黃蓉，曹穎，鄭天津，趙勝科，竇瑞艷，洪淑貞，陳靖，李紅智

1.溫州醫(yī)科大學(xué)　生命科學(xué)學(xué)院　浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江　溫州　325035；2.溫州市計(jì)劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站，浙江 溫州 325000；3.溫州市人口和計(jì)劃生育委員會(huì)，浙江　溫州　325000）

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血友病A家系的單體型基因連鎖分析

黃蓉1，曹穎1，鄭天津2，趙勝科1，竇瑞艷1，洪淑貞2，陳靖3，李紅智1

1.溫州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州325035；2.溫州市計(jì)劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站，浙江 溫州 325000；3.溫州市人口和計(jì)劃生育委員會(huì)，浙江溫州325000）

目的：該研究開展溫州地區(qū)血友病A（HA）家系的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）多態(tài)性、短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）多態(tài)性和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）單體型基因連鎖分析，為HA遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供癥狀前、攜帶者基因診斷方面的依據(jù)。方法：針對(duì)HA先證者及其有關(guān)家系成員，進(jìn)行單體型基因連鎖分析。采用PCR檢測(cè)凝血因子VI（FVI）基因外的DXS52（St14）位點(diǎn)的VNTR多態(tài)性，檢測(cè)FVI基因外的DXS15（CA）n、DXS9901（GT）n、DXS1073（GT）n位點(diǎn)和內(nèi)含子1（GT）n、13（CA）n、22（GT）n（AG）n、24（GT）位點(diǎn)的STR多態(tài)性并經(jīng)毛細(xì)管電泳確證。另外采用PCR產(chǎn)物限制酶切檢測(cè)FⅧ基因的內(nèi)含子18、19、22位點(diǎn)的RFLP。結(jié)果：以2個(gè)HA家系為例報(bào)道研究結(jié)果。家系一先證者年幼弟弟肯定為正常人，先證者母親、外祖母為攜帶者，先證者小姨肯定為攜帶者而其年幼兒子肯定為正常人。家系二先證者外祖母肯定不是攜帶者，先證者的X染色體來自外祖父，但已知外祖父不是患者，那么按照最大風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)，母親的那條來自外祖父的X染色體在外祖父生殖細(xì)胞中FVI基因發(fā)生了突變，因此母親是攜帶者。家系二先證者年幼妹妹是攜帶者，將來有生育患兒的風(fēng)險(xiǎn)，但先證者大姨及其年幼女兒不是攜帶者。結(jié)論：該研究的HA家系的VNTR-PCR、TR-PCR和PCR/RFLP單體型基因連鎖分析，特別是對(duì)癥狀前男孩的診斷、對(duì)未曾有患病后代的女性攜帶者的檢出，具有非常重要的實(shí)際意義，可以為遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供可靠依據(jù)。

血友病A；多態(tài)性；單體型；基因連鎖分析

甲型血友?。╤emophilia A，HA）是由于凝血因子VI（FVI）基因缺陷引起的一種X連鎖隱性遺傳病，發(fā)病率約占男性的1/5 000［1］?；颊叱３０l(fā)生自發(fā)性或外傷后出血不止，以關(guān)節(jié)出血最為多見，可能致殘甚至危及生命。目前患者主要以輸注FVI制品來預(yù)防和治療出血，尚無有效的根治方法［2］。FVI基因定位于Xq28，全長(zhǎng)186 kb，包含26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，是一個(gè)比較龐大的基因。雖然約20%的HA是由FVI基因第22內(nèi)含子的倒位引起，可通過長(zhǎng)距離PCR直接檢測(cè)，但是有近80%的HA的基因突變呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，迄今已發(fā)現(xiàn)一千多種基因突變，且散布于基因內(nèi)，給直接基因診斷帶來了一定的困難［3］。因此利用FVI基因內(nèi)、外與之緊密連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行間接連鎖分析，已成為檢測(cè)攜帶者主要途徑之一。HA攜帶者基因診斷是減少HA患者出生的最有效的途徑之一。本研究開展溫州地區(qū)HA家系的單體型連鎖基因診斷，并因此開展基于HA癥狀前、攜帶者基因診斷結(jié)果的遺傳咨詢和生育指導(dǎo)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1先證者家系資料：以近年由溫州市計(jì)劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站登記的溫州地區(qū)的2例HA先證者為例。家系一、二的HA先證者均經(jīng)三甲醫(yī)院鑒定，均為男性，年齡分別為12、4周歲，均有典型病史、出血癥狀，并經(jīng)血清酶學(xué)檢查（血漿凝血因子VI活性極低、活化部分凝血活酶時(shí)間很長(zhǎng)等）證實(shí)。該2個(gè)HA家系中家系一有家族史。該2個(gè)家系均擬再育，特別希望得到足夠的先證者及其母親的基因診斷信息。

1.1.2連鎖標(biāo)記位點(diǎn)的引物：本研究采用凝血因子VI（FVI）基因外的DXS52（St14）位點(diǎn)的引物［4］進(jìn)行可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat，VNTR）的PCR，表示為VNTR-PCR。分別采用位于FVI基因外的DXS15（CA）n、DXS9901 （GT）n、DXS1073（GT）n和FVI基因的內(nèi)含子1（GT）n、 13（CA）n、22（GT）n（AG）n、24（GT）n位點(diǎn)的引物［1，5-7］進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）的PCR，表示為STR-PCR。分別采用FVI基因的內(nèi)含子18、19、22位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）檢測(cè)，表示為PCR/ RFLP。以上11個(gè)FVI基因連鎖標(biāo)記位點(diǎn)在X染色體上的相對(duì)位置見圖1，圖中F8C區(qū)域?yàn)镕VI基因位置范圍。以上11對(duì)引物均由上海Invitrogen公司合成。

圖1　11個(gè)FVIII基因連鎖標(biāo)記位點(diǎn)在X染色體上的相對(duì)位置

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本采集及DNA提取：采集2例HA先證者及其有關(guān)家系成員的抗凝外周血各2～4 mL，分裝凍存。按照試劑盒說明書提取DNA。

1.2.2VNTR-PCR：針對(duì)DXS52位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增體系為25 μL：PCR mix 12.5 μL，10 μmoL/μL正向、反向引物各1 μL，DNA 2 μL（約100 ng），加水8.5 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)26次。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，5 V/cm，40 min。DXS52位點(diǎn)重復(fù)以約60 bp為單位，采用本研究引物在重復(fù)1、17、24、29次時(shí)的PCR產(chǎn)物大小分別為700、1 690、2 100、2 400 bp，PCR產(chǎn)物大小多態(tài)性常見范圍700～3 000 bp［8］。

1.2.3STR-PCR：針對(duì)1（GT）n、13（CA）n、22（GT）n（AG）n、24（GT）n、DXS15（CA）n、DXS9901（GT）n和DXS1073（GT）n位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增體系均與上述VNTR-PCR體系相同。擴(kuò)增條件為：95 ℃變性45 s，1（GT）n位點(diǎn)55 ℃/13（CA）n位點(diǎn)45 ℃/22（GT）n AG）n位點(diǎn)50 ℃/24（GT）n位點(diǎn)58 ℃/DXS15（CA）n位點(diǎn)60 ℃/DXS9901（GT）n位點(diǎn)62 ℃/DXS1073（GT）n位點(diǎn)60 ℃，退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次。

1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染：取STR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，600 V，1 h，銀染。若某女性的兩條帶之一與先證者的帶位置相同，則該女性為攜帶者；若某男性的帶與先證者的帶位置相同，則該男性為患者。

1.2.5STR毛細(xì)管電泳測(cè)序：7個(gè)STR位點(diǎn)下游引物的5’端用6-FAM進(jìn)行熒光標(biāo)記，由杭州擎科生物技術(shù)有限公司完成STR毛細(xì)管電泳測(cè)序，檢測(cè)STR擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確大小。據(jù)報(bào)道在中國(guó)人群中該7個(gè)STR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)范圍及采用本研究引物的PCR產(chǎn)物大小多態(tài)性范圍：1（GT）n為14～20次［7］，120～132 bp；13（CA）n為14、17～27次［7，9］，146～172 bp；22（GT）n（AG）n為23～29次［7］，207～219 bp；24 GT）n為14～22次［7］，182～198 bp；DXS15（CA）n 為15～25次［6］，148～168 bp；DXS9901（GT）n為9～23次［6］，186～214 bp；DXS1073（GT）n為14～24次［6］，122～142 bp。

1.2.6PCR/RFLP：針對(duì)18、19、22位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增體系均與上述VNTR-PCR體系相同。擴(kuò)增條件為：95 ℃變性45 s，18位點(diǎn)58 ℃/19位點(diǎn)55 ℃/22位點(diǎn)60 ℃，退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次。對(duì)18、19、22位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用限制酶BclI、HindI、XbaI進(jìn)行酶切。19位點(diǎn)酶切產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，5 V/cm，30 min。18位點(diǎn)、22位點(diǎn)酶切產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠在600 V電壓下電泳1 h，銀染。18位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為374 bp，經(jīng)BclI酶切后長(zhǎng)度為211 bp和163 bp，如不含BclI酶切位點(diǎn)則仍為374 bp。19位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為702 bp，內(nèi)部含有2個(gè)HindI酶切位點(diǎn)，第一個(gè)酶切位點(diǎn)沒有多態(tài)性，將其切成467 bp 和235 bp，第二個(gè)酶切位點(diǎn)有多態(tài)性，在235 bp片段的內(nèi)部，將235 bp片段切成154 bp和81 bp，如不含第二個(gè)酶切位點(diǎn)則仍為235 bp。22位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為96 bp，經(jīng)XbaI酶切后長(zhǎng)度為68 bp 和28 bp，28 bp條帶由于跑得太遠(yuǎn)而舍去，如不含XbaI酶切位點(diǎn)則仍為96 bp。

2　結(jié)果

2.1HA家系一的結(jié)果

2.1.1采用VNTR連鎖分析的間接基因診斷結(jié)果：DXS52位點(diǎn)結(jié)果得出先證者（I1）700 bp帶與先證者母親（I3）雜合子的700 bp帶一致，說明該X染色體為致病X染色體，母親為攜帶者。先證者弟弟（I2）2 400 bp帶與母親雜合子的2 400 bp帶一致，表明弟弟的X染色體正常。先證者小姨（I5）、母親的兩條X染色體中，致病X染色體來自先證者外祖母（I2），正常X染色體來自先證者外祖父（I1），外祖母、小姨均為攜帶者，外祖父正常。先證者姨表弟（I3）2 400 bp帶與小姨雜合子的2 400 bp帶一致，表明姨表弟的X染色體正常。見圖2。

圖2　HA家系一的VNTR多態(tài)性位點(diǎn)DXS52的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果

2.1.2采用STR單體型連鎖分析的間接基因診斷結(jié)果：a13（CA）n位點(diǎn)結(jié)果和DXS9901（GT）n位點(diǎn)結(jié)果得出先證者（I1）的帶與先證者母親（I3）兩條帶中下面（或上面）那條帶處于同一位置，說明該X染色體為致病X染色體，母親為攜帶者。先證者弟弟（I2）的帶與母親兩條帶中上面（或下面）那條帶處于同一位置，表明弟弟的X染色體正常。先證者小姨（I5）、母親的2條X染色體中，致病X染色體來自先證者外祖母（I2），正常X染色體來自先證者外祖父（I1），外祖母、小姨均為攜帶者，外祖父正常。先證者姨表弟（I3）的帶與小姨的上面（或下面）那條帶處于同一位置，表明姨表弟的X染色體正常。見圖3。

2個(gè)位點(diǎn)13（CA）n、DXS9901（GT）n的毛細(xì)管電泳圖，見圖4。因13（CA）n位點(diǎn)PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型I2、I1相同，I3、I5相同，I1、I2、I3相同，故僅示I2、I3、I2毛細(xì)管電泳結(jié)果圖。13（CA）n位點(diǎn)I2、I1相同，片段長(zhǎng)度為156 bp，CA重復(fù)19次； I3、I5相同，片段長(zhǎng)度為156 bp/ 162 bp，CA重復(fù)19次/22次；I1、I2、I3相同，片段長(zhǎng)度為162 bp，CA重復(fù)22次。因DXS9901（GT）n位點(diǎn)PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型I2、I1相同，I3、I5相同，I1、I2、I3相同，故僅示I1、I3、I2毛細(xì)管電泳結(jié)果圖。DXS9901（GT）n位點(diǎn)I2、I1相同，片段長(zhǎng)度為198 bp，GT重復(fù)15次； I3、I5相同，片段長(zhǎng)度為194 bp/198 bp，GT重復(fù)13次/15次；I1、I2、I3相同，片段長(zhǎng)度為194 bp，GT重復(fù)13次。

圖3　HA家系一的STR多態(tài)性位點(diǎn)PCR產(chǎn)物，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染結(jié)果

2.1.3采用RFLP單體型連鎖分析的間接基因診斷結(jié)果：從18位點(diǎn)結(jié)果、22位點(diǎn)結(jié)果得出先證者（I1）X染色體含有酶切位點(diǎn)，母親（I3）2條X染色體中一條含有酶切位點(diǎn)，另一條沒有酶切位點(diǎn)，因此可以診斷含有酶切位點(diǎn)的那條X染色體為致病X染色體，表明母親是攜帶者。先證者弟弟（I2）的沒有酶切位點(diǎn)，表明弟弟正常。先證者外祖母（I2）2條X染色體中一條含有酶切位點(diǎn)，另一條沒有，先證者外祖父（I1）的沒有酶切位點(diǎn)，表明母親的致病X染色體來自外祖母，正常X染色體來自外祖父，可以診斷外祖母為攜帶者，外祖父正常。先證者小姨（I5）的2條X染色體中一條含有酶切位點(diǎn)的來自外祖母的致病X染色體，另一條沒有酶切位點(diǎn)的來自外祖父的正常X染色體，小姨為攜帶者。先證者姨表弟（I3）的沒有酶切位點(diǎn)，因此可以診斷為正常見圖5a和圖5c。

從19位點(diǎn)結(jié)果得出先證者（I1）X染色體含有一個(gè)酶切位點(diǎn)，母親（I3）2條X染色體中一條含有一個(gè)酶切位點(diǎn)，另一條含有2個(gè)酶切位點(diǎn)，因此可以診斷含有一個(gè)酶切位點(diǎn)的那條X染色體為致病染色體，表明母親是攜帶者。先證者弟弟（I2）的含有2個(gè)酶切位點(diǎn)，表明弟弟正常。先證者外祖母（I2）2條X染色體中一條含有2個(gè)酶切位點(diǎn)，另一條含有一個(gè)酶切位點(diǎn)，先證者外祖父（I1）的含有個(gè)酶切位點(diǎn)，表明母親的致病X染色體來自外祖母正常X染色體來自外祖父，可以診斷外祖母為攜帶者，外祖父正常。先證者小姨（I5）的2條X染色體中一條含有一個(gè)酶切位點(diǎn)的來自外祖母的致病X染色體，另一條含有2個(gè)酶切位點(diǎn)的來自外祖父的正常X染色體，小姨為攜帶者。先證者姨表弟（I3）的含有2個(gè)酶切位點(diǎn)，因此可以診斷為正常。見圖5b。

圖4　HA家系一的2個(gè)位點(diǎn)13（CA）n、DXS9901（GT）n的毛細(xì)管電泳圖

圖5　HA家系一的RFLP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（b）或聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染（a、c）

2.1.4家系一間接基因診斷結(jié)論：家系一7個(gè)成員11個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，VNTR的DXS52位點(diǎn)，STR 的13（CA）n、DXS9901（GT）n位點(diǎn)，RFLP的18、19、22位點(diǎn)均能提供有意義的連鎖分析信息，見圖6。先證者的致病X染色體來自其母親，其母親為攜帶者，年幼弟弟肯定為正常人（肯定將來沒有出血風(fēng)險(xiǎn)）。先證者外祖母為攜帶者，先證者外祖父正常。先證者小姨肯定為攜帶者（盡管后代未曾有患者），先證者小姨年幼兒子肯定為正常人（肯定將來沒有出血風(fēng)險(xiǎn)）。

2.2HA家系二的結(jié)果

圖6　HA家系一的系譜圖及1個(gè)VNTR、2個(gè)STR、3個(gè)RFLP位點(diǎn)單體型連鎖分析

2.2.1采用VNTR連鎖分析的間接基因診斷結(jié)果：?jiǎn)为?dú)從DXS52位點(diǎn)結(jié)果得出先證者（I3）1 390 bp帶與先證者母親（I5）雜合子的1 390 bp帶一致，表明該X染色體為致病X染色體，母親為攜帶者。母親致病X染色體來自于先證者外祖母（I2）雜合子的1 390 bp帶，外祖母也為攜帶者。先證者妹妹（I4）雜合子的1 390 bp帶來自母親（即致病X染色體），700 bp帶來自先證者父親（I4），表明妹妹為攜帶者。先證者大姨（I1）雜合子與母親的2條帶分別一致，表明大姨為攜帶者。先證者大姨女兒（I2）雜合子的1 390 bp帶為致病X染色體，說明大姨女兒也為攜帶者。見圖7。

圖7　HA家系二的VNTR多態(tài)性位點(diǎn)DXS52的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果

2.2.2采用STR單體型連鎖分析的間接基因診斷結(jié)果：從DXS9901（GT）n位點(diǎn)結(jié)果得出先證者（I3）的帶與先證者母親（I5）2條帶中的下面那條帶處于同一位置，表明該X染色體為致病X染色體，母親為攜帶者。先證者妹妹（I4）的2條帶中下面那條帶來自母親（即來自母親的為致病X染色體），上面那條帶來自先證者父親（I4），表明妹妹為攜帶者。先證者外祖母（I2）僅一條帶，與先證者大姨（I1）和母親上面那條正常X染色體的帶處于同一位置（即外祖母沒有致病X染色體）。見圖8。

圖8　HA家系二的DXS9901（GT）n STR多態(tài)性位點(diǎn)PCR產(chǎn)物，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染

DXS9901（GT）n位點(diǎn)的毛細(xì)管電泳圖見圖9。因DXS9901（GT）n位點(diǎn)PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型I2、I4相同，I1、I5、I4相同，I2、I3相同，故僅示I4、I5、I3毛細(xì)管電泳結(jié)果圖。DXS9901（GT）n位點(diǎn)I2、I4相同，片段長(zhǎng)度為202 bp，GT重復(fù)17次；I1、I5、I4相同，片段長(zhǎng)度為194 bp/202 bp，GT重復(fù)13次/17次；I2、I3相同，片段長(zhǎng)度為194 bp，GT重復(fù)13次。

2.2.3采用RFLP單體型連鎖分析的間接基因診斷結(jié)果：采用與2.1.3類似的酶切位點(diǎn)分析，從18位點(diǎn)結(jié)果、19位點(diǎn)結(jié)果、22位點(diǎn)結(jié)果得出先證者母親（I5）、先證者妹妹（I4）均為攜帶者，先證者外祖母（I2）沒有致病X染色體，先證者大姨（I1）與母親酶切位點(diǎn)一致。見圖10。

2.2.4家系二間接基因診斷結(jié)論：家系二7個(gè)成員11個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，VNTR的DXS52位點(diǎn)，STR 的DXS9901（GT）n位點(diǎn)，RFLP的18、19、22位點(diǎn)均能提供有意義的連鎖分析信息，見圖11。

圖9　HA家系二的DXS9901（GT）n位點(diǎn)的毛細(xì)管電泳圖

將DXS52位點(diǎn)與其它位點(diǎn)結(jié)果對(duì)照可以看出，先證者外祖父（I1）的X染色體，經(jīng)先證者母親（I5）傳給先證者（I3）和先證者妹妹（I4），另外經(jīng)先證者大姨（I1）傳給大姨女兒（I2）。但第二代母親、大姨在產(chǎn)生配子時(shí)2條同源X染色體在DXS52位點(diǎn)與DXS9901（GT）n位點(diǎn)間發(fā)生了交換，使DXS52位點(diǎn)與致病基因的連鎖關(guān)系改變了，所以第三代DXS52位點(diǎn)結(jié)果不能用于致病基因連鎖分析了。因?yàn)镈XS52位點(diǎn)在本家系遺傳過程中與致病基因間發(fā)生了交換，故該位點(diǎn)連鎖分析信息不考慮。

從STR的DXS9901（GT）n位點(diǎn)和RFLP的18、19、22位點(diǎn)得出的家系二間接基因診斷結(jié)論：先證者外祖母肯定不是攜帶者，先證者的X染色體來自外祖父，但已知外祖父不是患者，那么按照最大風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)，母親的那條來自外祖父的X染色體在外祖父生殖細(xì)胞中FVI基因發(fā)生了突變，母親是攜帶者，先證者年幼妹妹是攜帶者，將來有生育患兒的風(fēng)險(xiǎn)。但先證者舅舅、阿姨的那條來自外祖父的X染色體FVI基因一般未同樣發(fā)生突變，大姨及其女兒不是攜帶者，二姨也不是攜帶者，舅舅正常。

3　討論

針對(duì)HA的FVI基因突變，雖然一些直接基因診斷是有效準(zhǔn)確的方法，但較繁瑣費(fèi)時(shí)、花費(fèi)大，難以推廣［10］。目前HA直接基因診斷主要是針對(duì)FVI基因第22內(nèi)含子倒位采用長(zhǎng)距離PCR（long distance PCR，LD-PCR），該方法雖方便快速敏感，但仍存在反應(yīng)體系復(fù)雜、PCR擴(kuò)增難度大等缺點(diǎn)［10］。

由于FVI基因具有顯著的遺傳異質(zhì)性，加之其結(jié)構(gòu)龐大，分子病理學(xué)改變復(fù)雜，而以現(xiàn)有的分子生物學(xué)手段尚不能完全查明其分子缺陷的全部類型，故對(duì)HA（除約占20%的第22內(nèi)含子倒位外）直接基因診斷尚存在一定困難，因此利用FVI基因內(nèi)或其旁側(cè)與之緊密連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)志，來進(jìn)行家系成員的間接基因診斷，成為HA基因診斷的主要途徑之一。

圖10　HA家系二的RFLP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（b）或聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染（a、c）

圖11　HA家系二的系譜圖及1個(gè)VNTR、1個(gè)STR、3個(gè)RFLP位點(diǎn)單體型連鎖分析

HA間接基因診斷常采用RFLP、STR、VNTR等多態(tài)性片段與致病突變位置連鎖的關(guān)系及其向后代傳遞的規(guī)律來進(jìn)行連鎖分析，進(jìn)而檢出攜帶者和產(chǎn)前診斷。常采用的有，基因內(nèi)的4個(gè)RFLP位點(diǎn)：BclI/內(nèi)含子18［11-12］、HindI/內(nèi)含子19［11-12］、XbalI/內(nèi)含子22［11］、BglI/內(nèi)含子25［13］；基因內(nèi)的2個(gè)STR多態(tài)性標(biāo)記：內(nèi)含子13（CA）n［7，14-15］、內(nèi)含子22（GT）n（AG）n［14-15］；基因外的2個(gè)VNTR或STR多態(tài)性標(biāo)記：

DXS52（Stl4）［13，16］、DXS15（CA）n［13，17］。

據(jù)報(bào)道在北印度人群中內(nèi)含子18（BclI）、19 （HindI）、22（XbaI）RFLP位點(diǎn)的雜合率分別為57%、38%、43%［11］。據(jù)報(bào)道在中國(guó)人群中內(nèi)含子1（GT）n、13（CA）n、22（GT）n（AG）n和24（GT）n STR位點(diǎn)的雜合率分別為34.6%［7］/37.9%［15］、60.9%［18］/61.0%［15］、43.6%［7］和38.2%［7］。據(jù)報(bào)道在中國(guó)人群中基因外DXS15（CA）n、DXS9901（GT）n和DXS1073（GT）n STR位點(diǎn)的雜合率分別為88.24%［6］、82.35%［6］和62.0%［18］。連鎖分析時(shí)需要遺傳標(biāo)記有一定的雜合率，在人群中提供足夠的多態(tài)信息量，一般根據(jù)當(dāng)?shù)厝鹤咫s合率情況選取雜合率較高的遺傳標(biāo)記，聯(lián)用幾個(gè)遺傳標(biāo)記，可提高檢出率。DXS52位點(diǎn)雖然雜合率高，信息量大，可診斷率達(dá)66.7%～81.3%［4］，但在本研究涉及的11個(gè)位點(diǎn)中距離FVI基因最遠(yuǎn)（2厘摩），理論上與FVI基因有2%～5%的重組率，實(shí)際上我們發(fā)現(xiàn)在家系二中DXS52位點(diǎn)與FVI基因間發(fā)生了重組。由于HA基因較大，在減數(shù)分裂中基因內(nèi)發(fā)生重組的可能性約為3%［6］，因此應(yīng)該采用多個(gè)雜合位點(diǎn)的結(jié)果進(jìn)行單體型連鎖分析，可發(fā)現(xiàn)HA基因內(nèi)是否發(fā)生了交換及其交換發(fā)生的位置，就可能極大限度地避免因基因內(nèi)交換而致錯(cuò)誤的連鎖基因診斷。

我們體會(huì)到有關(guān)HA連鎖分析的關(guān)鍵問題的解決辦法。首先是多態(tài)性位點(diǎn)的設(shè)計(jì)問題，盡管有的位點(diǎn)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道很好，但應(yīng)該依據(jù)實(shí)際結(jié)果情況（雜合率、重組率）決定是否調(diào)整位點(diǎn)設(shè)計(jì)。其次是非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)片段大小微小差異的鑒別問題，理論上很好，實(shí)際上要摸索最佳條件，包括凝膠濃度、電泳的電壓與時(shí)間搭配及減弱銀染膠背景顯色等。我們經(jīng)過反復(fù)摸索，最終采用6%聚丙烯酰胺凝膠、600 V、電泳1 h。該最佳條件較一般報(bào)道的獨(dú)特，使片段大小區(qū)分度達(dá)到2 bp且銀染膠背景顯色很淺。

本研究報(bào)道以2個(gè)HA先證者家系為例，采用1 個(gè)VNTR、7個(gè)STR和3個(gè)RFLP共11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的單體型連鎖分析，進(jìn)行間接基因診斷。連鎖分析可以診斷先證者家系中的其他患者，特別是早期診斷發(fā)現(xiàn)那些尚未有嚴(yán)重出血癥狀但在外傷后有嚴(yán)重出血風(fēng)險(xiǎn)的男性嬰幼兒。連鎖分析可以診斷哪些可能的女性攜帶者為肯定的女性攜帶者。在此基礎(chǔ)上，對(duì)肯定的女性攜帶者（不僅僅是患者的母親）的男胎進(jìn)行連鎖分析可以用于產(chǎn)前診斷。

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（本文編輯：吳彬）

Heplotype gene linkage analysis for hemophilia A families

HUANG Rong1, CAO Ying1, ZHENG Tianjin2, HAO Shengke1, DOU Ruiyan1, HONG Shuzhen2, CHEN Jing3, LI Hongzhi1. 1.School of Life Science/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Family Planing Publicity and Technical Guidance Station of Wenzhou City, Wenzhou, 325000; 3.Population and Family Planning Commission of Wenzhou City, Wenzhou, 325000

Objective: To develop variable number tandem repeat （VNTR） polymorphism， short tandem epeat （STR） polymorphism and restriction fragment length polymorphism （RFLP） heplotype gene linkage analyis for hemophilia A （HA） pedigrees in Wenzhou， further to provide evidences of gene prognosis of males and emale carriers for HA genetic counseling and family planning guidance. Methods: For the HA probands and elated family members， haplotype gene linkage analysis was processed. PCR was used to analyze the VNTR olymorphism in extragenic site DXS52 （St14） of clotting factor VIII （FVIII） gene， to analyze the STR polymorhism in extragenic sites DXS15 （CA）n， DXS9901 （GT）n， DXS1073 （GT）n and in intragenic sites intron 1 （GT）， 13 （CA）n， 22 （GT）n （AG）n， 24 （GT）n of FVIII gene， and the STR polymorphism was identifi ed by capillary lectrophoresis. Also PCR/RFLP was used to analyze the RFLP in intragenic sites intron 18， 19 and 22 of FVIII ene. Results: The results of two HA pedigrees were taken as examples. In pedigree 1， the very young brother of roband was normal， the mother and grandmother of proband were carriers， the young aunt of proband was carier and her very young son was normal. In pedigree 2， the grandmother of proband was not carrier， the X chromosome of proband was interited from his grandfather. Since the grandfather was not HA patient， supposing the most serious situation， it was deduced that a mutation of FVIII gene had happened to the X chromosome of the mother which interited from the grandfather when it was in germ cell of grandfather， thus the mother of probandwas carrier. In pedigree 2， the very young sister of proband is carrier， and there will be risk for her sons， but the eldest aunt of proband and her very young daughter are not carriers. Conclusion: The VNTR-PCR， STR-PCR and PCR/RFLP haplotype gene linkage analysis of HA pedigrees of this study， especially the presymptomatic gene diagnosis of males， the gene diagnosis of female carriers without HA offspring， will have their very important clinical implications， can provide reliable evidences for genetic counseling and family planning guidance.

hemophilia A； polymorphism； heplotype； gene linkage analysis

R554.1

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.003

2015-09-03

浙江省人口和計(jì)劃生育科技項(xiàng)目（201107）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140403）；溫州醫(yī)科大學(xué)橫向

科研項(xiàng)目（HX1202，KJHX1318）。

黃蓉（1989-），女，湖北荊州人，碩士生。

李紅智，教授，Email：lhz@wmu.edu.cn。