鄭靖宇，吳歡，湯雯，劉成，丁婷婷，戴爽，吳玲，朱再勝，李劍敏

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江　溫州　325015，1.病理科；2.老年病科）

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Drp1和Mfn2在棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠肝細胞損傷中的作用機制及姜黃素衍生物L(fēng)6H4的干預(yù)作用

鄭靖宇1，吳歡1，湯雯1，劉成1，丁婷婷1，戴爽1，吳玲1，朱再勝2，李劍敏1

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州325015，1.病理科；2.老年病科）

目的：研究棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)肝細胞損傷的體外模擬非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型中線粒體發(fā)動相關(guān)蛋白1（Drp1）和融合蛋白2（Mfn2）的作用機制以及姜黃素衍生物L(fēng)6H4的保護作用。方法：①分別以不同濃度的PA、油酸（OA）和PA+姜黃素衍生物L(fēng)6H4的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠BRL-3A正常肝細胞24 h。用MTT法檢測細胞活力，以篩選制作體外模擬NAFLD模型的最佳PA濃度及姜黃素衍生物L(fēng)6H4的干預(yù)濃度。②將細胞分為4組：對照組（CON組）、油酸組（OA組）、棕櫚酸組（PA組）及姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)組（L6H4組），分別給予正常培養(yǎng)基、含有OA的培養(yǎng)基、含有PA的培養(yǎng)基及含有PA和姜黃素衍生物L(fēng)6H4的混合培養(yǎng)基進行干預(yù)，24 h后收獲細胞。分別用羥胺法測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）含量、硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量、Real-time PCR及Western Blot法檢測肝細胞Drp1、Mfn2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、TNF-α mRNA及蛋白的表達。結(jié)果：①不同濃度PA對BRL-3A細胞的生長均具有一定的抑制作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并呈明顯劑量依賴關(guān)系，0.1 mmol/L是分界點，而0.05 mmol/L OA對細胞活力無明顯影響。因此選擇0.05 mmol/L PA作為最佳造模濃度以建立NAFLD體外模型。②當(dāng)姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)濃度≤10 μmol/L時，細胞活力均高于75%，濃度＞20 μmol/L時，細胞活力降至50%以下，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。10 μmol/L時是分界點，因此選擇5 μmol/L作為后續(xù)L6H4干預(yù)濃度。③與CON組相比，PA組細胞MDA含量、Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA及蛋白的表達均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而T-SOD活力、Mfn2、Bcl-2的mRNA及蛋白表達則顯著下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與PA組相比，L6H4組的MDA含量、Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA及蛋白的表達均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），T-SOD活力、Bcl-2 mRNA及蛋白的表達顯著提高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但Mfn2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：姜黃素衍生物L(fēng)6H4減輕PA誘導(dǎo)的大鼠BRL-3A正常肝細胞的損傷，其機制可能與其減少肝細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制線粒體的分裂及其下游線粒體凋亡途徑及炎癥因子信號傳導(dǎo)有關(guān)。這可能是姜黃素衍生物L(fēng)6H4防治NAFLD的機制之一。

姜黃素衍生物L(fēng)6H4；BRL-3A；棕櫚酸；線粒體；凋亡

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty iver disease，NAFLD）發(fā)病機制尚未完全明確，目前仍然處于假說階段，占據(jù)主導(dǎo)地位的是Day［1］于1998年提出的“二次打擊學(xué)說”。氧化應(yīng)激損傷被認為是其發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，而線粒體又是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要來源，活性氧簇（reacfive oxygen pecies，ROS）的產(chǎn)生累積增多加重線粒體功能障礙和損傷，從而形成惡性循環(huán)。目前的研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能的改變與其線粒體形態(tài)變化密切相關(guān)，其中線粒體分裂與融合的調(diào)節(jié)以及對線粒體凋亡通路的調(diào)節(jié)倍受研究者關(guān)注。發(fā)動相關(guān)蛋白1（dynaminelated protein 1，Drp1）是線粒體分裂的重要執(zhí)行分子，而線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）是線粒體融合的主要執(zhí)行分子。在正常的生理狀態(tài)下線粒體的分裂/融合保持著平衡，分裂蛋白表達增加，融合蛋白的表達減少，則促使線粒體分裂，并通過線粒體凋亡途徑導(dǎo)致細胞的凋亡［2-3］。最近研究表明，姜黃素能通過減少ROS、調(diào)節(jié)線粒體膜電位、線粒體生物合成以及線粒體DNA拷貝數(shù)，保護線粒體功能及減少細胞凋亡［4］。L6H4是去除了姜黃素β-二酮基團的姜黃素衍生物，具有更好的穩(wěn)定性及更好的抗炎作用［5-6］，但是其作用的機制目前尚未見報道。

本研究通過棕櫚酸（palmitate，PA）誘導(dǎo)肝細胞損傷模擬離體的NAFLD模型，研究NAFLD模型肝細胞中線粒體分裂和融合相關(guān)的作用及其對下游與線粒體凋亡相關(guān)通路的調(diào)節(jié)機制，并觀察姜黃素衍生物L(fēng)6H4的干預(yù)作用，以期闡明NAFLD發(fā)病的分子病理機制及姜黃素衍生物L(fēng)6H4發(fā)揮作用的分子機制。

1　材料和方法

1.1主要試劑和藥物 正常大鼠肝細胞株BRL-3A（上?；鶢栴D生物公司）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；MTT粉末、二甲基亞砜（DMSO）、棕櫚酸粉劑、油酸粉劑（Sigma公司）；姜黃素衍生物L(fēng)6H4粉末（溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院梁廣教授所贈）；蛋白一抗（CST公司）；山羊抗兔二抗（Bioworld公司）；ECL發(fā)光液（杭州弗德生物科技公司）；Trizol、PCR引物合成（Invitrogen公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）；real-time PCR試劑盒（ABI公司）；蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（南京建成生物公司）；電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、成像系統(tǒng)（Biorad公司）；7500 real-time PCR儀（ABI公司）；ELX800酶標儀（Biotek公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybe-netics公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：BRL-3A細胞復(fù)蘇后在1640完全培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，簡稱：培養(yǎng)基）及37 ℃，5% C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，當(dāng)細胞貼壁長滿后，用0.25%胰蛋白酶消化，以l∶3傳代于培養(yǎng)瓶中，取對數(shù)生長期的細胞為實驗對象。

1.2.2MTT法檢測細胞活力及藥物濃度的篩選：收集對數(shù)生長期的細胞以每孔2×104接種于96孔板，待細胞貼壁80%以后，換用不含血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h進行生長同步化后，分別加入終濃度為0.025、0.05、0.1、0.15 mmol/L的PA及0.05 mmol/L的油酸（oleate，OA）進行干預(yù)。另設(shè)空白組和正常組，分別用等量PBS和含有細胞的培養(yǎng)基孵育細胞。各組均設(shè)6個復(fù)孔，干預(yù)24 h后棄細胞上清液，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解?？瞻讓φ照{(diào)零，酶聯(lián)免疫儀（單波長490 nm）測定各孔的吸光度值（OD值）。計算不同濃度作用下細胞的抑制率。本實驗重復(fù)3次。細胞的抑制率=［（實驗組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）］×100%。

選擇即對細胞生長有抑制作用，又不會使大量細胞裂解死亡的PA濃度作為后續(xù)實驗造模濃度。在此造模濃度的基礎(chǔ)上分別加入終末濃度為1、5、10、20μmol/L的姜黃素衍生物L(fēng)6H4進行干預(yù)24 h后，棄細胞上清液，通過MTT法（具體操作同上述）選擇效果最佳的姜黃素衍生物L(fēng)6H4濃度作為后續(xù)實驗藥物干預(yù)濃度。本實驗重復(fù)3次。

1.2.3MDA含量及總SOD（T-SOD）活力的檢測：收集對數(shù)生長期的BRL-3A細胞接種于6孔板，待細胞貼壁80%以后，將細胞分4組即CON組、OA組、PA組及L6H4組，分別加入培養(yǎng)基、含0.05 mmol/L OA的培養(yǎng)基、含0.05 mmol/L PA的培養(yǎng)基及含0.05 mmol/L PA+5 μmol/L姜黃素衍生物L(fēng)6H4的培養(yǎng)基干預(yù)。各組均設(shè)3個復(fù)孔，24 h后棄細胞培養(yǎng)液，用蛋白裂解液充分裂解細胞，收取細胞裂解液，置4 ℃離心（12 000 r/min，10 min），取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白含量，檢測各組細胞內(nèi)MDA含量及T-SOD活力。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。本實驗重復(fù)3次。

1.2.4Real-time PCR技術(shù)檢測指標mRNA的相對表達量：如上述收獲細胞裂解液，按Trizol試劑說明書方法提取總RNA。取1 μg進行RT-PCR反應(yīng)。產(chǎn)物使用10 μL體系放入Real-time PCR儀進行反應(yīng)，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參照，根據(jù)循環(huán)（Ct）值用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。本實驗重復(fù)3次。Drp1上游引物5’-GAAGTGGTGCAGTGGAAATGAC-3’，下游引物5’-GTTTCTATTGGGAACCACTGCC-3’；Mfn2上游引物5’-CACTACCACATCGGACACCCTA-3’，下游引物5’-GAA CTTGTGTCTTGCATTTGGC-3’；Bcl-2上游引物5’-GGTGG AGGAACTCTTCAGGGA-3’，下游引物5’-GGTTCAGGTACTC AGTCATCCA-3’；Bax上游引物5’-TGCTGATGGCAACTTCA ACT-3’，下游引物5’-ATGATGGTTCTGATCAGCTCG-3’；Caspase-3上游引物5’-GAGACAGACAGTGGAACTGACGA TG-3’，下游引物5’-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3’；TNF-α上游引物5’-CGAGTGACAAGCCCGTAGCC-3’，下游引物5’-GGATGAACACGCCAGTCGCC-3’；β-actin上游引物5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物5’-ATACT CCTGCTTGCTGATCC-3’。

1.2.5Western Blot法檢測各指標蛋白的表達：如上述收獲細胞裂解液，置4 ℃離心（12 000 r/min，10 min），取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白含量。定容定量后取樣品加熱變性、加樣、電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉，TBS-T洗膜，4 ℃下I抗孵育過夜，洗膜后 II抗室溫孵育1 h，再洗膜后加化學(xué)發(fā)光液，用Image-lab成像儀曝光顯影。用計算機分析軟件對條帶進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶累積吸光度（A）比作為反映目的蛋白表達水平的相對指標。I抗?jié)舛龋焊鞯鞍字笜?∶1 000，內(nèi)參1∶5 000； II抗?jié)舛龋?∶5 000。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)均以±s表示。參數(shù)多組間比較使用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1藥物適宜干預(yù)濃度選擇 分別以終末濃度0.05 mmol/L的OA及0.025、0.05、0.1、0.15 mmol/L 的PA干預(yù)正常BRL-3A細胞24 h，MTT法檢測細胞活力。結(jié)果表明：0.05 mmol/L OA對細胞活力無明顯影響。與OA組相比，0.025 mmol/L PA組細胞活力變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)PA濃度＞0.025mmol/L時，不同濃度PA對BRL-3A細胞的生長均具有抑制作用，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。隨PA作用濃度的增加，各組細胞活力均呈下降趨勢并且呈明顯劑量依賴關(guān)系。0.1 mmol/L PA為分界點，0.05 mmol/L PA時細胞活力仍＞75%，細胞數(shù)量較多，因此選擇0.05 mmol/L PA作為后續(xù)造模濃度。見圖1。

圖1　不同濃度的PA對BRL-3A細胞活力的影響

分別以終末濃度0.05 mmol/L PA、0.05 mmol/L PA+1 μmol/L L6H4、0.05 mmol/L PA+5 μmol/L 6H4、0.05 mmol/L PA+10 μmol/L L6H4、0.05 mmol/L PA+20 μmol/L L6H4的培養(yǎng)液干預(yù)正常BRL-3A細胞24 h，MTT法檢測細胞活力。結(jié)果表明：當(dāng)L6H4干預(yù)濃度≤10 μmol/L時，細胞活力均高于75%，當(dāng)L6H4干預(yù)濃度＞20 μmol/L，細胞活力降至50%以下。與0.05 mmol/L PA組相比，10 μmol/L 6H4為分界點，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)濃度＜10 μmol/L，細胞活力明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），因此選擇5 μmol/L作為后續(xù)的藥物干預(yù)濃度。而20 μmol/L L6H4已明顯抑制細胞活力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

2.2各組大鼠BRL-3A肝細胞勻漿MDA及T-SOD測定結(jié)果 與CON組相比，PA組大鼠肝細胞內(nèi)MDA含量明顯升高，T-SOD活力則明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與PA組相比，L6H4組MDA含量明顯降低，T-SOD活力明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.3各組大鼠BRL-3A肝細胞Real-time PCR的測定分析結(jié)果 與CON組相比，PA組肝細胞中的Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA相對含量及Bax/ Bcl-2比值均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而Bcl-2、Mfn2的mRNA相對含量則明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。OA組與CON組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與PA組相比，L6H4組肝細胞中的Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA相對含量及Bax/Bcl-2比值明顯下降，而Bcl-2 的mRNA相對含量顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），但是Mfn2 mRNA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2　不同濃度姜黃素衍生物L(fēng)6H4對PA干預(yù)BRL-3A細胞活力的影響

表1　各組大鼠肝細胞MDA及T-SOD活力的比較（±s）

表1　各組大鼠肝細胞MDA及T-SOD活力的比較（±s）

與CON組比：aP＜0.01；與PA組比：bP＜0.01

組別　MDA（nmol/mgprot）T-SOD（U/mgprot）CON組　2.30±0.14　121.18±2.60 OA組　2.39±0.08　111.90±3.23 PA組　4.49±0.44a70.06±4.80aL6H4組　2.81±0.21b98.99±8.09b

2.4各組大鼠BRL-3A肝細胞Western Blot測定結(jié)果

與CON組相比，PA組肝細胞中的Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的蛋白表達及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，而Mfn2、Bcl-2的蛋白表達則顯著下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。OA組與CON組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與PA組相比，L6H4組肝細胞中的Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的蛋白表達以及Bax/Bcl-2的比值明顯下降，而Bcl-2蛋白的表達則明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），但是Mfn2蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

3　討論

圖3　Real-time PCR檢測結(jié)果

NAFLD的發(fā)病機制尚未完全闡明。目前處于主導(dǎo)地位的“二次打擊學(xué)說”認為胰島素抵抗導(dǎo)致肝臟組織脂質(zhì)堆積，形成“第一次打擊”，隨后不斷增加的氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化損傷形成“二次打擊”，誘導(dǎo)了肝臟炎性反應(yīng)、肝細胞變性壞死和肝纖維化的發(fā)生［1］。本實驗通過體外培養(yǎng)大鼠正常肝細胞，PA誘導(dǎo)肝細胞損傷以模擬NAFLD模型。用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的PA均使肝細胞生存能力下降，細胞死亡增加，且成劑量依賴相關(guān)。0.1 mmol/L PA為分界點，為避免PA對肝細胞的過度損傷，本實驗選擇0.05 mmol/L PA成功制作體外造NAFLD模型。在姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)治療PA誘導(dǎo)的肝細胞損傷的實驗中，發(fā)現(xiàn)低濃度姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)可以提高模型肝細胞的生存力，高濃度姜黃素衍生物L(fēng)6H4則加劇模型肝細胞的損傷，其機制有待進一步的研究。10 μmol/L是姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)濃度的分界點。本實驗選擇5 μmol/L姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)治療PA誘導(dǎo)的肝細胞損傷，以期研究其保護肝細胞損傷的機制。

圖4　Western Blot法測定結(jié)果

NAFLD發(fā)展過程中氧化應(yīng)激損傷被認為是重要病理基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激是指機體或細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致活性氧和活性氮在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。MDA是自由基引起的脂質(zhì)過氧化過程中的一種醛類物質(zhì)。SOD可清除H2O2和OH-的前身超氧離子。MDA含量的升高，SOD活性的降低，即可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示氧化應(yīng)激的增高。本實驗發(fā)現(xiàn)PA誘導(dǎo)的肝細胞內(nèi)MDA含量升高，SOD活性降低，提示PA能促使肝細胞的氧化應(yīng)激的增加，而姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)后MDA含量降低，SOD活性升高，提示姜黃素衍生物L(fēng)6H4可通過降低氧化應(yīng)激，從而保護PA誘導(dǎo)的肝細胞損傷。

近幾年來，眾多的研究證實：在病理狀態(tài)下，氧化應(yīng)激產(chǎn)物來自于細胞線粒體，而且氧化應(yīng)激可加重線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的不穩(wěn)定性，其主要表現(xiàn)為線粒體的分裂增加，融合減低。Drp1與Mfn2分別執(zhí)行線粒體的分裂與融合功能，對線粒體形態(tài)的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用［2-3］。Mfn2主要定位于線粒體外膜，負責(zé)線粒體外膜的融合功能，Drp1則處于細胞漿與線粒體外膜之間穿梭的狀態(tài)，當(dāng)細胞處于應(yīng)激狀態(tài)，Drp1定位于線粒體外膜上的分裂位點，使線粒體膜通透性增加，使線粒體內(nèi)物質(zhì)外流增加，從而加重氧化應(yīng)激的程度，促進線粒體分裂增加，線粒體相關(guān)的細胞凋亡的發(fā)生［2-3］。另外，Drp1與Bax共定位在線粒體膜上的分裂位點，Bax的高表達可以協(xié)同Drp1加快線粒體的分裂［7］。在Drp1敲除的細胞中，同樣條件下通過Bax形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)減少線粒體內(nèi)細胞色素C的流出［8］。本實驗中，我們觀察到PA組Drp1、Bax升高，Mfn2下降，提示線粒體可能在Drp1 與Bax協(xié)同作用下分裂的增加，而L6H4組Drp1、Bax明顯下降，Mfn2沒有明顯改變，提示姜黃素衍生物L(fēng)6H4主要是通過抑制Drp1、Bax的表達，減少線粒體分裂。

線粒體分裂增加，不僅可以反過來加重氧化應(yīng)激，還可以導(dǎo)致下游線粒體相關(guān)的細胞凋亡信號通路的開放。Bcl-2家族被認為是主導(dǎo)線粒體凋亡通路的關(guān)鍵分子，直接受到細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響［9］。Bcl-2與Bax作為家族中的重要成員其形成一個相互對立的作用，Bcl-2主要位于線粒體外膜而Bax則處于胞漿與線粒體外膜之間穿梭的狀態(tài)，當(dāng)Bax聚集于線粒體外膜后進入激活狀態(tài)，可以形成環(huán)形脂質(zhì)孔隙從而增加線粒體通透性，使線粒體內(nèi)細胞色素C的流出，向下激活Caspase大瀑布反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生；而線粒體外膜上的Bcl-2則可以與Bax結(jié)合，阻止其進入激活態(tài)，從而抑制細胞凋亡［8，10］，因此Bax/Bcl-2比值成為凋亡早期重要的凋亡信號指標。我們觀察到PA組細胞Bax/Bcl-2比值有明顯升高，而L6H4組Bax/Bcl-2比值則明顯降低，提示PA可通過細胞線粒體凋亡通路導(dǎo)致細胞的凋亡；姜黃素衍生物L(fēng)6H4通過調(diào)低Bax/Bcl-2的比值，抑制線粒體通路的凋亡。

TNF-α是重要的炎癥指標，同時也是細胞損傷早期信號之一。TNF-α蛋白定位于細胞膜上，在接受細胞外源性損傷刺激后向膜內(nèi)傳導(dǎo)激活Caspase-8進而激活Caspase-3。眾所周知，Caspase-3位于各凋亡通路的最下游，是凋亡最后的執(zhí)行者，也是細胞凋亡的指標。Caspase-3表達增加，則凋亡的發(fā)生增加。本實驗觀察到PA組TNF-α與Caspase-3均明顯升高，結(jié)合我們的MTT實驗結(jié)果，即PA導(dǎo)致肝細胞的死亡（凋亡），細胞的生存能力降低，提示PA降低肝細胞的生存能力，可能是因為其增加肝細胞Caspase-3的表達，促使肝細胞的凋亡。而L6H4組中TNF-α、Caspase-3明顯降低，提示姜黃素衍生物L(fēng)6H4可能是通過減少肝細胞的凋亡，發(fā)揮其保護作用。

綜上所述，在PA誘導(dǎo)肝細胞的損傷的過程中，Drp1表達增高，Mfn2的表達降低，一方面促使線粒體的分裂增多，融合減少，線粒體產(chǎn)生更多的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，加重細胞的損傷；另一方面Drp1和Bax可能通過兩者的協(xié)同作用，在增加線粒體分裂的同時，調(diào)高Bax/Bcl-2比值，激活線粒體凋亡通路及TNF-α為首的炎癥因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最后凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的增加，導(dǎo)致細胞凋亡。姜黃素衍生物L(fēng)6H4通過調(diào)低Drp1、Bax的表達，削弱Drp1、Bax的協(xié)同作用，減少線粒體的分裂及氧化應(yīng)激，同時降低Bax/Bcl-2比值，抑制線粒體凋亡通路的激活及炎癥因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少細胞凋亡的發(fā)生。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Roles of Drp1 and Mfn2 in palmitate induced rat hepatocyte injury and the effects of curcumin derivative L6H4 on it

ZHENG Jingyu1, WU Huan1, TANG Wen1, LIU Cheng1, DING Tingting1, DAI Shuang1, WU Ling1, ZHU Zaisheng2, LI Jianmin1. 1.Department of Pathology, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Gerontology, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the roles and mechanism of mitochondrial dynamin-related protein 1 （drp1） and mitochondrial fusion protein 2 （Mfn2） in palmitate （PA） induced rat hepatocyte injury in the model of nonalcoholic-fatty-liver-disease （NAFLD） in vitro， and the effects of curcumin derivative L6H4 on it. Methods: Rat BRL-3A hepatocytes were cultured with difference concentrations of PA and oleate （OA） and PA+ curcumin derivative L6H4 mixed medium for 24 hours respectively. Cell vitality was detected by MTT assay and the optimal concentration of PA for establishing non alcoholic fatty liver model in vitro and drug intervention of curcumin derivative L6H4 were screened. Cells were divided into 4 groups： control group （CON group）， oleate group （OA group）， palmitate group （PA group） and curcumin derivative L6H4 intervention group （L6H4 group）， andwere cultured with normal medium， containing oleate medium， containing palmitate medium and containing palmitate and curcumin derivative L6H4 mixed medium for 24 hours， respectively. Total SOD activity was detected y hydroxylamine method. The content of MDA was analyzsed by thiobarbituric acid method. The expression of mRNA and protein of Drp1， Mfn2， Bcl-2， Bax， Caspase-3， TNF-α of hepatocyte were detected by real-time PCR nd Western blot respectively. Results: Different concentrations of PA had certain inhibitory effect on BRL-3A ells growth （P＜0.05）， and showed a clear dose dependence manner， 0.1 mmol/L PA was the cut-off point， while .05 mmol/L OA had no obvious effect. 0.05 mmol/L PA was selected as the optimal concentration to establish he model of NAFLD in vitro. The cell viability was higher than 75% when the concentration of curcumin derivaive L6H4 was lower than 10 μmol/L. The cell viability dropped to below 50% （P＜0.05） when the concentration f curcumin derivatives L6H4 was higher than 20 μmol/L， 10 μmol/L L6H4 was the cut-off point. Therefore， 5 mol/L curcumin derivative L6H4 was chosen for subsequent L6H4 interfere concentration. Compared with the CON group， MDA content of cellular homogenization and the expressions of mRNA and protein of Drp1， Bax，Caspase-3， TNF-α were increased （P＜0.05） signifi cantly， T-SOD activity and the expressions of mRNA and proein of Mfn2， Bcl-2 were decreased （P＜0.05） signifi cantly in PA group. Compared with the PA group， MDA conent of cellular homogenization and the expressions of mRNA and protein of Drp1， Bax， Caspase-3， TNF-α were ecreased signifi cantly （P＜0.05）， T-SOD activity and the expressions of mRNA and protein of Bcl-2 were inreased signifi cantly （P＜0.05） in L6H4 group， but the expression of Mfn2 had no signifi cant difference （P＞0.05）. Conclusion: Curcumin derivative L6H4 plays an important role in attenuation hepatocyte injury induced by PA，which is associated with its decrease the lipid peroxidation， inhibition mitochondrial fi ssion and suppression the ownstream of mitochondrial apoptotic pathway and signal transduction of infl ammatory factor. It may be one of he underlying mechanism for curcumin derivative L6H4 to treat NAFLD.

curcumin derivative L6H4； BRL-3A； palmitate； mitochondria； apoptosis

R361.2

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.001

2016-02-29

國家自然科學(xué)基金資助項目（81170204）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y15H250006）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014KYA137）；溫州市公益性科技計劃項目（Y20150176）。

鄭靖宇（1988-），男，浙江溫州人，碩士生。

李劍敏，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：wzyxyljmin@163.com。