馬 壯，彭新宇，葉得河，高 彪，袁明貴，尹燁華，徐志宏（.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；.廣東省農(nóng)科院動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 50640）

冷鮮雞產(chǎn)氣莢膜梭菌及其毒素的潛在危害分析

馬 壯1，2，彭新宇2，葉得河1，高 彪2，袁明貴2，尹燁華2，徐志宏2
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2.廣東省農(nóng)科院動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640）

為調查廣州市冷鮮雞產(chǎn)氣莢膜梭菌及其毒素危害，從廣州市各大型超市隨機采集雞肉樣品進行產(chǎn)氣莢膜梭菌分離、鑒定和毒素分型，同時檢測分離菌株對常用抗生素的抗藥性，并采用Eric-PCR對分離出梭菌進行亞型分析。結果表明，從78個樣本中分離出57株產(chǎn)氣莢膜梭菌，所有菌株均為A型，其中，cpb2（Atypical）型40株，cpb2（consensus）型1株；含netB基因菌株1株；藥敏結果顯示，分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌大部分對氟苯尼考、氨芐西林、青霉素敏感；值得注意的是產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對僅可用于人的抗生素克林霉素、頭孢氨卞的耐藥率分別達73.68%和31.58%。Eric-PCR結果顯示，相似性為80%時，57株梭菌可分為13個亞型，提示污染來源的多樣性。

冷鮮雞；產(chǎn)氣莢膜梭菌；毒素；耐藥性；Eric-PCR

馬壯，彭新宇，葉得河，等. 冷鮮雞產(chǎn)氣莢膜梭菌及其毒素的潛在危害分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2016，43（8）：113-118.

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是一種在自然界和動物腸道中廣泛存在的革蘭氏陽性芽孢桿菌［1］，在一定條件下可引起人和動物發(fā)病［2］，如可致雞壞死性腸炎和人的食物中毒、創(chuàng)傷性氣性壞疽等，是一種條件性致病菌。該種梭菌能產(chǎn)生多種致病性外毒素，其中α、β、ε、ι是主要致死毒素，據(jù)此，將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、 C、D、E5種類型［3］，其中A型是對人和禽類產(chǎn)生主要致病性的菌株。產(chǎn)氣莢膜梭菌中的β2毒素的編碼基因分為cpb2 （Consensus）和cpb2（Atypical）兩種，β2毒素與其對人的致病性有關［4］；netB毒素［5］是一種新發(fā)現(xiàn)的毒素，據(jù)國外研究報道，這種新毒素與雞壞死性腸炎密切相關。

產(chǎn)氣莢膜梭菌對養(yǎng)雞業(yè)具有重大經(jīng)濟影響，據(jù)估計，全世界每年因壞死性腸炎所致養(yǎng)雞業(yè)經(jīng)濟損失高達20億美元以上。目前控制雞產(chǎn)氣莢膜梭菌的通用方法是在飼料中添加飼用抗生素。但出于對細菌耐藥性及其傳播的擔憂，世界上越來越多的國家開始限制乃至禁止在飼料中添加抗生素和化學藥，而這使得雞產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎發(fā)病率顯著升高，進而造成在肉雞制品中該菌污染機會增加。國外已有較多雞肉中產(chǎn)氣莢膜梭菌及毒素情況的報道，而國內(nèi)還未見冷鮮雞中產(chǎn)氣莢膜梭菌及毒素的系統(tǒng)研究報道。

本文通過對廣州市超市中冷鮮雞肉樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌進行分離鑒定、毒素分型及抗藥性分析、基因分型等，對廣州市冷鮮雞中產(chǎn)氣莢膜梭菌及其毒素的危害進行分析，為防范雞產(chǎn)氣莢膜梭菌及其毒素可能引起的食品安全風險提供參考。

1　材料及方法

1.1試驗材料

產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株：A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（ATCC13124）購于廣東省微生物菌種保藏中心；B型（CVCC54）和C型（CVCC58）產(chǎn)氣莢膜梭菌購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。netB質粒：由澳大利亞國立動物健康研究所Anthony Keyburn博士等提供；cpb2 （Consensus）和cpb2（Atypical）兩種基因型菌株由本實驗室分離保存。

冷鮮雞翅購自廣州各大型超市，4℃冷藏保存運至實驗室。

主要試劑：液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FT）、胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC）、胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基配套試劑、血平板、牛乳培養(yǎng)基、微量生化發(fā)酵管：均購自于青島海博生物技術有限公司；2.5 L厭氧產(chǎn)氣袋：日本株式會社生產(chǎn)；藥敏片：杭州微生物；PCR反應液（2×Taq MasterMix）。

主要實驗儀器：PCR儀：MJMini BIORAD；生物安全柜：J11101110（蘇州安泰空氣技術有限公司）；低溫離心機：centrifuge 5804R eppendorf；凝膠成像儀：ZF-258（上海嘉鵬科技有限公司）、電泳儀：DYY-8C型（北京市六一儀器廠）；微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)：MPI（廣州市尤德生物科技有限公司）。

PCR引物：（1）多重PCR引物［6］，預期片段大小分別為α402 bp、β236 bp、ε 541 bp、ι317 bp（表1）。（2）產(chǎn)氣莢膜梭菌3個毒素基因，netB 383 bp、cpb2（Consensus ）304 bp和cpb2（Atypical） 741 bp［7］引物（表2）。（3）Eric-PCR 引物［8］，ERIC 1：5- ATGTAA GCTCCTGGGGATTCAC-3 ；ERIC2：5-AAGTAA GTGACTGGGGTGAGCG-3。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定 （1）細菌分離。無菌稱取20 g雞肉樣品，剪碎，置于50 mL小燒杯中，并加入適量FT（液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基）浸沒雞肉，并用力搖晃使雞肉和FT培養(yǎng)基充分混合，45℃厭氧培養(yǎng)20 h；用接種環(huán)蘸取以上培養(yǎng)過后的液體接種于TSC平板（胰?-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基），45℃厭氧培養(yǎng)1～2 d；在TSC平板上長出黑色菌落的，從每個中挑選黑色的菌落接種于血平板上，45℃厭氧培養(yǎng)24 h；再在血平板上挑選具有雙層溶血環(huán)的單個菌落接種于10 mL的液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，45℃厭氧過夜培養(yǎng)。

表1　多重PCR引物序

表2　毒素引物序列

（2）生化鑒定。將陽性對照菌株和疑似菌株的單菌落分別接種于各種生化發(fā)酵管中，37℃厭養(yǎng)培養(yǎng)24 h，觀察結果。

（3）牛乳發(fā)酵試驗：將陽性菌株和疑似菌株接種于含有牛乳培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，觀察是否有爆乳發(fā)酵現(xiàn)象。

1.2.2菌株的毒素基因分型 （1） DNA的提取。采用煮沸法提取DNA，從各過夜培養(yǎng)過的培養(yǎng)物中用移液槍各吸取1 mL菌液于2 mL無菌離心管中，10 000 r/min常溫下離心3 min，棄去上清液，加入300 μL PBS緩沖液，渦旋振蕩混勻、洗滌菌體再離心，反復兩次；向菌體沉淀中加入100 μL無核酸酶水，渦旋振蕩混勻，100℃煮沸10 min；4℃10 000 r/min離心15 min，取上清液作為DNA模板。

（2）PCR鑒定。PCR反應體系中，所有引物濃度均為10 pmol/μL，上下游引物各為0.5 μL，每個PCR反應體系的最終體積為25 μL，2×MixMaster 12.5 μL，無核酸酶水9.5 μL，DNA模板2 μL。

多重PCR反應程序：94℃預熱2 min；94℃變性45 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；之后72℃延伸10 min，然后保持在4℃。netB、cpb2（Consensus）和cpb2（Atypical）3對引物的反應程序如下：94℃預變性2 min，-94℃45 s，退火溫度50～55℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)；循環(huán)最后72℃ 5 min，4℃保存。其中netB的退火溫度為55℃，cpb2（Consensus）和cpb2（Atypical）的退火溫度為50℃。

取擴增產(chǎn)物8 μL，1%的瓊脂糖凝膠，90v電泳45 min，在紫外下拍照分析。

1.2.3藥敏實驗 按照CLSI標準推薦的方法選取11種常用的抗生素進行藥敏實驗。將分離鑒定過的產(chǎn)氣莢膜梭菌在FT培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～10 h，取300 μL培養(yǎng)過的菌液加入另一個試管中，用滅菌生理鹽水稀釋，使其與0.5麥氏標準濃度一致（細菌濃度大致為1.5×108CFU/mL），在FT平板上均勻涂布接種，3～5 min后，用滅菌鑷子放置藥片，各紙片中心相距大于24 cm，紙片聚平皿內(nèi)緣大于15 cm； 38℃厭氧培養(yǎng)24 h （3個重復）。用游標卡尺測量抑菌圈直徑 。

結果判定標準：抑菌圈直徑大于15 mm為敏感，10～15 mm為中敏，小于10 mm為耐藥。1.2.4 Eric-PCR PCR反應體系：25μL反應體系，DNA模板2 μL、上下游引物（10 pmol/ μL）各1 μL、2×MixMaster 12.5 μL、無核酸酶水8.5 μL。

PCR反應程序：94℃5 min；94℃1 min，32℃ 1 min，72℃2 min，前5個循環(huán)；后40個循環(huán)94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 1 min。最后72℃，10 min，8℃ 保存。

電泳：PCR反應結束后用1%的瓊脂糖電泳檢測，每個樣品加8 μL，80V電泳45 min，照相結果通過NTSYS軟件聚類分析。

2　結果與分析

2.1雞肉中梭菌的分離鑒定結果

通過選擇性培養(yǎng)基的篩選分離發(fā)現(xiàn)，78個雞肉樣本中有57個樣品中分離出疑似菌株；生化實驗結果表明，疑似菌株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、液化明膠、產(chǎn)生硫化氫、硝酸鹽還原反應，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、水楊苷陰性、動力性試驗陰性、不產(chǎn)生吲哚，這些生理生化特性與產(chǎn)氣莢膜梭菌一致，因此可認為這些細菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性菌株（圖1～圖3）。

圖1　產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC平板上生長形成典型黑色菌落

圖2　產(chǎn)氣莢膜梭菌在血平板上生長形成溶血環(huán)

圖3　牛乳爆裂發(fā)酵現(xiàn)象

毒素基因PCR結果表明，所有菌株均為產(chǎn)氣莢膜梭菌A型菌株，其中含netB基因1株，cpb2（Atypical）型40株，cpb2（Consensus）型1株（圖4～圖7）。

圖4　多重PCR結果

圖5　netB基因PCR結果

圖6　cpb2（Consensue）基因PCR結果

圖7　cpb2（Atypical）基因PCR結果

2.2藥敏實驗結果

藥敏結果（表3）顯示，57株雞源性產(chǎn)氣莢膜梭菌對多西環(huán)素、紅霉素、諾氟沙星、林可霉素和土霉素耐藥性嚴重；對頭孢氨芐有部分耐藥；對氨芐西林、青霉素較敏感，對氟苯尼考無耐藥性。

表3　57株雞源性產(chǎn)氣莢膜梭菌藥敏實驗結果

2.3梭菌的ERIC-PCR亞型分析結果

57株梭菌擴增出條帶范圍在100～2 000 bp之間，運用NTSYS 2.10e軟件進行聚類分析，根據(jù)相似性≧80%的菌株歸為一類，根據(jù)樹狀圖分析，將57個菌株分為13個不同亞型（圖8）。

3　結論與討論

通過對廣州市零售冷鮮雞肉中產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的調查發(fā)現(xiàn)，廣州市冷鮮雞肉中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離率為73.08%，這與土耳其雞肉產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率77%［9］、澳大利亞零售雞肉中產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率66%［10］相接近，說明國內(nèi)的零售雞肉中都存在產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染，且污染率與國外相近，意味著國內(nèi)冷鮮雞肉中產(chǎn)氣莢膜梭菌對公眾的健康威脅也與國外類似。

在分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌中，含cpb2基因比例為71.9%，其中的大部分為cpb2 （Atypical）型，cpb2（Consensus）只有1株，且cpb2（Atypical）和cpb2（Consensus）都是獨立存在的，這與國外cpb2基因的分離率51%相比，明顯要高，提示廣州市的零售冷鮮雞肉中的產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因型可能與國外有較大差別。最近研究顯示，cpb2基因與產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的人的相關性的疾病有關聯(lián)，而產(chǎn)氣莢膜梭菌冷鮮雞分離株的cpb2基因是否可以向感染人類的細菌傳播并導致相關疾?。恐档妹芮嘘P注。

圖8　A型梭菌的ERIC-PCR亞型分類樹狀

本次分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌中含有一株netB基因型的菌株，據(jù)國外研究顯示netB基因和雞壞死性腸炎的發(fā)生直接相關，但國內(nèi)還沒有類似報道，同時國內(nèi)產(chǎn)氣莢膜梭菌中netB基因的分離率很低，關于netB基因和雞壞死性腸炎發(fā)生的關系還需進一步驗證。

腸桿菌基因間重復序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Senquence，ERIC）是存在于腸道致病菌和多種細菌基因組中，具有極強的保守性。 Eric-PCR指紋圖譜已被廣泛用于細菌種、株的分型鑒定等［11］。ERIC-PCR結果顯示，57個產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株按相似性系數(shù)大于80%可分為13個亞型，若按相似性系數(shù)大于77%則可分為8個亞型，這提示冷鮮雞所受到外源性梭菌污染的種類較多，來源可能是養(yǎng)殖過程中雞腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌過度繁殖，也可能是在冷鮮雞的屠宰、加工、運輸、包裝過程中的發(fā)生的各種污染。本次試驗只是調查了鮮雞肉中梭菌的污染情況，沒有對養(yǎng)殖場等流程進行采樣分析，無法判斷產(chǎn)氣莢膜梭菌的來源，因此有必要進行進一步研究。

細菌的耐藥性問題一直是人們關注的焦點，特別是發(fā)現(xiàn)細菌的有些耐藥性質粒是可以通過某種方式向人類傳播之后。本試驗所用藥物中，只有氟苯尼考和恩諾沙星為畜禽專用藥物，而頭孢氨卞、克林霉素、諾氟沙星僅可用于人，其中諾氟沙星是最近禁止在畜禽使用的。從結果來看，氟苯尼考對產(chǎn)氣莢膜梭菌效果最好，其次是氨芐西林、青霉素、恩諾沙星和頭孢氨芐，產(chǎn)氣莢膜梭菌對其他幾種藥物的耐藥性已經(jīng)非常嚴重，包括僅用于人的克林霉素和諾氟沙星。值得關注的是，頭孢類藥物作為人專用藥物是禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用的，而本試驗中，產(chǎn)氣莢膜梭菌對頭孢的耐藥率達到31.58%，同樣僅可用于人的抗生素克林霉素的耐藥率更高達73.7%，這提示在選用治療人產(chǎn)氣莢膜梭菌相關感染的抗生素要特別注意，同時值得思考和進一步研究的是產(chǎn)氣莢膜梭菌獲得對這些藥物耐藥的途徑和機理，這對防控畜禽和人的梭菌性疾病具有重要指導意義。

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（責任編輯 白雪娜）

Potential hazards analysis of Clostridium perfringens and its toxins from cold fresh chicken

MA Zhuang1，2，PENG Xin-yu2，YE De-he1，GAO Biao2，YUAN Ming-gui2，YIN Ye-hua2，XU Zhi-hong2
（1.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2. Institute of Animal Health，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）

Retail cold fresh chicken samples were collected randomly from several Guangzhou supermarkets to investigate the hazards of Clostridium perfringens and its toxins from the chicken. Results showed that 57 isolates were isolated from 78 chicken samples，all isolates were C. perfringens type A. One of the isolates carried netB gene，40 isolates carried cpb2 Atypical gene，one isolate carried cpb2 consensus gene. Results of drug resistance test showed that most of the isolates were sensitive to florfenicol，ampicillin and penicillin. It was noteworthy that some isolates were resistant to clindamycin（73.68%） and cefalexin（31.58%），which could only be used in human being. Results of Eric-PCR showed that when similarity was 80%，these isolates could be classified into 13 subtypes，that implied the diversity of pollution sources cold fresh.

Chicken；Clostridium perfringens；toxin；drug sensitivity test；Eric-PCR

855.1

A

1004-874X（2016）08-0113-06

2016-04-10

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303040-16）；廣東省科學技術廳省級科研計劃（2013B 060400037，2014A020208133）；廣東省科學技術廳國際合作基地項目（2015B050501007）

馬壯（1989-），男，在讀碩士生，E-mail：1091650562@qq.com

葉得河（1962-），男，副教授，E-mail：gndydh@126.com