吳靜波，黃健強，南文金，胡鴻惠，彭國良（韶關學院/廣東省粵北生豬生產及疫病防控協同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關 512005）

粵北地區(qū)規(guī)模化豬場藍耳病抗體水平及其與病毒血癥關系的初步研究

吳靜波，黃健強，南文金，胡鴻惠，彭國良
（韶關學院/廣東省粵北生豬生產及疫病防控協同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關 512005）

藍耳病是全球生豬規(guī)?；B(yǎng)殖場所面臨的共同難題，現仍缺少有效的治療藥物，而疫苗免疫是控制該病最為有效的手段。為了解粵北地區(qū)規(guī)?；i場的藍耳病抗體水平，對該地區(qū)4家豬場382份血清樣品進行ELISA檢測，并設計熒光定量RT-PCR方法對血清中的病毒RNA進行檢測，以初步探討豬群抗體水平與病毒血癥的關系。結果顯示：粵北地區(qū)規(guī)?；i場的藍耳病抗體陽性率為82.9%，平均S/P值為1.59；但抗體水平離散度較大，4家豬場抗體水平的變異系數均高于25%。經靈敏度為10-1.5TCID50/mL的熒光定量RT-PCR方法檢測顯示，豬群病毒血癥發(fā)生率為12.4%，其中抗體水平不穩(wěn)定群中病毒血癥發(fā)生率為16.7%，明顯高于抗體穩(wěn)定群的7.3%。研究表明，粵北地區(qū)地區(qū)抗體陽性率和抗體效價較高，但均一性差，藍耳病發(fā)病的可能性較大；同時抗體不穩(wěn)定豬群出現病毒血癥的概率更高。

藍耳??；PRRSV；抗體水平；病毒血癥

吳靜波，黃健強，南文金，等. 粵北地區(qū)規(guī)?；i場藍耳病抗體水平及其與病毒血癥關系的初步研究［J］.廣東農業(yè)科學，2016，43（8）：143-150.

豬呼吸道與繁殖綜合征（PRRS）又稱藍耳病，是由豬呼吸道與繁殖綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)的急性、高度傳染性疾病，主要引起發(fā)熱、母豬繁殖障礙、早產、流產、死胎、木乃伊胎及仔豬呼吸綜合征等臨床癥狀，母豬流產率可達40%，仔豬病死率高達50%以上，是目前造成生豬生產損失最嚴重的疾病之一［1-3］。

由于PRRS缺少有效的治療藥物，并且存在高度變異、免疫逃避和持續(xù)感染等因素，使得豬場一旦感染PRRSV就很難完全清除［4-7］。目前控制PRRS發(fā)生的方法主要有優(yōu)化管理、撲殺感染豬、生物隔離和接種疫苗，其中定期對豬群進行疫苗免疫仍然是控制該病傳播最有效的手段。當前我國市場上商品化的藍耳病疫苗包括滅活疫苗和弱毒疫苗兩類，滅活疫苗安全但是抗體產生慢，免疫效率低；弱毒疫苗雖有毒力并可引起流產等癥狀，但抗體產生快，效價高且持續(xù)時間持久，能有效降低疾病的嚴重性、縮短毒血癥時間、減低繼發(fā)感染幾率。因此大部分豬場偏好免疫弱毒苗用于藍耳病防控［8-9］。但是隨著近年弱毒疫苗的大量使用和混用，使得藍耳病疫情越來越復雜［10］。從我們近幾年對藍耳抗體的檢測數據來看，雖然豬場抗體陽性率和抗體水平不斷上升，但抗體的整齊性卻越來越差，異常的抗體水平越來越多。其中，低水平抗體可能因抗體依賴增強作用（ADE）反而有利于病毒生長［11］，而異常高的抗體水平有可能是疫苗引起的病毒血癥或者野毒感染，因此異?？贵w水平給豬群帶來的保護力并不明確。

最近幾年，粵北地區(qū)藍耳病的防控形勢也越來越嚴峻，多種弱毒疫苗的混用和不規(guī)范引種導致部分豬場病毒株群越來越復雜。為進一步了解目前形勢下粵北地區(qū)藍耳病抗體水平，本研究對該地區(qū)的4個豬場328份樣品進行藍耳病抗體ELISA檢測，并構建高靈敏度的熒光定量RT-PCR方法對其中121份樣品進行藍耳病病原RNA的定量檢測，初步分析藍耳病抗體水平與病毒血癥的關系。

1　材料與方法

1.1血清樣品的采集及處理

2014年12月至2015年12月，我們在對豬場抗體水平的常規(guī)監(jiān)測中，采集了粵北地區(qū)4家規(guī)?；i場共328頭豬的上腔靜脈血，包括208頭種豬和120頭仔豬，具體采集情況如表1所示。靜脈血采集后室溫靜置1 h釋出血清，然后冷藏運輸回實驗室，10 000 r/min離心分離血清。將血清分為兩部分，一部分進行ELISA檢測，一部分進行病毒RNA提取，用于病原RTPCR檢測。在檢測抗體的同時，我們還對豬場的疫苗免疫、生產和發(fā)病情況進行調查，具體情況如表1所示。

1.2抗體水平的ELISA檢測

使用PRRSV抗體檢測試劑盒（美國IEDXX公司）對抗體水平進行ELISA檢測，該試劑盒只檢測針對PRRSV核衣殼蛋白（N蛋白）的抗體。實驗操作嚴格按照說明書進行。在陰陽性對照成立的前提下，如果S/P值＜0.4，樣品判定為PRRSV抗體陰性；如果S/P值≥0.4，樣品判定為PRRS抗體陽性。

表1　4個規(guī)?；i場基本情況和采樣信息

1.3RNA提取

采用RNAiso Plus試劑〔Code No.：9108Q，寶生物工程（大連）有限公司〕進行病毒RNA提取，實驗操作要按照說明書進行。所提取的RNA于-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4熒光定量RT-PCR的引物探針設計及擴增條件

PRRSV的膜基質蛋白（M蛋白）基因序列在所有毒株中呈高度保守。我們對10株經典株和10株高致病株的M蛋白基因進行多重比對，以高致病株JXA1的基因組序列（GenBank登錄號：EF112445）為參考序列在M蛋白基因的保守區(qū)內設計引物和探針，引物和探針序列信息如表2所示，使用FAM發(fā)光基團和BHQ1淬滅基團標記探針兩端。使用MAGA 5.1和Oligo 7進行多重比對和引物探針設計，引物探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。

熒光定量RT-PCR擴增使用ABI 7 500熒光定量RT-PCR系統(tǒng)進行擴增和分析，以One Step PrimeScript? RT -PCR Kit （Perfect Real Time）〔Code No.：RR064A，寶生物工程（大連）有限公司〕作為檢測試劑。擴增體系20 μL，包括10 μL One Step RT-RT-PCR Buffer （2×）、0.4 μL Ex Taq HS（5 U/μL），0.4 μL PrimeScript RT Enzyme Mix，0.5 μL引物（10 μmol/L）和探針（5μmol/L）、2 μL RNA模板、0.4 μL ROX Reference Dye（50×），無RNA酶水補至25 μL。擴增條件：42℃逆轉錄30 min，94℃滅活逆轉錄酶和預變性2 min；94℃變性5 s、60℃退火和延伸35 s，40個循環(huán)，并收集熒光。

表2　引物探針序列

1.5熒光定量RT-PCR的特異性和靈敏度檢測

用我們建立的方法對多個病毒（HPPRRSV、經典PRRSV、JEV、CSFV、PCV、PRV、TGEV、PEDV、ProV）的RNA/DNA進行檢測，以驗證本方法的特異性。病毒來源：豬圓環(huán)病毒為本實驗室分離保存；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）購自廣東大華農動物保健品股份有限公司；豬乙型腦炎活疫苗（SA-14-14-2株）、豬瘟活疫苗（CVCC AV1412）、豬偽狂犬活疫苗（HB-98株）購自武漢科前生物制品有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征疫苗（CH-1R株）和豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒三聯活疫苗（弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株）購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司。

將提取的HP-PRRSV JXA1-R株的RNA進行10倍梯度稀釋作為標準品，根據病毒的原始滴度計算，梯度稀釋后的濃度為1×105.5～1× 10-1.5TCID50/mL。使用我們建立的方法對稀釋好的標準品進行擴增，每個梯度3個復孔，檢測方法的靈敏度并繪制標準曲線，計算相關系數和擴增效率。

1.6抗體水平與病毒血癥關系分析

提取A和B豬場121份血清的病毒RNA作為模板，用我們建立的熒光定量RT-PCR方法進行檢測，記錄樣品攜帶PRRSV的情況，并根據標準曲線計算陽性樣品中含有的PRRSV滴度。結合樣品的ELISA和病原RT-PCR結果，分析不同S/P值區(qū)間內樣品RT-PCR陽性率、RT-PCR陽性樣品的S/P值大小分布及樣品攜帶病毒量對S/P值大小的影響，初步探討抗體水平與病毒血癥的相關性。

2　結果與分析

2.1抗體水平檢測結果

4個豬場328份血清的抗體S/P值情況如圖1所示。從圖1可以看見，4個豬場樣品S/P值的離散度較大，表明抗體水平的均一性較差。從表3可知，4個豬場總的抗體陽性率為82.9%，各豬場的總體抗體陽性率都達到80%以上，但A豬場仔豬群的抗體陽性率只有38.5%。4個豬場的平均S/P值均大于0.8，總體平均S/P值達到1.59，處于一個較高的水平；25.4%的抗體陽性樣品的S/P值＞2.5，其中A豬場種豬群的平均值達到2.82，63.8%的樣品S/P值＞2.5，最高S/P值甚至達到4.243。檢測顯示4個豬場抗體水平的變異系數均高于25%，最低和最高值均出現在A豬場，分別是種豬群的32.1%和仔豬群的109.0%。

圖1　4個豬場的血清樣品S/P值情況

2.2熒光定量RT-PCR的特異性

所建立的熒光定量RT-PCR方法對HPPRRSV、經典PRRSV、JEV、CSFV、PCV、PRV、TGEV、PEDV、ProV的檢測結果如圖2所示，顯示本方法可特異性檢測出HP-PRRSV和經典PRRSV，而對JEV、CSFV等其他陰性對照病毒沒有非特異性反應，具有良好的特異性。

圖2　熒光定量RT-PCR特異性檢測擴增曲線

2.3熒光定量RT-PCR的標準曲線及靈敏度

熒光定量RT-PCR對濃度梯度為1× 105.5～1×10-1.5TCID50/mL的標準品的檢測結果如圖3A所示，顯示1×10-1.5TCID50/mL以上的標準品均出現熒光增長曲線，檢測為陽性，即本方法的檢測極限達到1×10-1.5TCID50/mL。對所有標準品檢測結果進行分析并繪制標準曲線（圖3B），顯示8個濃度梯度標準品的檢測CT值與對應滴度的Log10值呈線性關系，且線性范圍極寬；線性方程為y =-3.077x+33.42（y為CT值，x為原始滴度的Log10值），相關系數（R2）為0.9959，擴增效率為111.345%。

表3　4個豬場的抗體檢測結果

圖3　熒光定量RT-PCR對標準品檢測的擴增曲線（A）及標準曲線（B）

2.4血清樣品的RT-PCR檢測結果

應用建立的熒光定量RT-PCR方法對A 和B兩豬場的所有血清樣品的病毒RNA進行檢測，部分樣品的擴增結果如圖4所示，兩豬場121份樣品中有15份樣品熒光定量RTPCR檢測為陽性，陽性率為12.4%，其中仔豬占66.7%、種豬占33.3%。由表4可知，A豬場陽性樣品4份，占該豬場檢測樣品數的6.7%；B豬場陽性樣品11份，占該豬場檢測樣品數的18.0%。另外A豬場種豬陽性樣品3份、仔豬1份，分別占各自豬群的6.4%和7.7%；B豬場種豬陽性樣品3份、仔豬9份，分別占各自豬群的12.5%和24.3%。根據標準曲線計算獲得各陽性樣品的原始PRRSV滴度，A豬場陽性樣品病毒滴度較低，含量在1×10-1.16～1×101.9TCID50/mL之間，B豬場病毒滴度含量范圍較大，在1 ×10-1.3～1×105.3TCID50/mL之間，最高與最低相差106.6倍。

圖4　部分樣品的熒光定量RT-PCR檢測擴增曲線

表4　15份陽性樣品熒光定量RT-PCR檢測結果

2.5抗體水平與病毒血癥的關系

結合表3的ELISA檢測結果和表4的熒光定量RT-PCR檢測結果發(fā)現，S/P值＜0.4和S/P值＞2.5的豬群中病毒血癥發(fā)生率為16.7%，其中S/P值＜0.4的豬群病毒血癥發(fā)生率為17.6%；S/P值＞2.5的豬群中病毒血癥發(fā)生率為16.3%，并且B場仔豬S/P值＞2.5的豬群中病毒血癥發(fā)生率達到33.3%；S/P值在0.4～2.5之間的豬群中病毒血癥發(fā)生率為7.3%，其中S/P值在0.8～1.2之間的豬群病毒血癥發(fā)生率為0。分析RT-PCR陽性樣品的S/P值還發(fā)現，73.3%的RT-PCR陽性樣品的S/P值處在異常范圍（＜0.4或＞2.5），其中A場的RT-PCR陽性樣品的S/P值均在異常范圍；但血清中的病毒滴度與S/P值沒有明顯的相關性，滴度較高的幾份樣品的S/P值分別為0.23、3.38、0.66、2.5，在抗體水平的3個區(qū)間內均有分布。

3　討論

由于免疫效果不明顯、病毒不斷變異及其他免疫逃逸機制等因素的存在，PRRSV急性發(fā)病后一般會出現一個慢性、持續(xù)性的感染過程［4-7，12］。持續(xù)感染是PRRSV流行中的一個重要特征，同時也是病毒在豬群內成功長期存在的關鍵，而這些帶毒豬正是藍耳病最主要的傳染源。為對抗PRRSV的持續(xù)感染，防治疾病的再次暴發(fā)，接種疫苗是最為有效的方法。研究顯示，一定的抗體水平，尤其是中和抗體，有利于減輕PRRSV陽性豬的臨床癥狀，降低豬群發(fā)病率和死亡率［13-15］，因此藍耳病疫苗一直是農業(yè)部強制免疫的范圍。良好的豬場藍耳病抗體陽性率為70%～80%，離散度在25%左右，S/P值在0.8～1.2之間，并且保證S/P值＞2.5的豬只占豬群5%以下。但最近幾年出現部分豬場為追求高的抗體陽性率和效價，超份額、頻繁甚至混用藍耳病疫苗，造成豬場的抗體水平越來越不穩(wěn)定，疫情也越來越復雜。從我們的調查可看到，粵北地區(qū)規(guī)?；i場藍耳病的平均抗體陽性率達到82.9%，平均S/P值達到1.59，各豬場的平均陽性率和S/P值均能到達70%和0.8的合格線，發(fā)病1個月后的A豬場種豬抗體陽性率甚至達到100%，平均S/P達到2.82。調查顯示此地區(qū)的藍耳病抗體水平保持在一個較高的水平，但抗體水平的均一性較差，各豬場種豬和仔豬的變異系數均高于25%，25.4%的抗體陽性樣品的S/P值＞2.5；A豬場的同一批免疫的仔豬甚至出現明顯的抗體強陽性群和抗體陰性群。結合各豬場疫病情況，可初步說明高抗體水平并不能完全阻擋PRRSV的侵襲，反而抗體水平不穩(wěn)定的豬場面臨藍耳病暴發(fā)的風險更大。

PRRSV感染的第一階段一般持續(xù)2周或以上，此時所有年齡段的豬群均可發(fā)病，發(fā)病率為5%～75%，主要表現為急性病毒血癥，PRRSV能夠使感染豬在12 h即出現病毒血癥，24 h時病毒遍布所有淋巴組織和肺臟，7～14 d時血清、淋巴結和肺臟中的病毒滴度達到最高峰，大概為102～105TCID50/mL。急性病例第一階段后進入以繁殖障礙為主要特征的第二階段，此階段一般持續(xù)1～4個月，同樣會伴隨病毒血癥，斷奶前仔豬死亡也主要發(fā)生在這一階段。經歷完這一階段后，大部分豬群會進入持續(xù)感染階段，此階段血液中病毒與抗體長期共存［16］。因此病毒血癥伴隨著PRRSV流行的每一個階段，有研究表明，PRRSV引起的病毒血癥在豬群中可持續(xù)6～7周，甚至可長達210 d［17］。而這些都是使用普通RT-PCR方法檢測所獲得的數據，為更準確檢測病毒血癥，我們建立了針對PRRSV膜基質蛋白基因的熒光定量RTRT-PCR檢測技術，該方法靈敏度達到10-1.5TCID50/mL，并且具有良好的特異性。從我們檢測的數據可看到，A、B兩豬場的病毒血癥發(fā)生率為12.4%，處在第一階段的B豬場和處在第二階段后期的A豬場都仍有病毒血癥的存在，發(fā)生率分別為18.0%和6.7%，第一階段稍高于第二階段。分析還發(fā)現A、B兩豬場仔豬病毒血癥發(fā)生率為7.7%和24.3%，而種豬的發(fā)生率為6.4%和12.5%，即無論是疾病的第一階段還是第二階段，出現病毒血癥的主要是免疫力較低的仔豬（占病毒血癥樣品的66.7%），與相應群體的抗體陽性率無明顯相關性。說明病毒血癥發(fā)生率與豬群的抗體陽性率沒有直接關系，另外定量結果也顯示病毒血癥樣品的病毒滴度與其抗體水平同樣沒有直接關系。

按照藍耳病抗體水平的高低，我們將藍耳病陽性豬場的豬群分為抗體水平穩(wěn)定群（0.4≤S/P值＜2.5）和抗體水平不穩(wěn)定群（S/P值＜0.4 或S/P值≥2.5）。其中，抗體水平穩(wěn)定群因有抗體的保護受PRRSV感染的壓力最小，但隨著抗體依賴增強作用機制的發(fā)現，低濃度的抗體或許更有利于病毒的傳播；抗體水平不穩(wěn)定群的陰性群（S/P值＜0.4）沒有抗體保護，面臨PRRSV感染的壓力最大，只能依靠自身免疫機制抵抗野毒入侵；抗體水平不穩(wěn)定群中的高抗體群（S/P值≥2.5）現在對病毒的抵御能力還比較模糊，一般認為高抗體效價是由于野毒或者毒力較強的疫苗株感染導致，即異常高的抗體水平預示著豬只正在發(fā)病。為進一步探究豬只抗體水平與病毒血癥的關系，我們對A、B兩豬場的121份樣品進行ELISA和熒光定量RTPCR檢測，結果發(fā)現抗體水平不穩(wěn)定群的陰性群和陽性群病毒血癥發(fā)生率分別為17.6%和16.3%，合計為16.7%，均明顯高于抗體水平穩(wěn)定群的7.3%，抗體水平良好的豬群（S/P值在0.8～1.2之間）甚至為0；另一方面，73.3%的RT-PCR陽性樣品為抗體水平不穩(wěn)定群樣品。以上結果說明抗體不穩(wěn)定豬群與病毒血癥的關系較為密切，抗體不穩(wěn)定豬群中發(fā)生病毒血癥的概率更高，而病毒血癥樣品中抗體異常的樣品也占主要部分，但兩者之間并沒有絕對的對應關系。至于到底是病毒血癥引起抗體異常，還是抗體異常導致抵抗力下降引起病毒血癥，我們的實驗結果并不能體現，需要后續(xù)動物實驗作進一步研究探索。

綜上所述，經過初步調查，粵北地區(qū)規(guī)?；i場的抗體陽性率和抗體效價較高，但離散度大，均一性差，藍耳病發(fā)病的可能性較大；同時研究發(fā)現，抗體不穩(wěn)定豬群中出現病毒血癥的概率更高，兩者之間關系密切但不是絕對的對應關系。

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（責任編輯 崔建勛）

Preliminary research on PRRSV antibody level of scale pig farms in northern Guangdong and its relationship with viremia

WU Jing-bo，HUANG Jian-qiang，NAN Wen-jin，HU Hong-hui，PENG Guo-liang
（Shaoguan University/North Guangdong Collaborative Innovation Development Center for Swine Farming and Disease Control，Shaoguan 512005，China）

Porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRS） is a serious problem common to the swine industry worldwide. Because it is lack of effective drug for treatment，vaccination is still the most effective means for preventing and controlling PRRS. In order to monitor the PRRSV antibody level of the scale pig farms in northern Guangdong，this study conducted ELISA of the PRRSV antibody of 382 serum samples from 4 pig farms in northern Guangdong. For explorating the relationship of PRRS antibody level and viremia，this study detected PRRSV RNA by fluorescence quantitative reverse-transcriptase PCR assay which was established in this study. Results showed that the positive rate of PRRS antibody of 4 pig farms was 82.9%. Mean value of S/P was 1.59. But the degree of dispersion was large，variable coefficient of S/P value was over 25% in all farms. This study found that the incidence of viremia of 4 pig farms was 12.4%，using the fluorescence quantitative RT-PCR whose detection limit was 10-1.5TCID50/mL，and the incidence of viremia of antibody unstable group was 16.7%，significantly higher than antibody stable group，whose incidence was 7.3%. The positive rate and antibody titer in northern Guangdong were high，but consistencywas poor，leading to high incidence of PRRS. Besides，this study also found that the incidence of viremia in antibody unstable groups was higher than that in stable groups.

PRRS；PRRSV；antibody level；viremia

S852.65+9；S858. 28

A

1004-874X（2016）08-0143-08

2016-04-11

廣東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（生豬產業(yè)創(chuàng)新團隊）；韶關市科技計劃項目（2013CX/NO9，2014CX/N319）；韶關學院科研項目（314-140694）

吳靜波（1988-），男，碩士，助教，E-mail：xiaobo.maple@163.com

彭國良（1965-），男，碩士，研究員，E-mail：pengguoliang168@163.com