokun. Sine-American Research Institute for Diabetic Complication, School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate whether increasing CXCR7 expression in endothelial progenitor cells （EPCs） can improve its angiogenic capability. Methods: CXCR7high-EPCs were constructed by transfecting with adenovirus carring human CXCR7 gene. The differences between CXCR7high-EPCs and wt-EPC in cell survival under serum deprivation condition， adhesion， SDF-1 induced trans-endothelial migration， tube formation and nitric oxide （NO） production were compared. Results: Compared with ctrl-EPCs， CXCR7high-EPCs has superiority in cell survival under serum-free condition， cell adhension to activated endothelial cells， trans-endothelial migration， tube formation and NO production， which could be further enhanced by SDF-1. Conclusion: Increasing expression of CXCR7 can enhance the angiogenic capacity of EPCs. The performance of present research may provide a new idea for the treatment of vascular diseases.

CXCR7； endothelial progenitor cells； cell survival； tube formation

R96

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.007

2016-02-07

溫州市公益性科技計劃項目（Y20140654）；國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（81200239）。

程鵬（1990-），男，浙江杭州人，碩士生。

李校堃，教授，Email：xiaokunli@163.net。